專利名稱：一種靶向融合防齲dna疫苗及制備方法
技術領域：
本發明屬于口腔預防醫學技術領域，更具體涉及一種編碼人細胞毒性T淋巴細胞抗原4信號肽、胞外區的序列和Igγ1鉸鏈區、恒定區融合基因以及變形鏈球菌表面蛋白抗原基因和葡糖基轉移酶基因的包含新型載體的DNA防齲疫苗，本發明還涉及一種所述的靶向融合防齲DNA疫苗的制備方法。
背景技術：
齲病是一種嚴重危害人類口腔和全身健康的口腔常見病、多發病。因齲齒造成的功能喪失、炎癥、疼痛以及牙源性病灶所致臟器疾病可嚴重影響生活質量，降低人口健康素質，給社會帶來巨大危害。齲病是細菌感染性疾病，而變形鏈球菌(下稱變鏈菌，Streptococcus mutans)是主要的致齲菌。變鏈菌能夠與牙面緊密粘附并定植于牙面，產生酸性代謝產物，引起牙齒脫礦最終導致齲齒。
在變鏈菌致齲機制中變鏈菌與牙面的粘附是其致齲的首要條件，這個過程主要是由變形鏈球菌的重要致齲毒力因子表面蛋白(surface protein antigen，PAc)和葡糖基轉移酶(glucosyltransferaes，GTFs)介導的。PAc蛋白中富含丙氨酸的A區和富含脯氨酸的P區為主要的粘附功能區和免疫活性區，PAc位于變鏈菌的表面，介導了細菌與牙面獲得性膜的粘附。GTFs包含有兩個免疫活性區和功能區催化功能區(catalytic region CAT)和葡聚糖結合區(glucan binding region GLU)，能夠合成葡聚糖，使變鏈菌憑借能夠與葡聚糖緊密結合的菌體表面結合型葡糖基轉移酶和葡聚糖結合蛋白與牙面更加緊密結合。變形鏈球菌主要合成三種GTFsGTF-I、GTF-SI、GTF-S，其中GTF-I主要合成以α-1，3糖苷鍵為主的水不溶性葡聚糖，其編碼基因為gtfB。
Saito等將PAc與佐劑霍亂毒素A亞單位一起通過粘膜途徑免疫小鼠誘導了唾液中產生抗PAc-IgA抗體，減少了小鼠口腔中變形鏈球菌的數目，而且免疫小鼠后，可以顯著降低口腔變鏈菌的聚集。說明PAc和霍亂毒素A亞單位復合體有望成為有效的粘膜防齲疫苗(Saito，M.，S.Otake，et al.2001.Protective Immunityto Streptococcus mutans Induced by Nasal Vaccination with Surface Protein Antigenand Mutant Cholera Toxin Adjuvant.J Infect Dis 183(5)823-826.)。宋長征等根據變形鏈球菌葡糖基轉移酶的葡聚糖結合區和蔗糖結合區(催化區)的保守氨基酸序列設計了27個氨基酸短肽，與弗氏佐劑混合后免疫機體后可有效誘導抗體產生，其免疫血清不僅拮抗GTF酶活性，而且明顯抑制了體外變鏈菌與試管壁的黏附能力(宋長征，趙建等，葡糖基轉移酶合成肽疫苗的免疫原性研究，中華口腔醫學雜志，2002，37(60)459-462)。Jespersgaard克隆表達了gtfB基因中的催化活性區(CAT)和葡聚糖結合區(GLU)，分別免疫兔后，所獲得的抗CAT抗體能明顯抑制了變形鏈球菌和茸毛鏈球菌的GTFS合成水不溶性葡聚糖，而抗GLU抗體顯示了較抗CAT抗體更強的抑制變形鏈球菌的GTFS合成水不溶性葡聚糖的能力。這可能與GLU的重復序列特性增加了與抗體的結合能力和抗CAT抗體不易進入葡糖基轉移酶的催化區域有關。(Jespersgaard，C.，G.Hajishengallis，T.E.Greenway，D.J.Smith，M.W.Russell，and S.M.Michalek.1999.Functionaland immunogenic characterization of two cloned regions of Streptococcus mutansglucosyltransferase I.Infect Immun 67810-6.)。Zhang等用研制的包含變形鏈球菌表面蛋白抗原的SBR區和葡糖基轉移酶的GLU區的融合蛋白疫苗免疫小鼠，并與單獨使用SBR或GLU蛋白相比較，結果融合蛋白增強了粘膜免疫對SBR和GLU的應答，并且增強了系統免疫對SBR的反應強度(Zhang P，JespersgaardC，Lamberty-Mallory L.Enhanced immunogenicity of a genetic chimeric proteinconsisting of two virulence antigens of Streptococcus mutans and protection againstinfection.Infect.Immun.2002，70(12)6779-6787，)。
然而以上的各種防齲多肽疫苗存在許多不足之處，首先是這些多肽制備純化困難，一般需耗時數周且費用昂貴，保存需要特殊條件；其次，多肽防齲疫苗刺激機體產生有效的免疫反應的能力較差，常需添加各種對人體有害的免疫佐劑；多肽防齲疫苗與其它多肽疫苗一樣，誘導特異性免疫反應的持續時間一般較短，需反復多次接種才能達到較滿意的效果；另外多肽疫苗一般不能誘導嬰幼兒產生免疫反應。(Kowalczyk DW，Ertl HCJ.1999.Immune responses to DNA vaccines.CMLS，Cell.Mol.Life Sci.，55751-770)。
