一種口服過敏原疫苗及其制備和應用的制作方法
【專利摘要】本發明提供一種口服過敏原疫苗及其制備和應用，該疫苗以復制缺陷型腺病毒為載體，同時包含免疫調節因子IL-10和變應原基因，二者融合表達。該疫苗可用于預防和治療蛋白質過敏原導致的過敏性疾病。
【專利說明】一種口服過敏原疫苗及其制備和應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及新型疫苗發明領域，具體地說是一種以腺病毒為載體的過敏原疫苗及其制備和使用方法，特別涉及共同表達IL-10與蛋白質過敏原的口服腺病毒載體疫苗。
【背景技術】
[0002]過敏性疾病如變應性鼻炎、過敏性哮喘、食物藥物過敏等是困擾人們生活工作的常見健康問題，過敏性休克更是威脅生命的殺手。世界過敏組織(WAO)在世界首個過敏性疾病日公布了對30個國家進行的過敏性疾病流行病學調查結果:在這些國家的總人口中，22%患有IgE介導的過敏性疾病，包括過敏性鼻炎、哮喘、結膜炎、濕疹、食物過敏、藥物過敏和過敏性休克等。據世界衛生組織(WHO)估計，全球約I億5千萬人患有哮喘，其中50%以上的成人及至少80%的兒童患者由過敏因素誘發，每年有18萬余人死于哮喘。我國目前尚缺乏全國性的過敏性疾病的流行病學資料，但從各地區已報道的情況看，過敏性哮喘、過敏性鼻炎以及食物過敏等的發病率及患病率是明顯上升的，過敏性疾病正在成為新世紀的流行病。
[0003]過敏性疾病的發生，主要是由于在遺傳因素和環境因素的共同作用下，特應質個體的免疫系統對外來的無害抗原發生了反應，從而引起相應的臨床癥狀，包括:過敏性鼻炎、過敏性哮喘、特應性皮炎、蕁麻疹，以及表現為多個系統受累的嚴重過敏反應等。引起特異性過敏反應的物質，稱為過敏原。塵螨、霉菌、花粉、食物、動物皮屑或分泌物、昆蟲、橡膠等是較為常見的過敏原來源，其中引起過敏反應的成分，多數為蛋白質。
[0004]目前對于過敏性疾病的預防，除了被動地避免接觸過敏原，尚缺乏非常有效的主動干預措施。抗組胺藥、白三烯受體拮抗劑及糖皮質激素等在治療上均只能暫時抑制炎癥介質及炎癥細胞以控制過敏癥狀。針對過敏原的特異性免疫治療(specificimmunotherapy，簡稱SIT)是目前唯一針對病因的長期有效的治療手段。自1911年Noon等首次發表利用花粉過敏原提取液皮下注射進行脫敏治療的研究，迄今SIT已有100余年歷史。常規SIT方案為:在3-5年的治療周期內，每周2次，由低濃度到高濃度向機體注射過敏原，達到治療劑量后，維持該劑量持續治療，直至達到理想效果；SIT目的是要逐步誘導機體免疫系統產生對特異過敏原的耐受，其核心步驟是誘導外周T細胞耐受的狀態，而外周T細胞耐受的建立以過敏原特異的調節性T細胞(Treg細胞)產生為特征。
[0005]盡管目前SIT是唯一的針對過敏性疾病病因的治療方法，但卻存在如下不足:1)療程長:通常在開始治療后半年到I年左右時間開始起效，而總療程需要3-5年，才可以達到比較理想的治療效果；2)每周一到兩次的注射，總共需要注射上百次；3)存在一定風險:治療過程中可能會誘發嚴重反應；4)給藥不便:傳統的SIT為皮下注射，每次均需到醫療機構進行注射；5)目前用于SIT的過敏原主要來自于天然提取物，這些提取物由多種致敏和不致敏的化合物共同組成，成分復雜，難以標準化，且提取過程有引入新的致敏物質的風險。以舌下含服替代皮下注射的免疫治療方法，給藥方便，安全性及依從性較好，但其臨床效果存在很大爭議，2005年伯明翰大學醫院Wilson等人總結分析了已發表的64個采用舌下免疫治療的臨床研究的結果，發現其有效性只有皮下注射的一半左右，而且療程和給藥頻率與皮下注射相比并未減少。
[0006]近來，一種顯著減少給藥次數的短療程方法受到關注，那就是淋巴結內直接注射過敏原。該方法在動物實驗中取得了滿意的效果，一項165名過敏原患者參與的臨床試驗也表明，兩月內進行三次腹股溝淋巴結內過敏原注射，在減輕臨床癥狀方面的效果與三年的標準SIT相當；然而對超聲定位儀器、相關專業人員的依賴以及穿刺本身的風險性，使其仍然不能成為理想的免疫治療手段。

【發明內容】

[0007] 鑒于上述不足，本發明人提出了一種新的口服過敏原疫苗:以腺病毒為載體，同時表達IL-10基因與過敏原基因。優選的，所述腺病毒載體為具有感染活力但不致病的復制缺陷型腺病毒載體。使用該腺病毒載體制備的口服過敏原疫苗通過一次給藥，能有效的預防和治療蛋白質過敏原所致的過敏。
[0008]依據本發明的第一方面，提供一種口服過敏原疫苗，其特征在于:所述口服過敏原疫苗以腺病毒為載體，所述腺病毒載體同時表達IL-10基因與過敏原基因。
[0009]腺病毒載體中的過敏原基因為具有致敏活性的蛋白質過敏原基因，且所述過敏原基因在宿主細胞中作為重組蛋白質表達。
[0010]本發明涉及的過敏原包括在//www.allergen, org/下可獲得的所有主要蛋白質過敏原。根據本發明，優選的過敏原包括雞蛋過敏原0VA，戶塵螨過敏原Der pl，粉塵螨過敏原Der fl,樺樹花粉過敏Bet vl,蒿屬花粉過敏原Art vl和Art v3等。優選地,所涉及的蛋白質過敏原為卵清蛋白(Ovalbumin,簡稱0VA)。
