基于dc的腫瘤治療性疫苗及其制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物工程和生物醫藥領域，特別涉及一種基于DC的腫瘤治療性疫苗及 其制備方法。
【背景技術】
[0002] 腫瘤是來源于神經上皮的腫瘤，是顱內最常見的惡性腫瘤，約占全部顱內腫瘤的 40-50 %，以發病率高、復發率高、致死率高，成為腫瘤治療的難題。傳統治療方法主要是手 術和放化療來提高患者的生存機率。但是位于重要功能區的膠質瘤很難做到全切除。放射 治療幾乎是各型膠質瘤的常規治療，但療效評價不一，除髓母細胞瘤對放療高度敏感，室管 膜瘤中度敏感外，其他類型對放療均不敏感。化療藥物限于血腦屏障及藥物的毒副作用，療 效尚不肯定。近年來，免疫治療成為腦膠質瘤繼手術、放化療后的有效治療手段。與其他方 式聯合應用，具體有很強的互補作用，對患者受損的免疫系統能夠起到恢復與重建的獨特 療效，從而進一步防止腫瘤的復發和轉移。
[0003] 目前現有技術中，普遍采用腫瘤細胞滅活后刺激DC細胞，該種方法制備的DC治療 性疫苗有許多缺陷，如：由于腫瘤細胞攜帶的抗原信息相對于攜帶腫瘤全面抗原信息的多 種腫瘤細胞分秘釋放到細胞外的基質來說不夠完善且全面，因此導致了引發的免疫反應較 弱，殺瘤能力不強等問題。

【發明內容】

[0004] 本發明所要解決的技術問題是，針對現有技術中腫瘤疫苗存在免疫反應弱、殺瘤 能力差等缺陷，提供一種免疫原性及特異性強的基于DC的腫瘤治療性疫苗及其制備方法。
[0005] 本發明解決其技術問題所采用的技術方案是:提供一種基于DC的腫瘤治療性疫苗 的制備方法，所述制備方法包括以下步驟：
[0006] 獲取未成熟DC;
[0007] 加入腫瘤細胞分泌的膜囊泡與未成熟DC于培養基中進行共培養；
[0008] 再加入腫瘤壞死因子-α和白介素-1繼續培養2~4天，至DC成熟且負載有所述膜囊 泡。
[0009] 在本發明提供的基于DC的腫瘤治療性疫苗的制備方法中，所述DC的濃度為(2~5) X105 個/ml。
[0010] 在本發明提供的基于DC的腫瘤治療性疫苗的制備方法中，所述DC的獲取過程包括 以下步驟：
[0011] 取外周血，稀釋后加入淋巴細胞分離液和抗凝血，離心后取白色渾濁層，離心棄上 清，即分離出單個核細胞，加入體外誘導培養液對單個核細胞進行培養48~96小時，半量換 液，至單個核細胞誘導分化成DC。
[0012] 在本發明提供的基于DC的腫瘤治療性疫苗的制備方法中，所述體外誘導培養液為 含有5 %~15 %胎牛血清、粒-巨噬細胞和白介素-4的基礎培養基。
[0013] 在本發明提供的基于DC的腫瘤治療性疫苗的制備方法中，所述膜囊泡的濃度為 100~400μg/ml。
[0014] 在本發明提供的基于DC的腫瘤治療性疫苗的制備方法中，所述腫瘤細胞分泌的膜 囊泡的獲取過程包括以下步驟：
[0015] 取腫瘤細胞進行傳代培養至細胞融合至80 %以上時，去除培養基后，進行清洗，消 化至細胞變圓，補充培養基，進行培養;待細胞長至80%以上時，傾去培養基，加入無血清培 養基，12~36小時后收集培養基上清，離心，過濾，取濾液再次離心后，加入去離子水進行超 濾離心，提取超濾后的濃縮液，即收獲膜囊泡。
[0016] 在本發明提供的基于DC的腫瘤治療性疫苗的制備方法中，所述膜囊泡細胞與未成 熟DC共培養時所采用的培養基為含有粒-巨噬細胞因子和白介素-4的基礎培養基。
[0017] 在本發明提供的基于DC的腫瘤治療性疫苗的制備方法中，所述腫瘤壞死因子-α在 培養基中的終濃度為l-l〇ng/ml、白介素-1在培養基中的終濃度為5-15ng/ml。