Fan(樊明文)等學者將編碼變形鏈球菌表面蛋白PAc的A區和P區基因克隆至真核表達載體pCI中，構建了防齲DNA疫苗pCIA-P，免疫大鼠，可以在血清和唾液中檢測到特異性抗體，同時證明能有效防齲(Fan MW，Z.BianZ.X.Peng et al.DNA Vaccine Encoding Streptococcus mutans Surface ProteinProtected Gnotobiotic Rats From Caries.J.Dent.Res.2002，81(11)784-787)。其后，為了提高DNA疫苗的免疫效能，將擴增出的編碼變形鏈球菌GS-5株葡糖基轉移酶GTF-I的基因gtfB的葡聚糖結合區的序列GLU克隆到真核表達質粒pCIA-P中獲得pGLUA-P融合防齲DNA疫苗(賈榮，樊明文，邊專等，融合防齲DNA疫苗pGLUA-P的構建及其細胞表達研究。中華口腔醫學雜志.2002，37(6)456-458)。動物實驗證實防齲效果優于只編碼一種毒力因子的防齲DNA疫苗pCIA-P(賈榮，樊明文，邊專等。GTF-PAc融合防齲DNA疫苗研究(III)pGLUA-P免疫定菌鼠防齲研究。口腔醫學縱橫雜志2002；18(1)3)。但是，防齲DNA疫苗和其他DNA疫苗一樣依舊面臨如何提高免疫效能的問題。
CTLA4(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4，CTLA4)，又稱CD152，是免疫球蛋白超家族的一員。它主要表達于活化的T細胞表面，亦可表達于CTL細胞，是CD4+T細胞免疫應答的重要調節因子，起免疫負調節作用。CTLA4結構基因包括四個外顯子，分別編碼先導序列、胞外區、跨膜區及胞漿區四個獨立的功能區，其胞外區包含一個Ig的V樣功能區，側翼與兩個疏水區相接，其中一個可以將CTLA4錨定在細胞膜上。研究表明CTLA4與表達于抗原遞呈細胞(APC)表面的CD80和CD86分子有很強的結合能力，是另一配體CD28的10～100倍(Ostrov DA，Shi W，Schwartz JCD，et al.Structure of Murine CTLA-4 andits role in modulating T cell responsiveness.Science，2000，290(27)816～819)。1998年澳大利亞學者Boyle等研究了結合有CTLA4基因片段的DNA疫苗并免疫小鼠，2周后測得特異性抗體水平比對照組高達10000倍(Boyle JS，Brady JL，LewAM.，Enhanced responses to a DNA vaccine encoding a fusion antigen that is directedto sites of immune induction.Natrue，1998，392(26)408-411)。其原因可能為CTLA4定向引導抗原與APC表面的B7分子結合，促進了APC攝取抗原，而APC在攝取抗原之后，自身被激活，表達了更多的B7分子，從而使更多的抗原被DC攝取、加工，起到了放大免疫反應的作用。因此，本研究小組為了進一步增強防齲DNA疫苗的免疫原性，提高免疫防齲效果，把人的細胞毒淋巴細胞相關抗原4(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4，CTLA4)基因克隆到變形鏈球菌PAc和GTFs抗原基因的前端，構建了靶向融合防齲DNA疫苗pGJA-P，使在體內所翻譯的蛋白質能夠在CTLA4的引導下，與誘導免疫反應的關鍵細胞APC表面的配體分子B7分子結合從而提高免疫效能(郭繼華，樊明文，邊專等，靶向融合防齲DNA疫苗的構建與細胞表達，中華口腔醫學雜志。2003，38282-284)。經粘膜途徑免疫兔，比非靶向融合防齲DNA疫苗增強了誘導血清及唾液特異性抗體的能力(賈榮，樊明文，郭繼華等，靶向融合防齲DNA疫苗pGJA-P免疫兔的實驗研究，中華口腔醫學雜志。2004，3972-75)。
但是該疫苗的載體pCI質粒含有氨卞青霉素抗性基因，不符合DNA疫苗的載體骨架有關要求。pVAX1是美國Invitrogen公司根據美國藥品食品管理局(FDA)的要求，專門為DNA疫苗設計的真核表達載體。pVAX1是高拷貝質粒，在大多數哺乳動物細胞中可以高水平瞬時表達。它攜帶卡那霉素抗性基因，因此比較安全。本研究將以新型DNA疫苗載體pVAX1為骨架構建新型載體靶向融合防齲DNA質粒。

發明內容
本發明的目的是在于提供了一種靶向融合防齲DNA疫苗，用真核表達載體pVAX1替代靶向融合防齲真核表達質粒pGJA-P(專利申請號02139118.1)中的疫苗載體pCI，構建一種靶向融合防齲DNA疫苗pGJA-P/VAX。它用于人體安全性高，增強免疫效能。
本發明的另一個目的是在于提供一種制備靶向融合防齲DNA疫苗的方法，生產成本低廉，方法簡單，純化簡單且產物純度高。
本發明所提供的靶向融合防齲DNA疫苗為大腸桿菌Escherichia coliJM109/pGJA-P/VAX，保藏單位中國典型培養物保藏中心，地址中國.武漢.武漢大學，保藏日期2004年3月23日，保藏編號.CCTCCNOM204028。
其步驟如下A.用限制性酶NheI和NotI酶切處理靶向融合防齲真核表達質粒pGJA-P切下細胞毒性T淋巴細胞抗原4信號肽、胞外區的序列和Igγ1鉸鏈區、恒定區融合基因(CTLA-4-Ig目的基因)，變形鏈球菌葡糖基轉移酶的GLU區序列(GLU片段)和變形鏈球菌表面蛋白抗原PAc的A-P片段(A-P片段)，用相同限制性酶處理pVAX1載體；B.電泳膠回收純化CTLA-4-Ig目的基因、GLU片段、A-P片段和NheI和NotI酶切處理的pVAX1載體片段；C.將上述兩種純化的目的片段在T4DNA連接酶作用下連接，轉化感受態細胞，接種在卡那霉素陽性LB平板上；D.篩選重組陽性克隆，接種在卡那霉素陽性的LB培養基中，搖菌，提取質粒，酶切證實構建的正確性，并命名為pGJA-P/VAX。