[0011]更為優選地，IL - 10與蛋白質過敏原OVA基因進行融合表達，融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.3所示。
[0012]依據本發明的第二方面，提供一種口服過敏原疫苗的制備方法，其特征在于:采用腺病毒系統，將過敏原卵清蛋白基因及IL-10基因分別克隆入同一腺病毒穿梭質粒的多克隆區，構建重組穿梭質粒，將重組穿梭質粒與骨架質粒共轉化宿主細胞，經同源重組生成重組腺病毒質粒，經限制性內切酶酶切純化后轉染包裝細胞包裝獲得具有感染活力的腺病毒顆粒，在包裝細胞中進行擴增，裂解包裝細胞后，純化得到重組腺病毒載體；以所得到的重組腺病毒載體制備口服過敏原疫苗。
[0013]優選地，采用AdEasy腺病毒系統，將過敏原卵清蛋白基因及IL-10基因分別克隆入同一穿梭質粒pAdTrack-CMV的多克隆區,構建重組穿梭質粒pAdTrack-1L-10_0VA,將重組穿梭質粒與骨架質粒pAdEasy-Ι共轉化大腸桿菌BJ5183，經同源重組生成重組腺病毒質粒，經限制性內切酶Pac I酶切純化后轉染包裝細胞系293細胞包裝獲得具有感染活力的腺病毒顆粒，在293細胞中進行擴增，裂解293細胞后，CsCl梯度離心純化得到重組腺病毒載體；以所得到的重組腺病毒載體制備口服過敏原疫苗。
[0014]更優選的，收獲裂解的293細胞經氯化銫(CsCl)梯度離心純化濃縮得到滴度在IO10Pfu/毫升左右的重組腺病毒載體。
[0015]依據本發明另一方面，提供一種組合物，其主要成分為上述口服過敏原疫苗。
[0016]依據本發明的再一方面，提供一種上述疫苗或組合物在制備治療過敏性疾病藥物中的應用。
[0017]優選地，所述過敏性疾病為塵螨、霉菌、花粉、動物皮屑或分泌物、昆蟲、食物等的過敏原所致的過敏性鼻炎、過敏性哮喘、過敏性結膜炎、蕁麻疹、特應性皮炎、蕁麻疹或嚴重過敏反應等。
[0018]本發明的提供的腺病毒載體疫苗不僅可用于只對一種過敏原具有過敏反應的患者。依據本發明提供的方法生產的表達不同過敏原的腺病毒載體疫苗，可以組合使用，尤其適用于同時對多種蛋白類物質過敏的患者。
[0019]本發明首次在同一載體上同時表達免疫耐受誘導因子和過敏原基因用于預防和治療過敏性疾病。實驗證明本發明的重組腺病毒疫苗(優選口服)對于預防和治療過敏性疾病有明顯的效果。本發明為過敏性疾病的預防和治療提供了一種方便、安全、有效的新方法，具有良好的應用前景。
[0020]本發明的優勢在于:[0021]1、疫苗安全性:以復制缺陷型重組腺病毒為載體疫苗，病毒不會復制，不會整合到基因組，不存在引發癌變的風險。
[0022]2、給藥方式的簡便性:口服給藥，依從性高。
[0023]3、給藥次數少:由于腺病毒能夠在腸粘膜定植存活較長時間，相應地其攜帶的目的基因亦可穩定表達較長時間，并且由于其表達效率高，一次或少數幾次給藥(優選一次)即可達到長期的效果。
[0024]4、適用人群廣:現有免疫治療方法，尤其是皮下注射免疫治療，只適用于年長兒童和成人，本發明的腺病毒口服疫苗有望用于嬰幼兒，解決因多種重要營養物質如雞蛋、牛奶等過敏需避食而帶來的營養缺乏問題。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0025]圖1為穿梭質粒的結構示意圖，穿梭質粒pAdTrack-CMV多克隆區域前方攜帶高效啟動子-CMV，可直接啟動多克隆區域目的基因的表達。pAdTrack-CMV攜帶有卡那霉素抗性基因(箭頭kan)，便于后續使用含卡那霉素的培養基進行篩選。pAdTrack-CMV含有兩段與腺病毒骨架質粒同源的序列(位于Pme I酶切位點的兩側，見示意圖下方區域)，經限制性內切酶Pme I酶切線性化后，在重組酶存在的情況下，可與腺病毒骨架質粒發生同源重組。
[0026]圖2為腺病毒骨架質粒的結構示意圖，腺病毒骨架質粒pAdEasy-Ι，攜帶腺病毒全基因組除El區和E3區基因以外的序列，其中El區基因與腺病毒復制密切相關，所以通過穿梭質粒和骨架質粒同源重組獲得的腺病毒載體由于El區基因缺失，為復制缺陷型的，使用安全性高。腺病毒包裝細胞人胚腎293細胞可以提供El基因表達產物，因此腺病毒載體轉染293細胞后可在其內包裝成為成熟的具有感染活力的腺病毒顆粒，并且再次感染293細胞后，可在293細胞內復制以達到擴增的目的。
[0027]圖3為重組腺病毒構建及包裝的流程示意圖，穿梭質粒中的目的基因為IL-10(hIL-ΙΟ或mIL-10)基因去除終止密碼子后，與OVA基因融合構成。具體過程如下:IL_10基因及過敏原OVA基因依次分別克隆入同一穿梭質粒pAdTrack-CMV的多克隆區，構建重組穿梭質粒pAdTrack-1L-lO-OVA，將該重組穿梭質粒經經限制性內切酶Pme I線性化后與骨架質粒pAdEasy-Ι共轉化大腸桿菌BJ5183，經同源重組生成重組腺病毒質粒，經限制性內切酶Pac I酶切，酶切產物純化后借助脂質體轉染包裝細胞系293細胞，包裝獲得具有感染活力的重組腺病毒顆粒。該腺病毒顆粒僅能在提供腺病毒El基因產物的宿主細胞(如293細胞)內復制擴增。
