一種疫苗組合物及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于獸用生物制品領域，具體地涉及一種預防和治療副豬嗜血桿菌相關疾 病的疫苗組合物、制備方法及應用。
【背景技術】
[0002] 副豬嗜血桿菌病是副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis, Hps)引起的豬的多發 性漿膜炎和關節炎，該病又稱為豬革拉澤氏病（Glsser' s Disease)。在大量分離副豬嗜 血桿菌的基礎上，發現該菌的血清型復雜多樣，按Kieletein-Rapp-Gabriedson(KRG)瓊 脂擴散血清分型方法，至少可將副豬嗜血桿菌分為15個血清型；根據我國血清流行病學調 查和分離菌株的鑒定，以4、5型最為流行。
[0003] 采用疫苗進行免疫預防是國內外控制副豬嗜血桿菌病的根本手段，而市場銷售的 商品疫苗只有副豬嗜血桿菌病滅活疫苗（血清4型MD0322+血清5型SH0165)、副豬嗜血桿 菌病滅活疫苗（Z-1517株）、副豬嗜血桿菌病滅活疫苗（血清1型SV1+血清6型SV6)，這 些疫苗的應用起到了一定的預防作用，但這些滅活疫苗一般由2個或者3個血清型的地方 流行菌株制備而成，隨著病原流行株和不同血清型之間缺乏交叉保護已經使現有疫苗很難 達到預期的免疫效果，而且市售商品疫苗需多次免疫，成本較高，對豬只的應激較大，因此， 需要發明一種新型的能有效抵抗多種血清型的副豬嗜血桿菌毒株的疫苗以解決上述問題。

【發明內容】

[0004] 為了解決現有技術的不足，本發明的主要目的在于克服現有技術缺陷，提供一種 用于預防和/或治療副豬嗜血桿菌病的疫苗組合物，包含四種副豬嗜血桿菌免疫保護性抗 原和佐劑。
[0005] 本發明的第一方面在于一種疫苗組合物，其中，所述疫苗組合物包括免疫量的副 豬嗜血桿菌TbpA、CdtB、0mpP2、VtaA抗原蛋白以及藥學上的載體。
[0006] 本發明提供的預防和/或治療副豬嗜血桿菌病的疫苗組合物包含的副豬嗜血桿 菌免疫保護性抗原為TbpA、CdtB、0mpP2、VtaA蛋白。
[0007] 本發明從副豬嗜血桿菌地方分離株ZJ菌株（菌株來源參見實施例1)中分別克隆 到TbpA、CdtB、0mpP2、VtaA基因。經過測序發現TbpA、CdtB、0mpP2、VtaA蛋白基因編碼區 分別由 2703bp、834bp、1077bp和 2862bp個堿基組成，具有序列表SEQIDN0:l~4所示的 核苷酸序列。經過序列分析發現其編碼的蛋白rTbpA、rCdtB、r0mpP2、rVtaA分別有901、 278、359、954個氨基酸殘基組成，具有序列表SEQ ID N0:5~8所示的氨基酸序列，去掉信 號肽部分之后表達蛋白預計分子量大小為11、33、43、111?&。通過原核表達和實驗室試驗證 實本發明的rTbpA、rCdtB、r0mpP2、rVtaA蛋白，能夠對副豬嗜血桿菌感染具有保護作用，且 意外的發現四種蛋白可以對血清4型、5型、12型具有交叉保護，預示著可以研制副豬嗜血 桿菌亞單位疫苗。
[0008] 本發明提供的上述基因序列是副豬嗜血桿菌的具有免疫原性的四種蛋白基因 (TbpA、CdtB、0mpP2、VtaA)，該蛋白還可以應用對于副豬嗜血桿菌亞單位疫苗和診斷試劑研 制中。
[0009] 作為本發明的一種實施方式，在本發明的疫苗組合物中，所述副豬嗜血桿菌TbpA 蛋白序列為SEQ ID NO:5編碼的氨基酸序列；所述副豬嗜血桿菌CdtB蛋白序列為SEQ ID N0:6編碼的氨基酸序列；所述副豬嗜血桿菌0mpP2蛋白序列為SEQ ID N0:7編碼的氨基酸 序列；所述副豬嗜血桿菌VtaA蛋白序列為SEQ ID N0:8編碼的氨基酸序列。
[0010] 本發明提供的預防和/或治療副豬嗜血桿菌病的疫苗組合物包含的副豬嗜血桿 菌免疫保護性抗原TbpA蛋白、CdtB蛋白、0mpP2蛋白、VtaA蛋白還可以是與其功能衍生物 基本相同的氨基酸序列的多肽。
[0011] 本發明涉及的副豬嗜血桿菌多肽，其有利地激發動物中的保護性反應。具體地，本 發明實施方式的多肽包含與其功能衍生物基本相同的氨基酸序列。