pGJA-P/VAX靶向融合防齲DNA疫苗的基因序列為SEQUENCE LISTING。
與其它DNA疫苗相比，pGJA-P/VAX的載體骨架具有巨細胞病毒CMV的早期啟動子/增強子(CMV immediate-early enhancer/promoter)，該啟動子增強表達的能力顯著高于其它如勞斯肉瘤病毒啟動子LTR、猴病毒40(SV40)等啟動子，使重組蛋白能夠高效高水平表達；pGJA-P/VAX具有牛生長激素(BGH)多聚腺苷酰化信號，允許高效轉錄終止以及mRNA的多聚腺苷酰化作用；pGJA-P/VAX具有卡那霉素抗性基因，用于人可以避免不必要的過敏反應；pGJA-P/VAX攜帶人CTLA4信號肽、胞外區的序列和Igγ1鉸鏈區、恒定區融合基因，因此可以利用CTLA4與其配體牢固結合的特性將宿主表達出的抗原蛋白引導至APC表面，大幅度增強DNA疫苗的免疫效能，同時由于Igγ1部分功能區的存在使使重組蛋白在體內更加穩定，半衰期延長，利于體內應用；pGJA-P/VAX能夠表達變形鏈球菌的兩種重要毒力因子，因此其防齲效果比僅攜帶A-P片段的DNA疫苗為佳。
與多肽防齲疫苗相比，pGJA-P/VAX DNA防齲疫苗具有以下優點①pGJA-P/VAX質粒物理化學性質穩定，20-25℃下即可保存，便于運輸使用，而多肽疫苗一般需要冷藏保存等特殊條件；②pGJA-P/VAX簡化了疫苗的生產步驟，僅需完成基因工程的上游部分，省卻了下游重組多肽的表達和純化過程，短時間內可以得到大量的質粒，而且pGJA-P/VAX質粒的純化方法較為簡單且產物純度很高，而多肽疫苗制備純化相對困難復雜，一般需耗時數周；③多肽防齲疫苗激發機體產生免疫反應的能力較差，需要添加各種免疫佐劑，但這些佐劑經常引起嚴重的炎癥反應，大大限制了多肽疫苗的應用，pGJA-P/VAX同時攜帶人CTLA4信號肽、胞外區的序列和Igγ1鉸鏈區、恒定區融合基因，因此可以利用CTLA4與其配體牢固結合的特性將宿主表達出的抗原蛋白引導至APC表面，大幅度增強DNA疫苗的免疫效能，避免使用各種對人體有害的佐劑；④多肽疫苗在體內很不穩定易被蛋白酶降解，因而要接種較大量才能引起明顯的免疫反應，且要多次接種以維持效果。而pGJA-P/VAX如同其它DNA疫苗一樣，少量接種即可以誘導機體的免疫應答。另外，pGJA-P/VAX能夠表達變形鏈球菌的兩種重要毒力因子，其防齲效果比僅攜帶A-P片段的DNA疫苗為佳，同時也應比不含CTLA4信號肽、胞外區的序列和Igγ1鉸鏈區、恒定區融合基因的其他防齲DNA疫苗效果要佳。


圖1 pGJA-P/VAX防齲DNA疫苗結構示意圖CMV promoter 巨細胞病毒早期啟動子/增強子CTLA4-IgGLU A-P fragment CTLA4-Ig、GLU、A-P重組DNA片段BGH polyA signal 牛生長激素多聚腺苷酰化信號NheI(696) 限制性內切酶NheI的酶切位點BclI(1181) 限制性內切酶BclI的酶切位點KpnI(1884) 限制性內切酶KpnI的酶切位點NotI(5039) 限制性內切酶SmaI的酶切位點XhoI(5046) 限制性內切酶XhoI的酶切位點XhoI(2773) 限制性內切酶XhoI的酶切位點Kan卡那霉素抗性基因pGJA-P/VAX攜帶人CTLA4信號肽、胞外區的序列和Igγ1鉸鏈區、恒定區融合基因，該片段可以直接將抗原蛋白引導于APC表面，并與之結合，含有變形鏈球菌兩個重要毒力因子的免疫活性區和功能區基因序列即葡糖基轉移酶GTF-I中葡聚糖結合區(GLU)序列以及表面蛋白PAc編碼A區和P區(A-P)序列變形鏈球菌表面蛋白抗原PAc重要抗原決定簇的編碼基因A-P片段，具有巨細胞病毒CMV的早期啟動子/增強子，該啟動子增強表達的能力顯著高于其它如勞斯肉瘤病毒啟動子LTR、猴病毒40(SV40)等啟動子；pGJA-P/VAX具有卡那霉素抗性基因，用于人可以避免不必要的過敏反應；pGJA-P/VAX具有牛生長激素(BGH)多聚腺苷酰化信號，允許高效轉錄終止以及mRNA的多聚腺苷酰化作用。
圖2 pGJA-P/VAX酶切電泳圖1.λ/HindIII分子量標準2.pVAX1經KpnI單酶切3.pGJA-P/VAX經KpnI單酶切4.pGJA-P/VAX經NheI和XhoI雙酶切圖3重組質粒pGJA-P/VAX在CHO細胞系中的表達示意圖重組質粒pGJA-P/VAX轉染后的CHO細胞胞漿內特異性表達產物。(cy3-SABC法，抗PAc抗體，×100)圖4重組質粒pGJA-P/VAX在CHO細胞系中的表達示意圖重組質粒pGJA-P/VAX轉染后的CHO細胞胞漿內特異性表達產物。(cy3-SABC法，抗GTF抗體，×100)圖5陽性對照質粒pGJA-P在CHO細胞系中的表達示意圖陽性對照質粒pGJA-P轉染后的CHO細胞胞漿內特異性表達產物。(cy3-SABC法，抗PAc抗體，×100)圖6陽性對照質粒pGJA-P在CHO細胞系中的表達示意圖陽性對照質粒pGJA-P轉染后的CHO細胞胞漿內特異性表達產物。(cy3-SABC法，抗GTF抗體，×100)圖7空載體pVAX1在CHO細胞系中的表達示意圖空載體pVAX1轉染后的CHO細胞胞漿內無特異性表達產物。(cy3-SABC法，抗PAc抗體，×100)圖8空載體pVAX1在CHO細胞系中的表達示意圖空載體pVAX1轉染后的CHO細胞胞漿內無特異性表達產物。(cy3-SABC法，抗GTF抗體，×100)圖9唾液抗PAc特異性SIgA抗體檢測結果示意圖。
●1號猴，○2號猴，_3號猴，_4號猴，■5號猴，□6號猴圖10唾液抗GTF特異性SIgA抗體檢測結果示意圖。
圖11血清抗PAc特異性IgG抗體檢測結果示意圖。