[0028]圖4為穿梭質粒pAdTrack-CMV經限制性內切酶Sal I和Xho I雙酶切后，線性化產物的瓊脂糖電泳示意圖。泳道從左到右依次為:1為經雙酶切線性化的pAdTrack-CMV ；2為 ADNA/Hind III Marker。
[0029]圖5為PCR鑒定重組穿梭質粒陽性克隆pAdTrack-hIL-ΙΟ的瓊脂糖電泳示意圖。泳道從左到右依次為:1為陽性克隆I的PCR產物I ;2為陽性克隆2的PCR產物；3為D2000DNA Marker0
[0030]圖6為OVA基因的PCR擴增產物的瓊脂糖電泳示意圖。泳道從左到右，I為OVA基因的 PCR 產物；2 為 D2000DNA Marker。
[0031]圖7為重組腺病毒質粒pAd-hIL-10-0VA的瓊脂糖電泳示意圖。泳道從左到右，I為λ DNA/Hind III Marker ；2為陽性克隆I提取質粒；3為陽性克隆2提取質粒。
[0032]圖8為重組腺病毒質粒pAd-hIL-10-0VA經Pac I酶切后，酶切產物的瓊脂糖電泳示意圖。泳道從左到右:l_Pac I酶切后的pAd-hIL-10-0VA，2-未酶切的pAd-hIL-10-0VA，3-λDNA/Hind III Marker。
[0033]圖9-1至圖9-8為重組腺病毒在293細胞內包裝成熟的過程示意圖。經限制性內切酶Pac I線性化后的重組腺病毒質粒pAd-hIL-10-0VA在借助脂質體轉染293細胞，圖9-1:轉染后17小時(光鏡，20X)，細胞形態無明顯改變；圖9-2:轉染后17小時(熒光顯微鏡，20X)，可見到少許熒·光；圖9-3:轉染后40小時(熒光顯微鏡，20X)，熒光明顯增多；圖9-4:轉染后4天(熒光顯微鏡，20X),熒光進一步增多，部分細胞變大變圓，有融合現象；圖9-5:轉染后5天(熒光顯微鏡，20X)，大部分細胞表達熒光，出現大量合胞體；圖9-6:轉染后6天(熒光顯微鏡，20X)，所有細胞均表達綠色熒光；圖9-7:轉染后7天(熒光顯微鏡，20X)，細胞變圓，聚集，大部分脫離瓶底；圖9-8:病毒收獲前(光鏡，40X)，293細胞出現典型的病變效應。
[0034]圖10為ELISA法檢測重組腺病毒AchhIL-1O-OVA和對照腺病毒感染的293細胞以及未感染病毒的293細胞培養液上清中hIL-10蛋白表達水平的示意圖。從左到右依次為:no Ad (未感染病毒，空白對照)，Ad-contool (不含目的基因的腺病毒，陰性對照)，Ad-1L-1O-OVA (含融合基因hIL-10/0VA的重組腺病毒)
[0035]圖11為免疫印記法檢測重組腺病毒Ad-hIL-10-0VA和對照腺病毒感染的293細胞的培養液上清中OVA蛋白表達的示意圖。從左到右依次為:Ad-contiOl (不含目的基因的腺病毒，做陰性對照)，Ad-1L-1O-OVA (含hIL-10/0VA融合基因的腺病毒)
[0036]圖12為該疫苗對過敏反應的預防作用研究中小鼠氣道敏感性檢測示意圖。no Ad:未使用腺病毒疫苗，作空白對照；Ad-COntix)l:使用不含目的基因的腺病毒，作陰性對照；Ad-1L-1O-OVA:使用含mIL-10/0VA融合基因的重組腺病毒。
[0037]圖13為該疫苗對過敏反應的預防作用研究中小鼠血清OVA特異性IgE檢測示意圖。no Ad:未使用腺病毒疫苗,作空白對照；Ad-control:使用不含目的基因的空腺病毒，作陰性對照；Ad-1L-10-0VA:使用含mIL-10/0VA融合基因的重組腺病毒。
[0038]圖14為該疫苗對過敏反應的治療作用研究中小鼠氣道敏感性檢測示意圖。noAd:未使用腺病毒疫苗，作空白對照；Ad-COntix)l:使用不含目的基因的空腺病毒，作陰性對照；Ad-1L-10-0VA:使用含mIL-10/0VA融合基因的重組腺病毒。
[0039]圖15為該疫苗對過敏反應的治療作用研究中小鼠支氣管淋巴結T細胞經OVA刺激后分泌IL-4水平示意圖。no Ad:未使用腺病毒疫苗，作空白對照；Ad-control:使用不含目的基因的腺病毒，作陰性對照；Ad-1L-10-0VA:使用含mIL-10/0VA融合基因的重組腺病毒。
[0040]圖16為該疫苗對過敏反應的治療作用研究中小鼠支氣管肺泡灌洗液細胞組成分析示意圖。no Ad:未使用腺病毒疫苗,作空白對照；Ad-control:使用不含目的基因的腺病毒，作陰性對照；Ad-1L-10-0VA:使用含mIL-10/0VA融合基因的重組腺病毒。
【具體實施方式】
[0041] 下列實施例以雞蛋過敏原-卵清蛋白(OVA)為例說明本發明的原理，但不限制本發明。基于本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發明保護的范圍。實施例中未注明具體條件的實驗方法，按照通用的常規技術，或參照有關制造廠商建議的要求。
[0042]實施例1:hIL_10基因插入穿梭質粒,構建重組穿梭質粒pAdTrack-hIL-10
[0043]1、卩0?擴增1111^-10基因
[0044]( I)健康人外周血單個核細胞分離
