一種鴨坦布蘇病毒、由該病毒制備的疫苗及其制備方法
【專利摘要】本發明公開一種鴨坦布蘇病毒、由該病毒制備的疫苗及其制備方法，該病毒命名為鴨坦布蘇病毒GDHD2014?3；所述病毒于2016年4月11日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏號為CCTCC No：V201621；所述治療鴨坦布蘇病毒的疫苗的制備方法，包括以下步驟：1)病毒培養：將鴨坦布蘇病毒GDHD2014?3接種至病毒培養用細胞中，然后收獲病毒液并過濾；2)病毒滅活：將病毒液中加入甲醛溶液滅活24～48h；3)乳化：將疫苗原液，與白油佐劑混合進行乳化，獲得疫苗；疫苗中的抗原免疫原性好，采用較低濃度病毒制成疫苗即可起到保護作用，保護率達90％以上。CCTCC NO:V201
【專利說明】
_種鴨坦布蘇病毒、由該病毒制備的疫苗及其制備方法
技術領域
[0001] 本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種鴨坦布蘇病毒及其應用。
【背景技術】
[0002] 鴨坦布蘇病毒病(Duck Tembusu Virus Strain)，也稱蛋鴨黃病毒病是由黃病毒 科鴨坦布蘇病毒引起的一種侵害蛋鴨卵巢的急性傳染病。主要引起高產蛋鴨產蛋量急劇下 降、采食量急劇下降。如果蛋鴨患此病，其產蛋量可從高峰在一周內迅速下降甚至停產，采 食量也從正常水平降低至正常的20%左右。經臨床診斷分析，患病蛋鴨卵巢壞死，脾臟腫 大，并伴有未成形卵的液化等臨床病理特征。本病在國內傳播廣泛，各省種蛋鴨養殖區每年 均有發生。自2010年該病發現以來，從最初的夏季產蛋高峰期爆發發展至現在的不定期發 生，該病呈現出了一種無規律的變化，對蛋鴨養殖業危害極大。此病暫無疫苗上市，因此發 現具有較好免疫原性的毒株對于蛋鴨黃病毒病的疫苗研制，預防該病的發生有重大的意 義。

【發明內容】

[0003] 為了克服現有技術的不足，本發明的第一個目的在于提供一種鴨坦布蘇病毒(拉 丁文學名:Duck Tembusu Virus，DTMUV)，該病毒對細胞的適應性強，病毒生產效率高。
[0004] 實現本發明的目的可以通過采取如下技術方案達到：一種鴨坦布蘇病毒，該病毒 命名為鴨坦布蘇病毒⑶HD2014-3;所述病毒于201 6年4月11日保藏于中國典型培養物保藏 中心，地址:湖北省武漢市洪山區八一路武漢大學內，保藏號為CCTCC No: V201621，分類命 名為鴨坦布蘇病毒⑶HD2014-3(拉丁文學名：Duck Tembusu vi rus strain ⑶HD2014-3)， 其序列如序列表SEQ No. 1所示。
[0005] 本發明的第二個目的是為了提供一種治療鴨坦布蘇病毒的疫苗，疫苗中的抗原免 疫原性好，小劑量即可起到效果。
[0006] 實現本發明的目的可以通過采取如下技術方案達到:一種治療鴨坦布蘇病毒的疫 苗，由上述的鴨坦布蘇病毒⑶HD2014-3制備而得。
[0007] 本發明的第三個目的是為了提供一種治療鴨坦布蘇病毒的疫苗的制備方法，可抵 抗發病劑量鴨坦布蘇病毒的攻擊而保持產蛋率維持在92.4%以上。
[0008] 實現本發明的目的可以通過采取如下技術方案達到:如上所述的治療鴨坦布蘇病 毒的疫苗的制備方法，所述的疫苗制備包括以下步驟：
[0009] 1)病毒培養：
[0010]將鴨坦布蘇病毒GDHD2014-3接種至含病毒培養用細胞的培養液中，然后收獲病毒 液并過濾，-20 °C保存備用；
[0011] 2)病毒滅活：
[0012] 將步驟1)獲得的病毒液中加入病毒液體積1000~10000倍體積的甲醛溶液滅活24 ~48h;然后在病毒液中加入硫酸銨，攪勻后在溫度為4°C的條件下沉淀6~8h，5000rpm離心 40min，棄上清，沉淀用滅菌雙蒸水懸浮，裝于透析袋中，于PBS中攪拌透析6~8h，得到純化 的鴨坦布蘇病毒⑶HD2014-3;將病毒lOOOOrpm離心5~lOmin，取上清液為疫苗原液；