□1號猴，○ 2號猴，◇3號猴，△4號猴，●5號猴，■6號猴圖12血清抗GTF特異性IgG抗體檢測結果示意圖。
具體實施例方式
下面根據附圖對本發明作進一步詳細描述根據圖1、圖2可知，運用分子生物學專業軟件DNASIS綜合DNA序列分析軟件(日本日立公司)、Gene Construction kit 2.0基因模擬克隆軟件(美國Textco公司)分析和設計具有新型載體靶向融合防齲DNA疫苗并模擬克隆全過程。pGJA-P/VAXA新型載體靶向融合防齲DNA疫苗的構建全過程用限制性酶NheI和NotI酶切處理靶向融合防齲真核表達質粒pGJA-P以及pVAX1載體；電泳酶切產物，切下靶向融合基因(包括CTLA-4-Ig目的基因、GLU、A-P片段)和NheI和NotI酶切處理的pVAX1載體片段，膠回收純化目的片段；將上述兩種純化的目的片段在T4DNA連接酶作用下20-25℃連接過夜，次日轉化感受態細胞，接種在卡那霉素陽性LB平板上；篩選重組陽性克隆，接種在卡那霉素陽性的LB培養基中，搖菌，提取質粒，酶切證實構建的正確性，并命名為pGJA-P/VAX。pVAX1經KpnI單酶切得到了3.0kb片段，pGJA-P/VAX經KpnI單酶切得到了7.2kb片段，經NheI和NotI雙酶切，得到2.9kb、2.2kb、2.1kb片段，電泳結果表明pGJA-P/VAX的插入片段大小與預期結果一致(圖2)。
根據圖3、圖4、圖5、圖6、圖7可知，CHO細胞系用細胞培養液D/F(Gibco)37℃、5％CO2培養。培養瓶中預先加入蓋玻片，使用轉染劑梭華-SofastTM基因轉染試劑(廈門太陽馬生物工程有限公司)進行轉染。過程首先制備梭華-SofastTM/DNA復合物的制備，將1-2μg的DNA質粒和3-5μl梭華-SofastTm分別稀釋于100μl的不含血清和抗菌素的D/F中，輕輕混勻。將梭華-SofastTM稀釋液滴加到DNA稀釋液中，一邊滴加一邊混勻。20-25℃孵育15-20分鐘。將梭華-SofastTM/DNA復合物加到培養瓶中并輕輕搖動使均勻混合。設置空載體對照以及pGJA-P陽性對照。放置37℃ CO2孵育箱孵育24-48小時后，取出蓋玻片，將轉染實驗后培養板中的蓋玻片取出，PBS液漂洗3×2分鐘。中性福爾馬林(10％甲醛，以0.01M PBS稀釋)固定10分鐘。0.01M PBS洗滌3×5分鐘。加入山羊血清在20-25℃下封閉30分鐘。甩去多余液體，加1∶50兔抗PAc抗體或1∶50兔抗GTF抗體4℃過夜，次日PBS洗滌3×5分鐘。加入生物素化羊抗兔IgG，37℃溫育30分鐘，PBS洗滌3×5分鐘，加入Cy3熒光素標記的SABC后置37℃溫育30分鐘，PBS洗滌3×5分鐘。熒光顯微鏡觀察記錄。陽性對照和pGJA-P/VAX轉染細胞鏡下呈現強紅色熒光(圖3-6)，空載體轉染細胞鏡下無熒光(圖7-8)。證實了重組融合蛋白可以在真核細胞中正確表達。
DNA疫苗最終要應用在人體，而猴與人的生理狀況十分相近，遺傳背景也很相近，因此猴是驗證DNA疫苗能否在人體中起作用的理想模型。采用了將pGJA-P/VAX經三角肌肌注免疫和將pGJA-P/VAX與局部麻醉藥Bupivacaine形成的復合物經鼻粘膜滴注免疫的方法免疫獼猴，用ELISA法檢測血清與唾液中的特異性抗體，評價DNA疫苗的效能。實驗分組見附表1。
附表1 免疫猴實驗分組和免疫途徑組別 免疫原免疫途徑 動物編號 劑量A pGJA-P/VAX 三角肌肌注 1號、2號 1000μgB pGJA-P/VAX 鼻粘膜滴注 3號、4號 1000μgC pVAX1 三角肌肌注 5號 500μgD pVAX1 鼻粘膜滴注 6號 500μg實驗結果發現唾液抗PAc特異性SIgA抗體中，2、3和4號猴免疫后2月和3月時較免疫前顯著升高，并以2、4號猴水平最高。1號和對照猴(5和6號)沒有顯著變化(圖9)。
唾液抗GTF特異性SIgA抗體中，2、3和4號猴免疫后2月和3月時較免疫前顯著升高，并以2、4號猴水平最高。1號和對照猴(5和6號)沒有顯著變化(圖10)。
1號和2號猴免疫后一個月時血清抗PAc IgG抗體水平就比免疫前高16倍；3號猴免疫后3個月時血清抗PAc IgG抗體水平也達到比免疫前高16倍；4號猴免疫后3個月時血清抗PAc IgG抗體水平也達到比免疫前高8倍；5號和6號免疫前后血清抗PAc IgG抗體水平無顯著變化(圖11)。
1號和2號猴免疫后一個月時血清抗GTF IgG抗體水平就比免疫前高16倍，2個月時達32倍；3號猴免疫后2個月時血清抗GTF IgG抗體水平也達到比免疫前高8倍；4號猴免疫后1個月時血清抗GTF IgG抗體水平也達到比免疫前高16倍，3個月時達32倍；5號和6號免疫前后血清抗GTF IgG抗體水平無顯著變化(圖12)。
研究結果證實了在靈長類動物中靶向融合防齲DNA疫苗經肌注和鼻粘膜滴注兩種途徑可有效誘導特異性系統和粘膜免疫反應。
SEQUENCE LISTING<110>武漢大學<120>一種靶向融合防齲DNA疫苗及制備方法<130>無<160>3<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>7259<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>人工序列<220>
<221>CDS<222>(702)..(5027)<223>人細胞毒T淋巴細胞相關抗原4(CTLA4)信號肽、胞外區，免疫球蛋白γ1恒定和鉸鏈區，變形鏈球菌血清型C(S.mutans)葡糖基轉移酶GLU片段和表面蛋白抗原的A區和P區融合肽<220>
<221>CDS<222>(5486)..(6280)<223>卡那霉素抗性基因<220>