[0012] 如本文一般理解和使用，"功能性片段"指編碼與完整核酸序列的生物活性基本相 似的功能生物活性的核酸序列。換言之，在本發明的上下文中，其優選地指基本上保留了編 碼這樣的多肽/蛋白質能力的核酸或其片段，所述多肽/蛋白質當施用于動物時，激發針對 副豬嗜血桿菌菌株攻擊的免疫應答，和更優選地保護性反應。
[0013] 當指氨基酸序列時，"基本上相同"可以理解為本發明的多肽優選地具有這樣的氨 基酸序列，其與SEQ ID NO :5-8中所示的序列的部分或全部具有至少70%同源性，或甚至 優選地80%同源性，或甚至更優選地90%同源性，或最優選地95%同源性。
[0014] 在本文中術語"同源性"還包括與參比序列相同或類似，同時提供任何氨基酸的簡 單替換/修飾。可以用BLAST-P (基本局部排比檢索工具），本領域技術人員公知的程序進 行該方面的同源性檢索。對于相應的核酸序列，同源性涉及在本領域中已知的BLASTX和 BLASTN 程序。
[0015] 術語"功能衍生物"指具有與完整蛋白/肽序列的生物活性基本類似的功能生物 活性的蛋白/肽序列。換言之，其優選地指當將所述功能衍生物施用于動物時，基本上保留 了激發免疫應答，如針對副豬嗜血桿菌菌株攻擊的保護性反應的能力的多肽或其片段。
[0016] 術語"片段"指這樣的多核苷酸序列，其是人工構建（例如通過化學合成）或通過 將天然產物裂解成多個小片段（使用限制性內切酶，或機械剪切）構建的本發明核酸的分 離的部分，或通過PCR、DNA聚合酶或本領域公知的任何其他聚合技術合成的核酸的部分， 或通過本領域技術人員公知的重組核酸技術在宿主細胞中表達的核酸部分。
[0017] 作為本發明的一種優選實施方式，在本發明的疫苗組合物中，所述副豬嗜血桿菌 TbpA蛋白序列為SEQ ID NO: 1編碼的核苷酸序列；所述副豬嗜血桿菌CdtB蛋白序列為SEQ ID N0:2編碼的核苷酸序列；所述副豬嗜血桿菌0mpP2蛋白序列為SEQ ID N0:3編碼的核 苷酸序列；所述副豬嗜血桿菌VtaA蛋白序列為SEQ ID N0:4編碼的核苷酸序列。
[0018] 作為本發明的一種實施方式，在本發明的疫苗組合物中，所述副豬嗜血桿菌TbpA、 CdtB、0mpP2、VtaA 抗原蛋白含量分別為 100-200 μ g/ml。
[0019] 本發明的組合物的成分或組分的量優選地是治療有效量。所述治療有效量是指在 組合物施用的宿主中發揮它們的免疫學作用而不導致過度副作用所必需量。所用的成分 和待施用的組合物的精確的量將根據因素如治療的疾病的類型，待治療的動物的類型和年 齡，施用的方式，以及組合物中的其它成分而變化。
[0020] 優選地，對于動物豬而言，本發明疫苗組合物TbpA蛋白抗原含量為100-200 μ g/ ml ;CdtB蛋白抗原含量為100-200μ g/ml ;0mpP2蛋白抗原含量為100-200μ g/ml ;VtaA蛋 白抗原含量為100-200 μ g/ml。
[0021] 更優選地，所述疫苗組合物TbpA蛋白抗原含量為150 μ g/ml ;CdtB蛋白抗原含量 為150 μ g/ml ;0mpP2蛋白抗原含量為150 μ g/ml ;VtaA蛋白抗原含量為150 μ g/ml。
[0022] 作為本發明的一種優選實施方式，在本發明的疫苗組合物中，所述副豬嗜血桿菌 TbpA、CdtB、0mpP2、VtaA 抗原蛋白含量分別為 150μ g/ml。
[0023] 作為本發明的一種實施方式，在本發明的疫苗組合物中，所述副豬嗜血桿菌TbpA、 CdtB、0mpP2、VtaA抗原蛋白含量比例為1:1:1:1。
[0024] 作為本發明的一種實施方式，在本發明的疫苗組合物中，所述疫苗組合物還包括 佐劑，所述佐劑包括氫氧化錯膠佐劑、Montanide GEL 01、Montanide PET GEL A、Montanide 頂S 1313、蜂膠、CpG-ODN佐劑、細胞因子、單磷酰基脂質（MPIA)。
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