[0045]取健康人外周靜脈血10毫升，肝素鈉抗凝，加入等體積0.9%氯化鈉稀釋抗凝后的血液。然后取10毫升4°C避光保存的淋巴細胞分離液加入一無菌離心管管底，并將其升溫至室溫。用巴斯德吸管吸取20毫升稀釋后的血液樣品，沿管壁緩慢鋪到淋巴細胞分離液上面，盡量避免打亂液層界面。水平轉子在室溫條件下，以2000轉/分的轉速離心，20分鐘。離心結束后，可見離心管中液體分為三層，管底是紅細胞，中間層是分離液，最上層是血漿。血漿層與分離液之間一薄層較致密的白膜，含單個核細胞(包括淋巴細胞和單核細胞)，將吸管直接插入到單個核細胞層并吸取該層，放入另一無菌試管中。在放有吸出的單個核細胞的試管中，加入約10毫升0.9%的氯化鈉溶液，輕輕洗滌細胞，以250g離心力在室溫條件下離心10分鐘,棄上清,重復洗滌1-2次，除去血小板和抗凝物質。最后用RPMI1640培養基將單個核細胞稀釋備用。上述操作步驟均需在無菌條件下進行。
[0046](2)外周血單個核細胞刺激活化
[0047]將上述分離獲得的單個核細胞轉移到培養瓶中放入細胞培養箱中培養4小時后向培養基中加入脂多糖(LPS)進行刺激培養。培養箱內溫度37.50C，二氧化碳濃度5%。
[0048](3)外周血活化單個核細胞總RNA提取
[0049]將經過LPS刺激活化后的外周血單個核細胞，轉移到離心管中，以350g離心力在室溫條件下離心5分鐘，棄去上清，加入0.9%氯化鈉10毫升輕輕洗滌細胞，以350g離心力在室溫條件下離心5分鐘，棄盡上清。加入I毫升Trizol，混勻，室溫靜置5分鐘。加入
0.2毫升氯仿,振蕩15秒,靜置2分鐘。4°C尚心，12000gX 15分鐘,取上清。加入0.5毫升異丙醇，將管中液體輕輕混勻，室溫靜置10分鐘。
[0050]4°C離心，12000gX10分鐘，棄上清。加入I毫升75%乙醇，輕輕洗滌沉淀。4°C，7500gX5分鐘，棄上清。晾干，加入適量的DEPC水溶解。紫外分光光度儀測量0D260/0D280=1.9，純度可，可繼續用于下一步合成cDNA。注意:本步驟以及下一步cDNA合成步驟所使用的離心管、槍頭均經過0.1%的DEPC溶液過夜浸泡后，高壓滅菌處理，目的是盡量去除RNA酶，避免提取過程中RNA降解。
[0051](4)逆轉錄獲取cDNA
[0052]在一 EP管中加入新提的RNA約5微升(約I微克)，oligo (T) I微升(約0.5微克)，70°C孵育5分鐘后置冰上；然后將上述混合物轉移至逆轉錄反應管(賽百盛Easy-go?RT PreMix試劑盒提供，其內含RNA和引物之外的cDNA合成所需的所有成分)，渦旋混勻，短暫離心；接著在42°C條件下，反應60分鐘；最后在94°C條件下反應5分鐘。
[0053](5)?0?擴增1111^-10基因
[0054]根據GENBANK 提供的 hIL-ΙΟ 基因 mRNA 序列(GENEBANK 號:NM_000572)，去除終止密碼子，設計合成擴增引物，其中上游引物包含限制性內切酶Sal I的酶切位點和下游引物包含限制性內切酶Xho I的酶切位點(酶切位點以下劃線標示)。
[0055]擴增引物如下:
[0056]h游引物:5’ -AGAGTCGACATGCACAGCTCAGCAC-3’ (SEQ ID N0.6)
[0057]下游引物:5’-GCCGCTCGAGGTTTCGTATCTTCAT-3’ (SEQ ID N0.7)
[0058]PCR反應體系:dNTP4微升，上游引物I微升，下游引物I微升，cDNA2微升，DNA聚合酶I微升，DNA聚合酶緩 沖液5微升，去離子水36微升，總體積50微升。反應條件為:首先95°C預變性5分鐘；然后進行熱循環，熱循環條件:95°C變性30秒，67°C退火30秒，72°C延伸I分鐘，計35個循環；最后72°C延伸10分鐘。PCR結束后，送DNA測序，測序結果證實，擴增得到的DNA序列為hIL-ΙΟ基因的編碼片段如SEQ ID N0.1所示。
[0059]2.hIL-ΙΟ基因PCR產物純化
[0060]將PCR產物50微升與無水乙醇100微升充分混勻，在4°C條件下以12000轉/分的轉速離心15分鐘；去除上清，加入70%酒精洗滌沉淀，在4°C條件下以12000轉/分的轉速離心15分鐘；去除上清，加入70%酒精重復洗滌I次；去除上清，吸盡附壁水珠，加入25微升滅菌超純水溶解沉淀。
[0061]3.限制性內切酶Sal I和Xho I雙酶切PCR產物和穿梭質粒pAdTrack — CMV
[0062]酶切反應體系分別如下:(1)純化后PCR產物25微升，酶切緩沖液5微升，SalI 1.5 微升，Xho I1.5 微升，ddH2017 微升，總體積 50 微升；(2) pAdTrack — CMV25 微升，酶切緩沖液5微升，Sal I 1.5微升，Xho I1.5微升，ddH2017微升，總體積50微升。
[0063]酶切反應條件:37°C，2小時。反應結束后，瓊脂糖凝膠電泳鑒定穿梭質粒pAdTrack 一 CMV的雙酶切線性化效果，結果見附圖4。
[0064]4.酶切產物純化(根據上海華舜膠回收試劑盒提供的直接純化步驟進行)