[0013] 3)乳化：
[0014]將步驟2)獲得的疫苗原液，與白油佐劑混合進行乳化，獲得鴨坦布蘇病毒 ⑶HD2014-3疫苗。
[0015]作為優選，步驟1)中，所述病毒培養用細胞為ST細胞、Vero細胞或PK15細胞的其中 之一。
[0016] 作為優選，步驟1)中，當培養液的糖分為1~lOmmol，pH值為6.5~7.5時，收獲病毒 液。
[0017] 作為優選，步驟2)中，所述硫酸銨的加入質量與病毒液的體積比為:300~400g/L。
[0018] 作為優選，步驟1)中，所述病毒培養的方法為半灌流式培養方法。
[0019] 作為優選，所述半灌流式培養方法包括以下步驟：
[0020] I)采用雙臂細胞培養裝置進行病毒增殖:將裝有載體的雙臂細胞培養裝置進行高 壓滅菌，然后加入培養液，在4~25°C的條件下培養12~36h后置于37°C水浴中20~30min; 無菌接入病毒培養用細胞，在37°C，5%C0 2的條件下進行細胞擴增培養36~120h;
[0021] Π )更換培養液:每天測定培養液中葡萄糖含量以及pH值，當糖分為1~lOmmol時， pH值為6.5~7.5時，進行培養液更換；
[0022] ΙΠ )病毒接種：當病毒培養用細胞數量達到108~101()個時，接入含鴨坦布蘇病毒 ⑶HD2014-3的尿囊液，在37°C，5%C02的條件下進行病毒擴增培養；
[0023] IV)補充培養液:接毒后每天進行葡萄糖含量以及pH值監測，當培養液中糖分為1 ~lOmmol時，pH值為6.5~7.5時，收集體積10~90%的鴨坦布蘇病毒⑶HD2014-3病毒液，然 后補入等量的新鮮培養液繼續培養；
[0024] V)保存:將步驟IV)收獲的病毒液于-100~_20°C，反復凍融1~5次，凍融后離心 取細胞碎片、過濾，得到用于接種的鴨坦布蘇病毒⑶HD2014-3病毒液，-20°C保存。
[0025] 作為優選，步驟I)中，所述培養液包括體積比1~10%的胎牛血清，體積比1~5% 青鏈霉素，體積比1~5 %的Η印es液。
[0026]作為優選，重復步驟IV)4~6次，將每次的鴨坦布蘇病毒⑶HD2014-3病毒液收集混 合。
[0027]相比現有技術，本發明的有益效果在于：
[0028] 1、本發明提供的鴨坦布蘇病毒GDHD2014-3對細胞適應性強，病毒生產效率高；
[0029] 2、本發明所述的疫苗中的抗原免疫原性好，采用較低濃度病毒制成疫苗即可起到 保護作用，保護率達90%以上；
[0030] 3、本發明所述的半灌流式培養方法將鴨坦布蘇病毒⑶HD2014-3培養4~6代后，病 毒滴度達到10 7'5ELD5Q/mL，而一般的鴨坦布蘇病毒平均需要傳代至少30代才可以達到；
[0031] 4、本發明所述的半灌流式培養方法，降低生產成本，提高病毒生產效率，每培養一 批細胞可以連續收獲4~6次鴨坦布蘇病毒GDH D2014-3病毒液，收獲病毒量為普通培養方 式的2.5倍以上，大大降低了病毒的生產成本。
【附圖說明】
[0032] 圖1為鴨坦布蘇病毒⑶HD2014-3的電鏡圖。
[0033] 本發明所述的鴨坦布蘇病毒⑶HD2014-3,于2016年4月11日保藏于中國典型培養 物保藏中心，地址：湖北省武漢市洪山區八一路武漢大學內，保藏號為CCTCC N〇:V201621， 其序列如序列表SEQ No. 1所示。
【具體實施方式】
[0034]下面，結合附圖以及【具體實施方式】，對本發明做進一步描述：
[0035] 一種鴨坦布蘇病毒，該病毒命名為鴨坦布蘇病毒⑶HD2014-3;所述病毒于2016年4 月11日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏號為CCTCC No:V201621，其序列如序列表SEQ No. 1所示。