<221>promoter<222>(137)..(701)<223>
<220>
<221>BGH polyA_signal<222>(5089)..(5313)<223>
<400>1gactcttcgc gatgtacggg ccagatatac gcgttgacat tgattattga ctagttatta 60atagtaatca attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc gcgttacata120acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat180aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga240ctatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc300ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt360atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtgat420gcggttttgg cagtacatca atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg gatttccaag480tctccacccc attgacgtca atgggagttt gttttggcac caaaatcaac gggactttcc540aaaatgtcgt aacaactccg ccccattgac gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga600
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1135 1140 1145gaa ttc act ttc tat gac gaa gat gga aaa cca att aat ttt gat4187Glu Phe Thr Phe Tyr Asp Glu Asp Gly Lys Pro Ile Asn Phe Asp1150 1155 1160aat gcc ctt ctc tca gta gct tct ctt aac cgt gaa cat aac tct4232Asn Ala Leu Leu Ser Val Ala Ser Leu Asn Arg Glu His Asn Ser1165 1170 1175att gag atg gct aaa gat tat agt ggt aaa ttt gtc aaa atc tct4277Ile Glu Met Ala Lys Asp Tyr Ser Gly Lys Phe Val Lys Ile Ser1180 1185 1190ggt tca tct att ggt gaa aag aat ggc atg att tat gct aca gat4322Gly Ser Ser Ile Gly Glu Lys Asn Gly Met Ile Tyr Ala Thr Asp1195 1200 1205act ctt aac ttt aaa cag ggt gaa ggt ggc tct cgc tgg act atg4367Thr Leu Asn Phe Lys Gln Gly Glu Gly Gly Ser Arg Trp Thr Met1210 1215 1220tat aaa aat agt caa gct ggt tca gga tgg gat agt tca gat gcg4412Tyr Lys Asn Ser Gln Ala Gly Ser Gly Trp Asp Ser Ser Asp Ala1225 1230 1235ccg aat tct tgg tat gga gca ggg gct att aaa atg tct ggt ccg4457Pro Asn Ser Trp Tyr Gly Ala Gly Ala Ile Lys Met Ser Gly Pro1240 1245 1250aat aac cat gtt act gta gga gca act tct gca aca aat gta atg4502Asn Asn His Val Thr Val Gly Ala Thr Ser Ala Thr Asn Val Met1255 1260 1265cca gtt tct gac atg cct gtt gtt cct ggt aag gac aat act gat4547Pro Val Ser Asp Met Pro Val Val Pro Gly Lys Asp Asn Thr Asp1270 1275 1280ggc aaa aaa cca aat att tgg tat tct tta aat ggt aaa atc cgt4592Gly Lys Lys Pro Asn Ile Trp Tyr Ser Leu Asn Gly Lys Ile Arg1285 1290 1295gcg gtt aat gtt cct aaa gtt act aag gaa aaa ccc aca cct ccg4637Ala Val Asn Val Pro Lys Val Thr Lys Glu Lys Pro Thr Pro Pro1300 1305 1310gtt aaa cca aca gct cca act aaa cca act tat gaa aca gaa aag4682Val Lys Pro Thr Ala Pro