[0065]向雙酶切產物中加入3倍體積SI液(試劑盒提供)和I倍體積的異丙醇，混勻后加入離心柱中；室溫條件下以9200轉/分的轉速離心15秒；棄收集管中廢液，加入500微升70%酒精，室溫條件下以9200轉/分的轉速離心15秒；棄收集管中廢液，加入500微升70%酒精，靜置I分鐘，室溫條件下以9200轉/分的轉速離心15秒；空柱室溫條件下以9200轉/分的轉速離心I分鐘；將吸附柱放入一干凈EP管，向吸附柱的膜中央滴加20微升滅菌超純水，室溫條件下以9200轉/分的轉速離心I分鐘。EP管中收集液體即為純化后的酶切產物。注:hIL-10基因的PCR產物和穿梭質粒pAdTrack — CMV的雙酶切產物的純化步驟相同，均如上所述。
[0066]5.酶切產物連接
[0067]純化后的酶切產物在DNA連接酶作用下，16°C過夜連接。
[0068]6.DH5 α感受態制備
[0069]從培養DH5 α的LB細菌培養平板上挑取單克隆菌落，加入已盛25毫升LB液體培養基的250毫升的燒瓶中，37°C條件下，搖床振搖4小時，速度300轉/分；待LB培養基變得明顯渾濁，將燒瓶從搖床取出，放入冰盒，冰浴30分鐘；冰浴結束后將菌液轉入50毫升塑料離心管，4°C條件下以3900轉/分的轉速離心30分鐘；
[0070]離心結束后，棄去上清，加入5毫升冰預冷的氯化鈣，吹打重懸菌體；重懸后的菌液再次放入冰盒中冰浴30分鐘；冰浴結束后，將菌液在4°C條件下，以3900轉/分的轉速離心30分鐘；離心結束后，棄去上清，加入I毫升冰預冷的氯化鈣，吹打重懸菌體；重懸后的菌液以50微升/管分裝，取三管放入4°C冰箱備用，余下_70°C保存。
[0071]7.連接產物轉化
[0072]將上一步制備的感受態DH5 α放入冰盒中冰浴10分鐘；然后加入5微升連接產物，混勻后放入冰盒中冰浴30分鐘；冰浴結束后，立即放入42°C的水浴箱中，熱激90秒；而后再冰浴2分鐘；冰浴結束后加入200微升37°C預熱的LB液體培養基，放入搖床，37°C條件下振搖45分鐘，速度180轉/分；振搖結束后，將菌液平鋪至含50微克/毫升的卡那霉素的LB固體培養基平板(卡那抗性平板)上，放入37°C細菌培養箱，過夜培養。
[0073]8.重組陽性質粒初篩(酚/氯仿一步法抽提質粒后瓊脂糖凝膠電泳)
[0074]次晨觀察LB固體培養基平板，散在分布少量菌落。以無菌牙簽從平板上挑取數個單克隆菌落，加入裝有25毫升LB液體培養基的燒瓶，放入搖床，37°C條件下，以250轉/分的振搖速度，過夜培養；次日取500微升菌液裝入EP管，室溫條件下，以12000轉/分的速度離心I分鐘；去盡上清，加入70微升等體積混合的酚/氯仿，吹打震蕩，重懸菌體；室溫條件下12000轉/分的速度離心10分鐘；取上清以I %瓊脂糖凝膠電泳篩選可能陽性質粒。
[0075]9.質粒提取(按照omega質粒小抽試劑盒說明進行操作)
[0076]根據上一步初篩結果，挑選2份可能含陽性重組質粒的菌液分別裝入1.5毫升的EP管，按照試劑盒說明書提取質粒。
[0077]10.PCR鑒定提取的重組穿梭質粒pAdTrack-hIL-ΙΟ
[0078]以提取的質粒I和2為模板，采用之前以外周血cDNA為模板擴增hIL_10基因的引物和反應條件進行PCR，反應產物經瓊脂糖電泳鑒定，結果如附圖5。
[0079]實施例2:0VA某閔插入穿檢質粒，構律重纟目穿檢質粒DAdTrack-hIL-10-0VA
[0080]1、PCR 擴增 OVA 基因
[0081]首先用TRIzoI試劑法提取雞輸卵管上皮細胞的總RNA，以Oligo dT (寡聚T)為引物反轉錄合成cDNA，根據OVA基因序列(GenBank登錄號AY223553.1)，利用PrimerPremier5軟件設計引物，其中包括上游Xho I和下游Xba I酶切位點(下劃線標示)，引物序列由上海生工合成。
[0082]擴增引物如下:
[0083]h游引物:5’ TACCTCGAGATGGGCTCCATCGGTG3’ (SEQ ID N0.8)
[0084]下游引物:5’GCGCTCTAGATTAAGGGGAAACACA3’ (SEQ ID N0.9)[0085]首先95°C預變性5分鐘；隨后進行熱循環，反應條件為:95°C變性30秒，60°C退火30秒，72°C延伸I分鐘，計35個循環；最后72°C延伸10分鐘。PCR結束后，I %瓊脂糖凝膠電泳觀察產物生成情況，結果見附圖6。
[0086] 2、OVA的PCR產物經無水乙醇純化
[0087]將OVA的PCR產物50微升與無水乙醇100微升充分混勻，在4°C條件下以12000轉/分的轉速離心15分鐘；去除上清，加入70%酒精洗滌沉淀，在4°C條件下以12000轉/分的轉速離心15分鐘；去除上清，加入70%酒精重復洗滌I次；去除上清，吸盡附壁水珠，加入25微升滅菌超純水溶解沉淀。
[0088]3、OVA 的 PCR 產物和 pAdTrack — hIL-ΙΟ 雙酶切
[0089]酶切體系分別如下:(1)PCR產物25微升，酶切緩沖液5微升，Xba I1.5微升，Xho