[0036] 將鴨坦布蘇病毒⑶HD2014-3用于疫苗的制備，包括以下步驟：
[0037] 一、病毒培養：
[0038]采用半灌流式培養方法對病毒進行培養，
[0039] I)采用雙臂細胞培養裝置進行病毒增殖:將裝有載體的雙臂細胞培養裝置進行高 壓滅菌，然后加入培養液，在4~25°C的條件下培養12~36h后置于37°C水浴中20~30min; 無菌接入Vero細胞，在37°C，5%C02的條件下進行細胞擴增培養36~120h;
[0040] Π )更換培養液:每天測定培養液中葡萄糖含量以及pH值，當糖分為1~lOmmol時， pH值為6.5~7.5時，進行培養液更換；
[0041] ΙΠ)病毒接種：當Vero細胞數量達到108~101()個時，接入含鴨坦布蘇病毒 ⑶HD2014-3的尿囊液，在37°C，5%C0 2的條件下進行病毒擴增培養；
[0042] IV)補充培養液:接毒后每天進行葡萄糖含量以及pH值監測，當培養液中糖分為1 ~lOmmol時，pH值為6.5~7.5時，收集體積10~90%的鴨坦布蘇病毒⑶HD2014-3病毒液，然 后補入等量的新鮮培養液繼續培養；重復步驟IV ) 4~6次，將每次的鴨坦布蘇病毒 ⑶HD2014-3病毒液收集混合；
[0043] V)保存:將步驟IV)收獲的病毒液于-100~_20°C，反復凍融1~5次，凍融后離心 取細胞碎片、過濾，得到用于接種的鴨坦布蘇病毒⑶HD2014-3病毒液，-20°C保存；
[0044] 所述培養液包括體積比1~10%的胎牛血清，體積比1~5%青鏈霉素，體積比1~ 5% 的Hepes液。
[0045] 二、病毒滅活：
[0046] 將步驟一獲得的鴨坦布蘇病毒⑶HD2014-3病毒液中加入病毒液體積1000~10000 倍體積的甲醛溶液滅活24~48h;然后在病毒液中加入質量與病毒液的體積比為：300~ 400g/L的硫酸銨，攪勾后在溫度為4°C的條件下沉淀6~8h，5000rpm離心40min，棄上清，沉 淀用滅菌雙蒸水懸浮，裝于透析袋中，于PBS中攪拌透析6~8h，得到純化的鴨坦布蘇病毒 ⑶HD2014-3;將病毒lOOOOrpm離心5~10min，取上清液為疫苗原液；
[0047] 三、乳化：
[0048] 將步驟二獲得的疫苗原液，與白油佐劑混合進行乳化，獲得鴨坦布蘇病毒 ⑶HD2014-3疫苗。
[0049] 實施例1
[0050] 本實施例用于說明鴨坦布蘇病毒⑶HD2014-3的篩選及鑒定：
[0051 ]自2014年在廣東省不同市蛋鴨養殖場收集發病蛋鴨卵巢RT-PCR陽性的標本，經處 理后接種至7-9日齡的SPF雞胚上，培養2天后，在7天內收集死亡的雞胚，預冷后進行尿囊液 收集，獲得鴨坦布蘇病毒⑶HD2014-3。
[0052] 對該病毒的基因組序列進行分析，全基因序列如序列表SEQ ID No. 1所示，其與 GenBank中已有的鴨坦布蘇病毒的序列相比，核苷酸的同源性在98 %以上。
[0053] 在電鏡下觀察鴨坦布蘇病毒GDHD2014-3,如圖1所示，病毒顆粒直徑范圍在50-150nm，表面有囊膜，囊膜上有纖突，呈四周放射性分布。
[0054]按照《中國獸藥典》方法對該病毒進行無菌、支原體檢查，結果表明無支原體和其 它微生物污染。
[0055] 實施例2
[0056] 本實施例用于說明半灌流式培養方法對病毒進行培養：
[0057] I)采用雙臂細胞培養裝置進行病毒增殖:將裝有載體的雙臂細胞培養裝置進行高 壓滅菌，然后加入培養液，在25 °C的條件下培養24h后置于37 °C水浴中30min;無菌接入Vero 細胞，在37°C，5%C0 2的條件下進行細胞擴增培養36~120h;
[0058] Π )更換培養液:每天測定培養液中葡萄糖含量以及pH值，當糖分為1~lOmmol時， pH值為6.5~7.5時，進行培養液更換；