Thr Lys Pro Thr Tyr Glu Thr Glu Lys1315 1320 1325cca tta aaa ccg gca cca gta gct cca aat tat gaa aag gag cca4727Pro Leu Lys Pro Ala Pro Val Ala Pro Asn Tyr Glu Lys Glu Pro1330 1335 1340aca ccg ccg aca agg aca ccg gat caa gca gag cca aac aaa ccc4772Thr Pro Pro Thr Arg Thr Pro Asp Gln Ala Glu Pro Asn Lys Pro1345 1350 1355aca ccg ccg acc tat gaa aca gaa aag ccg ttg gag cca gca cct4817
Thr Pro Pro Thr Tyr Glu Thr Glu Lys Pro Leu Glu Pro Ala Pro1360 1365 1370gtt gag cca agc tat gaa gca gag cca aca ccg ccg aca agg aca 4862Val Glu Pro Ser Tyr Glu Ala Glu Pro Thr Pro Pro Thr Arg Thr1375 1380 1385ccg gat cag gca gag cca aat aaa ccc aca ccg ccg acc tat gaa 4907Pro Asp Gln Ala Glu Pro Asn Lys Pro Thr Pro Pro Thr Tyr Glu1390 1395 1400aca gaa aag ccg ttg gag cca gca cct gtt gag cca agc tat gaa 4952Thr Glu Lys Pro Leu Glu Pro Ala Pro Val Glu Pro Ser Tyr Glu1405 1410 1415gca gag cca acg cca ccg aca cca aca cca gat caa cca gaa cca 4997Ala Glu Pro Thr Pro Pro Thr Pro Thr Pro Asp Gln Pro Glu Pro1420 1425 1430aac aaa cct gtt gag cca act tat gag taa gtcgaccccg ggcggccgct 5047Asn Lys Pro Val Glu Pro Thr Tyr Glu1435 1440cgagtctaga gggcccgttt aaacccgctg atcagcctcg actgtgcctt ctagttgcca5107gccatctgtt gtttgcccct cccccgtgcc ttccttgacc ctggaaggtg ccactcccac5167tgtcctttcc taataaaatg aggaaattgc atcgcattgt ctgagtaggt gtcattctat5227tctggggggt ggggtggggc aggacagcaa gggggaggat tgggaagaca atagcaggca5287tgctggggat gcggtgggct ctatggcttc tactgggcgg ttttatggac agcaagcgaa5347ccggaattgc cagctggggc gccctctggt aaggttggga agccctgcaa agtaaactgg5407atggctttct cgccgccaag gatctgatgg cgcaggggat caagctctga tcaagagaca5467ggatgaggat cgtttcgc atg att gaa caa gat gga ttg cac gca ggt tct5518Met Ile Glu Gln Asp Gly Leu His Ala Gly Ser1445 1450ccg gcc gct tgg gtg gag agg cta ttc ggc tat gac tgg gca caa 5563Pro Ala Ala Trp Val Glu Arg Leu Phe Gly Tyr Asp Trp Ala Gln1455 1460 1465cag aca atc ggc tgc tct gat gcc gcc gtg ttc cgg ctg tca gcg 5608Gln Thr Ile Gly Cys Ser Asp Ala Ala Val Phe Arg Leu Ser Ala1470 1475 1480cag ggg cgc ccg gtt ctt ttt gtc aag acc gac ctg tcc ggt gcc 5653Gln Gly Arg Pro Val Leu Phe Val Lys Thr Asp Leu Ser Gly Ala1485 1490 1495ctg aat gaa ctg caa gac gag gca gcg cgg cta tcg tgg ctg gcc 5698Leu Asn Glu Leu Gln Asp Glu Ala Ala Arg Leu Ser Trp Leu Ala1500 1505 1510acg acg ggc gtt cct tgc gca gct gtg ctc gac gtt gtc act gaa 5743Thr Thr Gly Val Pro Cys Ala Ala Val Leu Asp Val Val Thr Glu1515 1520 1525gcg gga agg gac tgg ctg cta ttg ggc gaa gtg ccg ggg cag gat 5788