I1.5微升，去離子水17微升，去離子水17微升，總體積50微升；(2)pAdTrack — hIL-1025微升，酶切緩沖液5微升，Xba I 1.5微升，Xho I1.5微升，去離子水17微升，總體積50微升。
[0090]4、酶切產物純化
[0091]步驟同實施例1中所述酶切產物純化方法。
[0092]5、連接
[0093]純化后的酶切產物在DNA連接酶作用下，16°C過夜連接。
[0094]6、DH5a感受態制備
[0095]步驟同實施例1中所述DH5a感受態制備方法。
[0096]7、轉化
[0097]步驟同實施例1中所述轉化方法。
[0098]8、重組陽性質粒初篩(酹/氯仿一步法抽提質粒后瓊脂糖凝膠電泳)
[0099]步驟同實施例1中所述重組質粒初篩方法。
[0100]9、陽性重組質粒提取
[0101]按照上一步初篩結果，選擇最有可能陽性的兩份含質粒的菌液，利用Omega質粒小抽試劑盒進行質粒提取。0.8%瓊脂糖凝膠電泳觀察提取質粒，結果見附圖7。
[0102]10、測序鑒定
[0103]提取陽性重組質粒送DNA測序鑒定，結果顯示多克隆區域插入序列為hIL-ΙΟ和OVA的融合表達序列，如SEQ ID N0.2所示，其編碼的氨基酸序列如SEQ ID N0.3所示。經鑒定后的重組穿梭質粒命名為pAdTrack-hIL-10-0VA。
[0104]實施例3:重組腺病毒質粒的構建(細菌內同源重組法)
[0105]將線性化的重組穿梭質粒pAdTrack-hIL-10-0VA (卡那霉素抗性)與腺病毒骨架質粒pAdEasy-Ι (氨節青霉素抗性)共轉化BJ5183菌進行同源重組,含卡那霉素培養基進行篩選，瓊脂糖電泳酶切鑒定和PCR鑒定，鑒定正確的重組質粒命名為pAd-hIL-10-0VA。
[0106]1、BJ5183轉化用感受態的制備
[0107]步驟同上述DH5a感受態制備方法，不同的是培養基中含30微克/毫升鏈霉素，以抑制其他細菌生長。
[0108]2、同源重組
[0109]以Omega質粒小抽試劑盒提取pAdTrack-hlL-lO-OVA質粒，經限制性內切酶PmeI進行酶切使其線性化；將酶切產物用上海華舜膠回收試劑盒進行純化；純化后的酶切產物(約500納克)和與pAdEasy-Ι質粒(約100納克)同時加入50微升感受態BJ5183細菌中混勻，氯化鈣法進行轉化，具體操作與前面DH5a所述轉化步驟相同。轉化結束后，菌液涂于含50微克/毫升卡那霉素和30微克/毫升鏈霉素的LB細菌培養基平板，置37°C孵箱內，過夜培養。
[0110]3.重組腺病毒質粒的提取和鑒定
[0111]由于腺病毒骨架質粒PAdEasy-1只具有氨芐青霉素(amp)抗性，所以只有含有重組成功的腺病毒質粒(從穿梭質粒獲得卡那霉素抗性)的細菌方能在含有卡那霉素的篩選培養基上生長；用無菌牙簽挑取平板上的陽性克隆于含有50微克/毫升卡那霉素的LB中振搖過夜，Omega質粒小抽試劑盒提取質粒，以Pac I進行酶切。
[0112]酶切產物經瓊脂糖凝膠電泳，結果如附圖8所示，表明重組腺病毒質粒pAd-hIL-10-0VA 構建成功。
[0113]4.將pAd-hIL-10-0VA質粒轉入大腸桿菌DH5a
[0114]由于重組腺病毒質粒在BJ5183菌中拷貝數較低，故需轉入質粒拷貝數較高的DH5a細菌中。轉化步驟與前面所述DH5a轉化相同。
[0115]實施例4.腺病毒包裝及收獲
[0116]1、293細胞培養
[0117]293細胞常規培養于含10%的胎牛血清，IOOu/毫升青霉素，IOOu/毫升的鏈霉素的RPMI1640培養液中，培養條件為37.5°C，CO2濃度為5%，根據細胞生長情況，每2 — 3天用0.25%的胰酶消化后進行傳代培養。
[0118]2、在293細胞內生成腺病毒
[0119]將pAd-hIL-10_0VA4微克用Pac I酶切使之線性化，用膠回收試劑盒純化，應用Invitrogen公司的Lipofectamine?2000轉染試劑轉染293細胞。在293細胞內包裝成為成熟的腺病毒顆粒(Ad-h IL-10-OVA )。
[0120](I)轉染293細胞轉染
[0121]將293細胞接種于25毫升培養瓶中，于5 % CO2孵箱中，無抗生素培養至約有60%的細胞匯合；以Pac I酶切pAdV-hIL-10-0VA質粒，膠回收試劑盒純化；將10微升Lipofectamine2000和4微克Pa c I酶切線性化的質粒分別用500微升無血清RPMI1640培養基稀釋，混勻，室溫孵育5分鐘，接著將稀釋后的LipofectamineTM2000與質粒輕輕混勻，于室溫孵育20分鐘后加入293細胞培養瓶內，輕輕晃動培養瓶使其分布均勻，隨后將培養瓶放回細胞培養箱內繼續培養5個小時；然后吸出含LipOfectamineTM2000與腺病毒質粒混合物的培養基，加入3毫升新的RPMII1640 (含10%FBS)培養基，繼續培養。
[0122](2)腺病毒生成的觀察
[0123]由于重組腺病毒在細胞內可以表達綠色熒光蛋白(GFP)，因此可以通過在熒光顯微鏡下觀測熒光來觀察腺病毒生成情況。于轉染17小時后，即可在熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光。隨后數天內，熒光逐漸增多，細胞變圓，融合，形成典型病變效應，過程示意圖見附圖9。