[0018] 在本發明提供的基于DC的腫瘤治療性疫苗的制備方法中，所述腫瘤細胞為胰腺 癌、肺癌、乳腺癌、胃癌或肝癌腫瘤細胞。
[0019] 本發明還提供一種基于DC的腫瘤治療性疫苗，由上述基于DC的腫瘤治療性疫苗制 備方法所獲得。
[0020] 實施本發明提供的基于DC的腫瘤治療性疫苗及其制備方法，可以達到以下有益效 果:通過本發明獲得的基于DC的腫瘤治療性疫苗不僅性狀較穩定，而且免疫原性及特異性 較強，殺瘤能力較強，能夠很好的調節腫瘤的機體免疫機制，改善腫瘤引起的肝臟免疫耐受 的現象。
【具體實施方式】
[0021] 為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合實施例，對本發明 進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅用以解釋本發明，并不用于限 定本發明。
[0022] 本發明提供的一種基于DC的腫瘤治療性疫苗，其制備方法包括以下步驟：
[0023] S1、獲取未成熟DC;
[0024] S2、加入腫瘤細胞分泌的膜囊泡與未成熟DC共培養7~14天；
[0025] S3、再加入腫瘤壞死因子-α和白介素-1繼續培養2~4天，至DC成熟且腫瘤細胞的 膜囊泡負載至DC上。
[0026]步驟S1中，未成熟DC可來源于人體血液，但由于未成熟DC在血液中僅占單核細胞 總數的0.5-1.0%，數量很少；因此，本發明優選實施例中，采取誘導單核細胞的方式獲取未 成熟DC，具體步驟為：
[0027] S11、從外周血中分離出單核細胞；
[0028] S12、再加入體外誘導培養液培養48~96h，對步驟S11中獲得的單核細胞進行培 養；
[0029] S13、用體外誘導培養液進行半量換液，并將步驟S12中擴增后的單核細胞定向誘 導分化成樹突狀細胞。
[0030] 在步驟S11中，單核細胞可以為⑶34+和/或⑶14+單核細胞，其中，CD34+單核細胞可 以從骨髓、臍帶血或脾臟等分離得到；CD14+細胞從人外周血分離得到的。由于從臍帶血中 純化出CD34+單核細胞費用昂貴;骨髓采集不易，而且容易污染，患者比較痛苦，擴增費用昂 貴;而脾臟來源受限等使得CD34+單核細胞獲取較困難;因此，在本發明中，優選采用從人外 周新鮮血液中分離篩選出CD 14+單核細胞，從新鮮血液中獲取，相比經過冷庫儲存或者培養 傳代之后的CD14+單核細胞，從新鮮血液中提取的CD14+單核細胞離體時間不長，其細胞活性 和狀態的減弱或者形態改變程度都較少，更加利于獲取DC。
[0031 ]⑶14+單核細胞從人外周血分離的過程為：
[0032] 取人外周血，稀釋后，加入淋巴細胞分離液，之后再加入抗凝血，離心后取白色渾 濁層，離心棄上清，即可分離出⑶14+單核細胞，PBS溶液洗滌后，用基礎培養基培養1~3小 時，收集貼壁細胞即⑶14+單核細胞。
[0033]步驟S12和步驟S13中的體外誘導培養液優選為適宜于DC生長的含5%~15%胎牛 血清、700~900U/mL粒-巨噬細胞和800~1200U/mL白介素 -4的基礎培養基。需要特別注意 的是，由于DC相比非貼壁細胞其能具有貼壁性，但是其貼壁性能并不強，而是偏向于半貼壁 的類型，因此在步驟S13中單個核細胞的培養過程中需采用半量換液，以避免將目的DC吹成 懸浮而流失。
[0034]當然可以理解的是，本發明獲得未成熟DC的途徑也并不局限于此，通過其他誘導 方法誘導單核細胞獲得的未成熟DC同樣適用于本發明。