Ala Gly Arg Asp Trp Leu Leu Leu Gly Glu Val Pro Gly Gln Asp1530 1535 1540ctc ctg tca tct cac ctt gct cct gcc gag aaa gta tcc atc atg 5833Leu Leu Ser Ser His Leu Ala Pro Ala Glu Lys Val Ser Ile Met1545 1550 1555gct gat gca atg cgg cgg ctg cat acg ctt gat ccg gct acc tgc 5878Ala Asp Ala Met Arg Arg Leu His Thr Leu Asp Pro Ala Thr Cys1560 1565 1570cca ttc gac cac caa gcg aaa cat cgc atc gag cga gca cgt act 5923Pro Phe Asp His Gln Ala Lys His Arg Ile Glu Arg Ala Arg Thr1575 1580 1585cgg atg gaa gcc ggt ctt gtc gat cag gat gat ctg gac gaa gag 5968Arg Met Glu Ala Gly Leu Val Asp Gln Asp Asp Leu Asp Glu Glu1590 1595 1600cat cag ggg ctc gcg cca gcc gaa ctg ttc gcc agg ctc aag gcg 6013His Gln Gly Leu Ala Pro Ala Glu Leu Phe Ala Arg Leu Lys Ala1605 1610 1615agc atg ccc gac ggc gag gat ctc gtc gtg acc cat ggc gat gcc 6058Ser Met Pro Asp Gly Glu Asp Leu Val Val Thr His Gly Asp Ala1620 1625 1630tgc ttg ccg aat atc atg gtg gaa aat ggc cgc ttt tct gga ttc 6103Cys Leu Pro Asn Ile Met Val Glu Asn Gly Arg Phe Ser Gly Phe1635 1640 1645atc gac tgt ggc cgg ctg ggt gtg gcg gac cgc tat cag gac ata 6148Ile Asp Cys Gly Arg Leu Gly Val Ala Asp Arg Tyr Gln Asp Ile1650 1655 1660gcg ttg gct acc cgt gat att gct gaa gag ctt ggc ggc gaa tgg 6l93Ala Leu Ala Thr Arg Asp Ile Ala Glu Glu Leu Gly Gly Glu Trp1665 1670 1675gct gac cgc ttc ctc gtg ctt tac ggt atc gcc gct ccc gat tcg 6238Ala Asp Arg Phe Leu Val Leu Tyr Gly Ile Ala Ala Pro Asp Ser1680 1685 1690cag cgc atc gcc ttc tat cgc ctt ctt gac gag ttc ttc tga 6280Gln Arg Ile Ala Phe Tyr Arg Leu Leu Asp Glu Phe Phe1695 1700 1705attattaacg cttacaattt cctgatgcgg tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt6340tcacaccgca tacaggtggc acttttcggg gaaatgtgcg cggaacccct atttgtttat6400ttttctaaat acattcaaat atgtatccgc tcatgagaca ataaccctga taaatgcttc6460aataatagca cgtgctaaaa cttcattttt aatttaaaag gatctaggtg aagatccttt6520ttgataatct catgaccaaa atcccttaac gtgagttttc gttccactga gcgtcagacc6580ccgtagaaaa gatcaaagga tcttcttgag atcctttttt tctgcgcgta atctgctgct6640tgcaaacaaa aaaaccaccg ctaccagcgg tggtttgttt gccggatcaa gagctaccaa6700ctctttttcc gaaggtaact ggcttcagca gagcgcagat accaaatact gtccttctag6760tgtagccgta gttaggccac cacttcaaga actctgtagc accgcctaca tacctcgctc6820