[0124](3)腺病毒收集
[0125]腺病毒質粒轉染293細胞后第7天，293細胞出現明顯病變效應，大部分細胞漂浮，聚集呈葡萄串樣改變，輕輕晃動培養瓶使剩余貼壁細胞從培養瓶壁分離；將細胞和培養基一并轉移入離心管中，以800轉/分的轉速在室溫條件下離心5分鐘，沉淀細胞，將上層培養基轉入另一離心管，管底保留約2毫升培養基重懸細胞，盛于EP管中。
[0126]3)將細胞懸液放一 80°C冷凍，再將其投入37°C水浴快速震蕩融化。
[0127]4)重復3次步驟3)。
[0128]5) 12000轉/分離心I分鐘，沉淀細胞碎片，上清即為病毒懸液，0.22ul微孔濾膜過濾除菌，貯存于_20°C。收獲的重組腺病毒命名為Ad-hIL-10-0VA。
[0129](4)腺病毒擴增與純化
[0130]I)將293細胞進行傳代，100毫升培養瓶培養，至80_90%融合時進行感染。
[0131]2)感染前棄去培養基，加入2毫升新鮮培養基，然后分別加入收獲病毒原液的
0.5ml,前后左右晃動培養瓶,使病毒均勻分布。
[0132]3) 37°C，5%C02孵育2小時，每隔15分鐘，以十字方向晃動培養瓶。
[0133]4) 2小時后補足培養基，繼續培養。
[0134]5)感染10小時后在熒光顯微鏡下觀察GFP表達情況，并捕獲成像存圖。
[0135]6)待全部細胞表達綠色熒光，2 / 3細胞漂浮后，將細胞收獲。
[0136]7)病毒收集與實施例4中(3)腺病毒收集步驟相同。
[0137]8)收集好的病毒溶液通過氯化銫梯度離心純化濃縮。
[0138](5)病毒滴度的測定(TCID50法)
[0139]I)將293細胞按IX IO4細胞/孔接種96孔板中，待24h后感染病毒。
[0140]2)取純化濃縮后的病毒原液用RPMI1640培養基1:1000稀釋后，再用RPMI1640(含2% FBS)對病毒稀釋液作不同比例稀釋(I:103~1:101°),每種濃度做10個復孔。
[0141]3)按每孔200微升加病毒稀釋液至293細胞培養板中，放置37°C，培養24h。
[0142]4)熒光顯微鏡下計數各種稀釋度GFP陽性孔。
[0143]5)按下列公式計算重組腺病毒AchhIL-1O-OVA的滴度:T = 101+d (s_°_5)
[0144]d:稀釋度的常用對數;s:陽性率的和，從第I個10倍稀釋度開始。雖然一些低稀釋度在測定中省略了(如1:10和1:102)，但在計算時仍應以陽性比率為I來算。
[0145]結果:d=LoglO=l；s=l+l+l+l+l+l+l+0.6+0.2+0=7.8。重組腺病毒 Ad-hlL-lO-OVA(1:1000 稀釋后)的滴度 T=IO1+1 α8-°.5)=108.3 換算做 pfu=108 3-a7=107_6=4X IO7/毫升。重組腺病毒原液滴度=1000X4Χ IO7/毫升=4X 101Qpfu/毫升。
[0146]實施例5 MLzlO及OVA表汰鑒定
[0147]收集感染重組腺病毒Ad-hIL-10-0VA和對照病毒的293細胞及未感染病毒的293細胞的培養液上清，ELISA法檢測其中hIL_10的表達量，結果感染重組腺病毒的293細胞培養液上清中hIL-10的含量顯著升高，見附圖10 ;免疫印記法檢測重組腺病毒Ad-hIL-10-0VA和對照病毒的293細胞的培養液上清中過敏原蛋白OVA的表達情況，以針對OVA的單克隆抗體在感染重組腺病毒的培養基上清中檢測到大小約45kD的蛋白條帶，結果見附圖11。
[0148]實施例6:重纟目腺病毒Ad-mlL-lO-OVA的構律和包裝
[0149]提取經脂多糖刺激培養的小鼠脾細胞的總RNA，反轉錄生成cDNA。根據根據GENBANK提供的mIL-10基因mRNA序列(GENBANK:M37897.1),去除終止密碼子，設計合成擴增引物，其中包括上游Sal I和下游Xho I酶切位點(下劃線標示)。
[0150]擴增引物如下:
[0151]h游引物:5’ ATAGCGTCGACATGCCTGGCTCAGC3’ (SEQ ID N0.10)
[0152]下游引物:5’GGTCTCGAGGCTTTTCATTTTGATCA3’ (SEQ ID N0.11)
[0153]PCR產物送測序，證實擴增產物為mIL-10的表達框序列，如SEQ ID N0.4所示。經過BLAST比對，小鼠的IL-10 (mIL-10)的編碼框序列與人IL-1O (hIL-ΙΟ)的編碼框序列一致性達到82%。
[0154]將mIL-10的PCR產物經Sal I和Xho I雙酶切后，與重組穿梭質粒pAdTrack-hIL-10-0VA經Sal I和Xho I雙酶切去除hIL_10基因后得到的產物連接，得到重組穿梭質粒pAdTrack-mlL-lO-OVA，其余腺病毒質粒重組、病毒包裝等步驟同Ad-h IL-10-OVA,從而得到重組腺病毒Ad-mIL-10-0VA。以下動物實驗中所使用的重組腺病毒均指 Ad-mIL-10-0VA。
[0155]實施例7.對照病毒Ad-control的構建和包裝