[0059] ΙΠ)病毒接種：當Vero細胞數量達到108~101()個時，接入含鴨坦布蘇病毒 ⑶HD2014-3的尿囊液，在37°C，5%C0 2的條件下進行病毒擴增培養；
[0060] IV)補充培養液:接毒后每天進行葡萄糖含量以及pH值監測，當培養液中糖分為1 ~lOmmol時，pH值為6.5~7.5時，收集體積40 %的鴨坦布蘇病毒⑶HD2014-3病毒液，然后補 入等量的新鮮培養液繼續培養;重復步驟IV)6次，將每次的鴨坦布蘇病毒GDHD2014-3病毒 液收集混合；
[0061] V)保存：將步驟IV)收獲的病毒液于-20°C，反復凍融5次，凍融后離心取細胞碎 片、過濾，得到用于接種的鴨坦布蘇病毒⑶HD2014-3病毒液，-20 °C保存；
[0062]所述培養液包括體積比10 %的胎牛血清，體積比5 %青鏈霉素，體積比5 %的Hepes 液。
[0063] 對獲得的鴨坦布蘇病毒GDHD2014-3采用雞胚半數致死率法測定該株病毒的病毒 濃度，方法如下:將SPF雞胚孵化至7~9天，將病毒用細胞維持液按梯度以10倍系列從ΚΓ1倍 比稀釋至ΚΓ 8倍，分別將每個稀釋度的病毒液接種100uL/枚，每個稀釋度接種6枚蛋，同時設 空白細胞維持液對照組。置37 °C孵化箱中培養雞胚，2~6天觀察細胞感染病毒情況，記錄死 亡雞胚數量，計算病毒濃度，經測定病毒濃度為107' 5ELD5Q/mL。
[0064] 實施例3
[0065]本實施例用于說明疫苗的制備：
[0066]將實施例2中得到的鴨坦布蘇病毒GDHD2014-3病毒液中加入病毒液體積的1000倍 體積的甲醛溶液滅活24h;然后在病毒液中加入質量與病毒液的體積比為300g/L的硫酸銨， 攪勻后置于溫度為4 °C的條件下沉淀8h，5000rpm離心40min，棄上清，沉淀用滅菌雙蒸水懸 浮，裝于透析袋中，于PBS中攪拌透析8h，得到純化的鴨坦布蘇病毒GDHD2014-3;將病毒 lOOOOrpm離心10min，取上清液為疫苗原液；
[0067]將疫苗原液，與白油佐劑混合進行乳化，獲得鴨坦布蘇病毒⑶HD2014-3疫苗。
[0068] 將得到的鴨坦布蘇病毒GDHD2014-3疫苗進行產蛋鴨免疫效力試驗。將200只產蛋 率為90 %的蛋鴨隨機均分為2組，每組100只，免疫組每只注射0.5mL鴨坦布蘇病毒 GDHD2014-3疫苗，另外一組注射生理鹽水作為空白對照組。疫苗注射后的20天內記錄兩組 每天產蛋率以及采食量，作為基礎產蛋率和基礎采食量對照，結果如表1所示。20天后，試驗 組和對照組中每只蛋鴨均注射等量的鴨坦布蘇病毒⑶HD2014-3進行人工發病，分別記錄兩 組攻毒后15天內每天產蛋情況，結果如表2所示。
[0069]表1注射疫苗后的產蛋率
[0072]表2進行人工發病后的產蛋率 [0073]
[0070]
[0071]
[0074] ~從表2可以看出，使用本發明鴨坦布蘇病毒GDHD2014-3制備的疫苗可抵抗發病劑, 量鴨黃病毒的攻擊而保持產蛋率維持在92.4%以上。這一結果表明，使用鴨坦布蘇病毒 GDHD2014-3制備的疫苗對于產蛋鴨具有較好的保護效果，可以抵御鴨黃病毒的感染。
[0075] 對于本領域的技術人員來說，可根據以上描述的技術方案以及構思，做出其它各 種相應的改變以及變形，而所有的這些改變以及變形都應該屬于本發明權利要求的保護范 圍之內。
【主權項】