tgctaatcct gttaccagtg gctgctgcca gtggcgataa gtcgtgtctt accgggttgg6880actcaagacg atagttaccg gataaggcgc agcggtcggg ctgaacgggg ggttcgtgca6940cacagcccag cttggagcga acgacctaca ccgaactgag atacctacag cgtgagctat7000gagaaagcgc cacgcttccc gaagggagaa aggcggacag gtatccggta agcggcaggg7060tcggaacagg agagcgcacg agggagcttc cagggggaaa cgcctggtat ctttatagtc7120ctgtcgggtt tcgccacctc tgacttgagc gtcgattttt gtgatgctcg tcaggggggc7180ggagcctatg gaaaaacgcc agcaacgcgg cctttttacg gttcctgggc ttttgctggc7240cttttgctca catgttctt 7259<210>2<211>1441<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<223>人工序列<400>2Met Ala Cys Leu Gly Phe Gln Arg His Lys Ala Gln Leu Asn Leu Ala1 5 10 15Thr Arg Thr Trp Pro Cys Thr Leu Leu Phe Phe Leu Leu Phe Ile Pro20 25 30Val Phe Cys Lys Ala Met His Val Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala35 40 45Ser Ser Arg Gly Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly50 55 60Lys Ala Thr Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln65 70 75 80Val Thr Glu Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met Gly Asn Glu Leu Thr85 90 95Phe Leu Asp Asp Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gln Val100 105 110Asn Leu Thr Ile Gln Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile115 120 125Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Leu Gly Ile Gly130 135 140Asn Gly Thr Gln Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser145 150 155 160Asp Gln Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser165 170 175Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro180 185 190Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys195 200 205Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp210 215 220
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權利要求
1.一種靶向融合防齲DNA疫苗，其特征在于大腸桿菌(Escherichia coli)，Escherichia coli JM109/pGJA-P/VAX，CCTCC NOM204028。
2.一種實現權利要求1所述的一種靶向融合防齲DNA疫苗的制備方法，它包括下列步驟A.用限制性酶NheI和NotI酶切處理靶向融合防齲真核表達質粒pGJA-P切下CTLA-4-Ig目的基因、GLU片段、A-P片段，用相同限制性酶處理pVAX1載體；B.電泳膠回收純化CTLA-4-Ig目的基因、GLU片段、A-P片段和NheI和NotI酶切處理的pVAX1載體片段；C.將上述兩種純化的目的片段在T4DNA連接酶作用下連接，轉化感受態細胞，接種在卡那霉素陽性LB平板上；D.篩選重組陽性克隆，接種在卡那霉素陽性的LB培養基中，搖菌，提取質粒，質粒為pGJA-P/VAX。
3.根據權利要求2所述的一種靶向融合防齲DNA疫苗的制備方法，其特征在于pGJA-P/VAX靶向融合防齲DNA疫苗的基因序列為SEQUENCELISTING。
全文摘要
本發明公開了一種靶向融合防齲DNA疫苗及制備方法，大腸桿菌Escherichia coli JM109/pGJA－P/VAX，CCTCC NoM204028。用限制性酶NheI和NotI酶切處理靶向融合防齲真核表達質粒pGJA－P切下靶向融合基因(包括CTLA－4－Ig目的基因、GLU、A－P片段)，將靶向融合基因克隆到pVAX1載體中，酶切證實構建的正確性，并命名為pGJA－P/VAX，轉染真核細胞CHO細胞系，證實可以在真核細胞正確表達重組蛋白。本發明方法簡單，安全性高，避免產生對氨卞青霉素的過敏反應，生產成本低廉，可大幅度提高其免疫效能。
文檔編號A61P1/02GK1593662SQ20041001331
公開日2005年3月16日 申請日期2004年6月18日 優先權日2004年6月18日
發明者樊明文, 賈榮, 郭繼華, 邊專, 陳智, 彭彬, 范兵 申請人:武漢大學