[0035] 在步驟S2中，優選地，采用含有700~900U/mL粒-巨噬細胞因子和800~1200U/mL 白介素-4的培養基上進行DC與腫瘤細胞的膜囊泡共培養，不僅有利于DC的生長增殖，而且 有利于DC攝取膜囊泡所攜帶的抗原信息。由于DC有簇狀生長的習慣，濃度太高，集結成團， 位于中心的DC不易成熟，影響腫瘤抗原的負載，從而影響疫苗的免疫效果，因此，DC濃度不 易過高，在該步驟中，待未成熟DC在培養基中的濃度為(2~5) X 105個/ml或將步驟S1獲得 未成熟DC的濃度調整為(2~5) X 105個/ml時，加入腫瘤細胞的膜囊泡進行預負載。
[0036]由于未成熟DC表達能介導DC攝取抗原的一些膜受體如Fc受體，因而相比成熟DC擁 有更強的抗原攝取、加工和處理能力，因此，步驟S2中利用未成熟DC與腫瘤細胞的膜囊泡共 培養能夠實現膜囊泡的預負載，促進并提高膜囊泡負載量，同時，未成熟DC經抗原致敏可至 成熟。
[0037]膜囊泡是由活細胞分泌的來源于多囊體的膜被囊泡，其直徑約60~100nm，其釋放 收到細胞骨架和生物機械力的影響，在正常細胞和惡性腫瘤細胞中起著傳遞信息的作用； 膜囊泡在其表面表達著大量范圍廣泛的生物活性物質、膜嵌合受體以及黏附分子，為其與 不同的靶細胞進行特定的相互作用和信息交換提供基礎，且膜囊泡內包含有豐富的細胞因 子、趨化因子、各種蛋白質、生物酶類、MHCI類和/或Π 類分子、micr〇RNA、mRNA等。而腫瘤細 胞來源的膜囊泡中富含有抗原遞呈分子、熱休克蛋白和腫瘤細胞特異性抗原等反應腫瘤信 息的蛋白，能夠將腫瘤抗原轉移給DC，交叉遞呈抗原到MHCI分子上，從而導致CTL的活化，產 生有效的保護性和治療性效應，并且這種抗瘤效應能跨越組織和MHC限制，因此，可將腫瘤 細胞分泌的膜囊泡作為DC的刺激物，使得負載了腫瘤抗原信息的DC細胞成為能夠靶向特定 腫瘤的DC腫瘤治療性疫苗。在本發明中，腫瘤細胞可以是胰腺癌、肺癌、乳腺癌、胃癌、肝癌 等腫瘤細胞。
[0038]腫瘤細胞膜囊泡的提取過程具體包括以下步驟：
[0039] S21、復溶腫瘤細胞；
[0040] S22、取步驟S21復溶后的腫瘤細胞進行擴增培養至細胞融合至80%以上；
[0041 ] S23、對步驟S22中擴增后的腫瘤細胞進行傳代培養；
[0042]取步驟S22獲得的腫瘤細胞，PBS清洗后，加入細胞消化液消化至細胞變圓，加入培 養液終止消化，獲得細胞懸液，離心，補充培養基進行傳代培養至細胞生長至80 %以上融 合。
[0043] S24、用無血清培養基繼續培養步驟S23獲得的傳代細胞12~36小時后，收集無血 清培養基；
[0044] 取步驟S23傳代后獲得的細胞，用無血清培養基進行培養12~36小時后收集培養 基上清，離心后過濾，獲得純化后的無血清培養基。
[0045] S25、從步驟S24純化后的無血清培養基中提取膜囊泡；
[0046] 取純化后的無血清培養基離心棄上清，加入PBS溶解后，再加入去離子水，超濾離 心，最終獲得膜囊泡的濃縮液。優選地，膜囊泡的濃度為1 〇〇~400μg/ml。
[0047]在步驟S3中，由于DC細胞成熟后會分泌白介素-1，因此，在該步驟中，優先采用白 介素-1來促進DC細胞的成熟，起到反饋誘導的作用。白介素-1由活化的巨噬細胞所產生，機 體免疫細胞受抗原刺激后產生;而腫瘤壞死因子由體內免疫細胞(如T淋巴細胞、T細胞雜 交瘤、Τ淋巴樣細胞系以ΝΚ細胞等)分泌的一種單核因子，由于白介素-1和腫瘤壞死因子-α 由不同細胞產生，因此，同時添加白介素-1和腫瘤壞死因子對未成熟DC的刺激影響作用 較強，能夠提高膜囊泡的負載率，并且能夠穩定DC的抗原提呈性的同時促進DC成熟;優選 地，腫瘤壞死因子-α在