體沉淀。經1 %脫氧膽酸鈉和去離子水分別洗滌兩次后，將干凈的包涵體溶解于含8M尿素 的Tris-HCl(pH= 8. 5)緩沖液中充分溶解。在4°C條件下12000r/min離心30min，收集上 清液，經〇. 45μm濾膜過濾后以lml/min的流速上樣Ni-Sepharose?HP親和層析柱，上樣 結束并充分洗滌后，用咪唑梯度濃度（80、100、300、50()mm〇l/L)階段洗脫層析柱。收集包含 目的融合蛋白的洗脫峰，并采用尿素梯度（8 -0M)透析法復性融合蛋白。最后經分子篩凝 膠柱層析（SephacrylS-200)純化復性蛋白，收集洗脫峰，SDS-PAGE分析純化蛋白。結果 (如圖4B)顯示目的純化后的復性融合蛋白純度均大于95%。比較融合蛋白EPA，由于ETA 多以無生物活性的包涵體形式表達，在純化制備和生物活性等方面不及本發明公布的目標 融合蛋白EPA。
[0065] 實施例5:融合蛋白的免疫接種 用無菌生理鹽水配制融合蛋白溶液，與佐劑等體積混合后，皮下多點注射5~6周齡的C57BL/6雌性小鼠，一次接種量為100μL(含100μg的融合蛋白），共接種4次，兩次接種 之間間隔2周，并于首次接種前1周及每次接種后1周眼眶取血，分離血清，-20°C保存，供 抗體及其它生化檢測。
[0066] 實施例6:融合蛋白EPA可以誘導較強的體液免疫應答 1.融合蛋白誘導的抗體水平檢測 采用常規ELISA檢測免疫小鼠血清中抗Αβ42特異性抗體水平。具體地說，以人工合 成并鑒定正確的人Αβ42 (2μg/mL，100μL/孔）包被96孔酶標板，4°C過夜；用PBST(pH= 7. 4,0. 05%Tween-20)洗板三次，加入封閉液（含3%BSA的PBST)于37°C孵育lh;用PBST 洗滌三次后，將以封閉液適當稀釋的小鼠血清加入孔中，37°C作用lh;三次洗板后加入HPR標記的羊抗小鼠IgG于37°C孵育lh;用PBST和去離子水分別洗滌三次，加入TMB避光顯色， lmol/L氏304終止反應，于酶標儀檢測450nm吸光值0D450。同時，以商品化的小鼠抗Αβ115 單克隆抗體^ElO)為標準一抗，繪制"0D45。-抗體濃度"標準曲線，進而定量計算小鼠血清 中抗Αβ42特異性抗體的含量（μg/mL)。結果（如圖8)顯示融合蛋白EPA免疫組同Αβ42 免疫組一樣，可以誘導小鼠產生強烈的抗Αβ42體液免疫應答反應，隨著免疫次數的增加血 清中特異性抗體的水平穩步上升，在第四次免疫后達到34. 46μg/mL，顯著提高了Αβi15表 位的免疫原性（*P〈〇. 05)。相比較，ETA免疫組產生的抗Αβ42體液免疫應答相應顯著低于 本發明所公布的融合蛋白ΕΡΑ。
[0067] 2.融合蛋白ΕΡΑ誘導的抗體特異性鑒定 采用競爭ELISA檢測小鼠血清中抗體的特異性。簡單地說，將人工合成的Αβi15表位 多肽上述封閉液配制成梯度濃度（0-20μg/mL)溶液，并分別與融合蛋白四次免疫后的小 鼠血清重復混合，37°C溫育lh后加入到包被有Αβ42的96孔酶標板；隨后用HPR標記的羊 抗小鼠IgG為二抗、TMB-H2S04S顯色系統檢測Αβ1 15表位多肽對融合蛋白免疫血清與Αβ42 結合的競爭效力。結果（如圖9)顯示，隨著游離型Αβ115表位多肽含量的增加，融合蛋白 免疫血清與Αβ42抗原結合的能力不斷降低，呈現出顯著的"濃度-競爭效力"關系，表明融 合蛋白誘導產生的抗Αβ42抗體特異性的針對與功能表位Αβi15。
[0068] 實施例7:融合蛋白ΕΡΑ誘導的Th免疫反應檢測 同樣采用上述常規ELISA檢測小鼠血清中抗Αβ42特異性抗體的IgG亞類分布。特別 地，作為一抗加入的小鼠血清選用第4次免疫后1周收集樣本，二抗則分別加入HRP標記的 羊抗小鼠IgGl、IgG2ab、IgG2b和IgG3抗體，通過計算0D450比值比較各組小鼠血清中IgGl 亞類含量與IgG2a含量的比值（IgGl/IgG2ab)。結果（如圖10)顯示融合蛋白能夠誘導小鼠 產生的抗Αβ42抗體主要以IgGl的亞類形式存在，其IgGl/IgG2ab比值高達6. 045,較Αβ42 免疫組（IgGl/IgG2ab= 0. 707)有極顯著性提高（**ρ〈0. 01)。
[0069] 實施例8:融合蛋白ΕΡΑ誘導的抗體功能性研究 APP/PS1轉基因AD模型小鼠的腦切片被用于評價融合蛋白誘導產生的抗Αβ42抗體的 功能性。簡單來講，將AD模型小鼠大腦切片經90%甲酸和0. 5 %Η202預處理后分別與融合 蛋白免疫組血清、PBS免疫組血清（陰性對照）和Αβ42抗體6Ε10 (陽性對照）孵育，最后 經蘇木精染色后用顯微鏡觀察淀粉樣板塊染色情況。結果（如圖11)顯示，融合蛋白免疫 組小鼠血清與對照抗體（6Ε10) -樣能夠與AD模型小鼠腦內的重要病理特征一一老年斑特 異性結合，顯示出通過干預Αβ沉積途徑干預AD病程的應用可行性。