[0156]直接應用pAdTrack — CMV與pAdEasy-Ι在細菌BJ5183內同源重組獲得不含目的基因的對照病毒質粒。Pac I線性化后轉入293細胞，包裝得到不含目的基因的對照腺病毒Ad—controlο
[0157]實施例8:腺病毒載體疫苗對過敏反應的預防作用
[0158]選6-10周齡的雌性BALB/c小鼠，第`O天和17天時，實驗組小鼠通過導管灌服5X108pfu重組腺病毒過敏原疫苗(Ad-1L-lO-OVA)，陰性對照組灌服對照腺病毒載體(Ad-control),空白對照組給予磷酸鹽緩沖液PBS(no Ad)。第24天和34天時以0VA50微克混以氫氧化鋁腹腔注射致敏，在第38，49，50和51天時以50微克OVA溶于50微升PBS中滴鼻激發，第52天時測定氣道敏感性(以乙酰甲膽堿刺激后氣道阻力的增加程度來表示，氣道阻力增加越多，表明氣道敏感性越高)，隨后采血測定過敏原特異的IgE。結果發現，提前灌服腺病毒過敏原疫苗的小鼠與使用對照腺病毒及未使用腺病毒的小鼠相比，氣道敏感性顯著減低(見附圖12)，血清OVA-特異性的IgE水平也明顯下降(見附圖13)，表明以腺病毒為載體的重組過敏原疫苗能有效預防過敏。
[0159]實施例9:腺病毒疫苗對過敏反應的治療作用
[0160]選6-10周齡的雌性BALB/c小鼠，第O天時通過腹膜內注射50微克卵白蛋白(0VA)與氫氧化鋁的混合物致敏，第8和9天時，將50微克OVA溶于50ulPBS滴鼻。第10天和第25天實驗組(Ad-1L-1O-OVA)和陰性對照組(Ad-control)分別灌服I X 109pfu重組腺病毒載體及對照載體，空白對照組(no Ad)給予PBS。第39天再以50微克OVA溶于50ulPBS滴鼻激發，第40天時測定氣道敏感性(以乙酰甲膽堿刺激后氣道阻力的增加程度來表示，氣道阻力增加越多，表明氣道敏感性越高)，之后處死動物，分離支氣管淋巴結T細胞進行體外培養，測定其在OVA (100ug/ml)刺激后分泌IL-4的水平，生理鹽水灌洗支氣管肺組織后檢測灌洗液中的各類細胞數。結果發現，OVA致敏后灌服腺病毒過敏原疫苗的小鼠，與使用對照腺病毒及未使用腺病毒的小鼠相比，氣道敏感性明顯降低(見附圖14)，支氣管淋巴結T細胞經OVA刺激后分泌IL-4水平顯著下降(見附圖15)，支氣管肺泡灌洗液中嗜酸性細胞的比例也減低(見附圖16)。提示以腺病毒為載體的重組過敏原疫苗對已經建立的過敏反應有顯著改善作用，可用于過敏性疾病的治療。
【權利要求】
1.一種口服過敏原疫苗，其特征在于:所述口服過敏原疫苗以腺病毒為載體，所述腺病毒載體同時表達IL-1O基因與過敏原基因。
2.根據權利要求1所述的口服過敏原疫苗，其特征在于:所述腺病毒載體為具有感染活力但不致病的復制缺陷型腺病毒載體。
3.根據權利要求1所述的口服過敏原疫苗，其特征在于:IL-10基因與過敏原基因融合表達。
4.根據權利要求1所述的口服過敏原疫苗，其特征在于:所述過敏原基因為卵清蛋白基因。
5.根據權利要求4所述的口服過敏原疫苗，其特征在于:IL一 10與卵清蛋白基因進行融合表達，融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.3所示。
6.權利要求1-5任一項所述口服過敏原疫苗的制備方法，其特征在于:采用腺病毒系統，將過敏原卵清蛋白基因及IL-10基因分別克隆入同一腺病毒穿梭質粒的多克隆區，構建重組穿梭質粒，將重組穿梭質粒與骨架質粒共轉化宿主細胞，經同源重組生成重組腺病毒質粒，經限制性內切酶酶切純化后轉染包裝細胞包裝獲得具有感染活力的腺病毒顆粒，在包裝細胞中進行擴增，裂解包裝細胞后，純化得到重組腺病毒載體；以所得到的重組腺病毒載體制備口服過敏原疫苗。
7.權利要求6所述口服過敏原疫苗的制備方法，其特征在于:采用AdEasy腺病毒系統，將過敏原卵清蛋白基因及IL-10基因分別克隆入同一穿梭質粒pAdTrack-CMV的多克隆區，構建重組穿梭質粒pAdTrack-1L-10-0VA,將重組穿梭質粒與骨架質粒pAdEasy-Ι共轉化大腸桿菌BJ5183，經同源重組生成重組腺病毒質粒，經限制性內切酶Pac I酶切純化后轉染包裝細胞系293 細胞包裝獲得具有感染活力的腺病毒顆粒，在293細胞中進行擴增，裂解293細胞后，CsCl梯度離心純化得到重組腺病毒；以所得到的重組腺病毒制備口服過敏原疫苗。
8.一種組合物，其特征在于:主要成分為權利要求1 一 3任一項所述口服過敏原疫苗。
9.權利要求1-5任一項所述口服過敏原疫苗或權利要求8所述的組合物在制備治療過敏性疾病藥物中的應用。
10.權利要求9所述的應用，所述過敏性疾病為塵螨、霉菌、花粉、動物皮毛、昆蟲、食物或乳膠等中的蛋白質過敏原所致的過敏性鼻炎、過敏性哮喘、過敏性結膜炎、蕁麻疹、特應性皮炎、蕁麻疹或嚴重過敏反應等。
【文檔編號】A61K39/235GK103566367SQ201310545676
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2013年11月6日 優先權日:2013年11月6日
【發明者】馬仕坤, 趙婧文 申請人:馬仕坤