1. 一種鴨坦布蘇病毒，其特征在于:該病毒命名為鴨坦布蘇病毒GDHD2014-3;所述病毒 于2016年4月11日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏號為CCTCC No:V201621。2. -種治療鴨坦布蘇病毒的疫苗，其特征在于：由權利要求1所述的鴨坦布蘇病毒 ⑶HD2014-3制備而得。3. 如權利要求2所述的治療鴨坦布蘇病毒的疫苗的制備方法，其特征在于包括以下步 驟： 1) 病毒培養： 將鴨坦布蘇病毒GDHD2014-3接種至含病毒培養用細胞的培養液中，然后收獲病毒液并 過濾，-20 °C保存備用； 2) 病毒滅活： 將步驟1)獲得的病毒液中加入病毒液體積1 〇〇〇~1 〇〇〇〇倍體積的甲醛溶液滅活24~ 48h;然后在病毒液中加入硫酸銨，攪勻后在溫度為4°C的條件下沉淀6~8h，5000rpm離心 40min，棄上清，沉淀用滅菌雙蒸水懸浮，裝于透析袋中，于PBS中攪拌透析6~8h，得到純化 的鴨坦布蘇病毒⑶HD2014-3;將病毒lOOOOrpm離心5~lOmin，取上清液為疫苗原液； 3) 乳化： 將步驟2)獲得的疫苗原液，與白油佐劑混合進行乳化，獲得鴨坦布蘇病毒GDHD2014-3 疫苗。4. 如權利要求3所述的治療鴨坦布蘇病毒的疫苗的制備方法，其特征在于：步驟1)中， 所述病毒培養用細胞為ST細胞、Vero細胞或PK15細胞的其中之一。5. 如權利要求3所述的治療鴨坦布蘇病毒的疫苗的制備方法，其特征在于：步驟1)中， 當培養液的糖分為1~lOmmol，pH值為6.5~7.5時，收獲病毒液。6. 如權利要求3所述的治療鴨坦布蘇病毒的疫苗的制備方法，其特征在于：步驟2)中， 所述硫酸銨的加入質量與病毒液的體積比為:300~400g/L。7. 如權利要求3所述的治療鴨坦布蘇病毒的疫苗的制備方法，其特征在于：步驟1)中， 所述病毒培養的方法為半灌流式培養方法。8. 如權利要求7所述的治療鴨坦布蘇病毒的疫苗的制備方法，其特征在于:所述半灌流 式培養方法包括以下步驟： I)采用雙臂細胞培養裝置進行病毒增殖:將裝有載體的雙臂細胞培養裝置進行高壓滅 菌，然后加入培養液，在4~25°C的條件下培養12~36h后置于37°C水浴中20~30min;無菌 接入病毒培養用細胞，在37°C，5%C0 2的條件下進行細胞擴增培養36~120h; Π )更換培養液:每天測定培養液中葡萄糖含量以及pH值，當糖分為1~1 Ommo 1時，pH值 為6.5~7.5時，進行培養液更換； ΙΠ )病毒接種：當病毒培養用細胞數量達到108~101()個時，接入含鴨坦布蘇病毒 ⑶HD2014-3的尿囊液，在37°C，5%C02的條件下進行病毒擴增培養； IV) 補充培養液：接毒后每天進行葡萄糖含量以及pH值監測，當培養液中糖分為1~ lOmmol時，pH值為6.5~7.5時，收集體積10~90%的鴨坦布蘇病毒⑶HD2014-3病毒液，然 后補入等量的新鮮培養液繼續培養； V) 保存:將步驟IV)收獲的病毒液于-100~-20°C，反復凍融1~5次，凍融后離心取細 胞碎片、過濾，得到用于接種的鴨坦布蘇病毒⑶HD2014-3病毒液，-20 °C保存。9. 如權利要求8所述的治療鴨坦布蘇病毒的疫苗的制備方法，其特征在于：步驟I)中， 所述培養液包括體積比1~10 %的胎牛血清，體積比1~5 %青鏈霉素，體積比1~5 %的 Hepes液。10. 如權利要求8所述的治療鴨坦布蘇病毒的疫苗的制備方法，其特征在于：重復步驟 IV)4~6次，將每次的鴨坦布蘇病毒⑶HD2014-3病毒液收集混合。
【文檔編號】A61P31/14GK106085965SQ201610395224
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月3日 公開號201610395224.6, CN 106085965 A, CN 106085965A, CN 201610395224, CN-A-106085965, CN106085965 A, CN106085965A, CN201610395224, CN201610395224.6
【發明人】馮曉聲, 王偉, 王貴平, 羅夢萍
【申請人】廣東海大畜牧獸醫研究院有限公司