【主權項】
1. 一種用于制備Αβ多價表位疫苗的融合蛋白，其特征在于所述融合蛋白具有三個功 能片段：Ν-端的功能片段選自天門冬酰胺酶II片段，中部的功能片段以及C-端的功能片 段選自輔助性Τ細胞表位多肽片段和人Αβ的Β細胞表位片段中的一種，且中部的功能片 段和C-端的功能片段不相同，所述Ν-端的功能片段、中部的功能片段以及C-端的功能片 段可以直接相連或者通過連接肽相連，所述天門冬酰胺酶II片段包括但不限于大腸桿菌 來源的天門冬酰胺酶II;所述輔助性Τ細胞表位為人工設計的通用型HLA-DR結合多肽；所 述人Αβ的Β細胞表位片段為來源于β-淀粉樣蛋白肽Ν-端1-15氨基酸殘基組成的多肽 片段。2. 根據權利要求1所述的融合蛋白，其特征在于所述天門冬酰胺酶II片段的氨基酸序 列如SEQIDNO: 1所示，輔助性Τ細胞表位多肽片段的氨基酸序列如SEQIDNO: 2所示，所 述人Αβ的B細胞表位片段的氨基酸序列如SEQIDN0:3所示。3. 根據權利要求1所述的融合蛋白，其特征在于所述N-端的功能片段與中部的功能片 段直接相連，中部的功能片段與C-端的功能片段通過連接肽相連，所述連接肽氨基酸序列 如SEQIDNO:7 所示。4. 根據權利要求1所述的融合蛋白，其特征在于所述融合蛋白氨基酸序列如SEQID NO: 9所示。5. 編碼如權利要求1所述融合蛋白的基因，其特征在于具有編碼三個功能片段的基 因：編碼融合蛋白N-端的功能片段的基因選自天門冬酰胺酶II片段的基因，編碼中部的功 能片段以及C-端的功能片段的基因選自編碼輔助性T細胞表位多肽片段的基因和編碼人 Αβ的B細胞表位片段的基因中的一種，且編碼中部的功能片段以及C-端的功能片段的基 因不相同，編碼融合蛋白Ν-端的功能片段的基因、編碼中部的功能片段基因以及C-端點功 能片段的基因可以直接相連，也可以通過連接肽基因相連。6. 根據權利要求5所述的融合蛋白的基因，其特征在于所述編碼天門冬酰胺酶II片 段的基因序列如SEQIDΝ0:4所示，編碼輔助性Τ細胞表位多肽片段的基因序列如SEQID N0:5所示，編碼人Αβ的B細胞表位片段的基因如SEQIDNO:6所示。7. 根據權利要求6所述的融合蛋白的基因，其特征在于所述編碼融合蛋白N-端的功能 片段基因與編碼中部的功能片段基因直接相連，編碼中部的功能片段基因與編碼C-端的 功能片段的基因通過連接肽基因相連，所述連接肽基因序列如SEQIDΝ0:8所示。8. 編碼如權利要求4所述融合蛋白的基因，其特征在于所述核苷酸序列如SEQID NO: 10所示。9. 制備權利1-4任一項所述的融合蛋白的方法，其特征在于包括如下步驟： (1) 設計得到如權利要求5-8任一項所述的核苷酸序列； (2) 構建含如權利要求5-8任一項所述的核苷酸序列表達載體，并將表達載體轉化入 宿主細胞，形成可表達如權利要求1-4任一項所述的融合蛋白的重組細胞； (3) 培養步驟（2)重組細胞； (4) 分離純化得到如權利要求1-4任一項所述的融合蛋白。10. 根據權利要求1-4任一項所述的融合蛋白在制備預防或治療β-淀粉樣蛋白沉積 引起的疾病藥物中的應用。11. 一種藥物組合物，其特征在于含有根據權利要求1-4任一項所述的融合蛋白以及
【專利摘要】本發明公開了一種用于制備β-淀粉樣蛋白肽(Amyloidβ-peptide,Aβ)多價表位疫苗的融合蛋白，它具有三個功能結構域，由N-端的大腸桿菌天門冬酰胺酶II，中部的輔助性T細胞表位多肽，及C-端的Aβ功能B細胞表位多肽組成。基于本發明所提供的融合蛋白制備構建的Aβ多價表位疫苗可以誘導很強的針對Aβ的體液免疫應答反應和細胞免疫應答反應，并且能誘導免疫反應向Th2方向偏移，體現出比傳統抗原蛋白更好的有效性和安全性，為基于Aβ的阿爾茨海默病預防與治療奠定基礎。
【IPC分類】C12N9/82, C12N15/62, A61K39/00, A61P25/28, C07K19/00, C12N15/70, A61K39/385
【公開號】CN105418767
【申請號】CN201510967972
【發明人】林潔, 吳潔, 楊艷, 曹榮月, 沈飛, 彭顏梅
【申請人】云南大學
【公開日】2016年3月23日
【申請日】2015年12月22日