本發明屬于(yu)動物疾病(bing)防治技術領域，尤其(qi)涉(she)(she)及一種(zhong)(zhong)水貂出(chu)血性肺炎滅活疫苗制備(bei)方(fang)法，還(huan)涉(she)(she)及一種(zhong)(zhong)上述制備(bei)方(fang)法所制得的滅活疫苗，還(huan)涉(she)(she)及一種(zhong)(zhong)上述滅活疫苗的應用。

背景技術：

水(shui)貂(diao)出血性肺(fei)炎(yan)是(shi)由銅綠假(jia)單胞菌(jun)(又稱(cheng)綠膿桿菌(jun)，Pseudomonas aeruginosa)感染引起的(de)(de)一種高度致死性傳染病(bing)，又稱(cheng)銅綠假(jia)單胞菌(jun)肺(fei)炎(yan)，多(duo)發于每年(nian)7至9月(yue)份，以(yi)水(shui)貂(diao)出血性肺(fei)炎(yan)、敗血癥為主(zhu)要特(te)征，發病(bing)急，死亡(wang)快，常呈(cheng)地(di)方性暴發流行，致死率極高。本病(bing)世界(jie)各地(di)均有發生，是(shi)危害水(shui)貂(diao)養殖業的(de)(de)重要傳染病(bing)之一。該菌(jun)可通過患病(bing)水(shui)貂(diao)形成(cheng)的(de)(de)飛沫及(ji)氣溶(rong)膠傳播，以(yi)呼吸困難、口鼻出血、突發性死亡(wang)為主(zhu)要特(te)征，死后典型(xing)癥狀(zhuang)為口鼻流出血樣泡沫，剖(pou)檢肺(fei)臟呈(cheng)彌漫性出血。

銅(tong)綠(lv)假(jia)單(dan)胞(bao)(bao)菌(jun)(jun)(jun)，又稱(cheng)綠(lv)膿桿(gan)菌(jun)(jun)(jun)，屬(shu)于γ變性(xing)(xing)(xing)菌(jun)(jun)(jun)門假(jia)單(dan)胞(bao)(bao)菌(jun)(jun)(jun)科，為(wei)需氧或兼(jian)性(xing)(xing)(xing)厭氧菌(jun)(jun)(jun)的革蘭氏陰性(xing)(xing)(xing)桿(gan)菌(jun)(jun)(jun)。目(mu)前對(dui)銅(tong)綠(lv)假(jia)單(dan)胞(bao)(bao)菌(jun)(jun)(jun)分(fen)型(xing)(xing)常用(yong)方法是(shi)血(xue)清(qing)(qing)學分(fen)型(xing)(xing)，國際血(xue)清(qing)(qing)分(fen)型(xing)(xing)系統根(gen)據菌(jun)(jun)(jun)體O抗原將(jiang)其分(fen)為(wei)20個不同的血(xue)清(qing)(qing)型(xing)(xing)。日本科學家Homma根(gen)據O抗原將(jiang)銅(tong)綠(lv)假(jia)單(dan)胞(bao)(bao)菌(jun)(jun)(jun)分(fen)為(wei)A～N群，并(bing)且(qie)根(gen)據此(ci)系統形成的試劑盒在(zai)國際社(she)會(hui)形成廣泛應用(yong)。銅(tong)綠(lv)假(jia)單(dan)胞(bao)(bao)菌(jun)(jun)(jun)為(wei)條件(jian)致(zhi)病菌(jun)(jun)(jun)，廣泛存在(zai)于環境中(zhong)，接種疫(yi)苗(miao)是(shi)預防(fang)該病的有效方法，同時(shi)避免了(le)使用(yong)抗生素導致(zhi)菌(jun)(jun)(jun)株產生耐藥性(xing)(xing)(xing)。目(mu)前銅(tong)綠(lv)假(jia)單(dan)胞(bao)(bao)菌(jun)(jun)(jun)疫(yi)苗(miao)主(zhu)要(yao)針(zhen)對(dui)人醫領(ling)(ling)域(yu)，在(zai)獸醫領(ling)(ling)域(yu)較少(shao)，而(er)且(qie)針(zhen)對(dui)水(shui)(shui)貂(diao)出(chu)血(xue)性(xing)(xing)(xing)肺(fei)炎的滅(mie)活疫(yi)苗(miao)僅僅局限于區域(yu)流(liu)行B型(xing)(xing)G型(xing)(xing)的二聯苗(miao)。因此(ci)開發出(chu)一種免疫(yi)范圍(wei)廣的水(shui)(shui)貂(diao)出(chu)血(xue)性(xing)(xing)(xing)肺(fei)炎肺(fei)炎疫(yi)苗(miao)以解決血(xue)清(qing)(qing)型(xing)(xing)問題、減少(shao)免疫(yi)接種次數從而(er)減少(shao)免疫(yi)應急具有重要(yao)的現實意義和經濟意義。

技術實現要素：

本發明的目的之一是(shi)提(ti)供一種免疫范(fan)圍廣(guang)的水貂出血性肺炎滅活(huo)疫苗(miao)的制備方(fang)法。

為了解(jie)決上述技(ji)術(shu)問題，本發明采用(yong)以下技(ji)術(shu)方(fang)案：一種水(shui)貂出血性肺炎(yan)滅活疫苗制備方(fang)法，包括以下步驟：

(1)培(pei)(pei)養分離(li)鑒定的(de)銅綠假(jia)單胞菌(jun)(jun)(jun)(jun)強毒株ZHDL9：將分離(li)鑒定的(de)銅綠假(jia)單胞菌(jun)(jun)(jun)(jun)強毒株ZHDL9接種(zhong)于LB瓊脂培(pei)(pei)養基，無菌(jun)(jun)(jun)(jun)環(huan)境下挑選單菌(jun)(jun)(jun)(jun)落于液體培(pei)(pei)養基中，培(pei)(pei)養至細菌(jun)(jun)(jun)(jun)培(pei)(pei)養液在OD600處的(de)吸光(guang)(guang)度值為0.6～0.8之間，再37℃擴大培(pei)(pei)養12h，然(ran)后25℃避(bi)光(guang)(guang)靜止培(pei)(pei)養三天以上直(zhi)至呈綠色熒(ying)光(guang)(guang)；

(2)滅活處(chu)理：向(xiang)銅綠(lv)假(jia)單(dan)胞菌(jun)菌(jun)液(ye)中緩(huan)慢加入甲醛滅活，邊加入邊震(zhen)蕩，使其充分混勻，直至甲醛溶液(ye)的終濃度(du)為菌(jun)液(ye)體積總量的0.4％，置(zhi)于37°搖(yao)床(chuang)震(zhen)蕩處(chu)理，搖(yao)床(chuang)轉速160-180r/min，滅活處(chu)理72小時(shi)，涂板檢驗菌(jun)液(ye)是否徹底滅活；

(3)配(pei)苗：將滅活檢驗合格的(de)銅綠(lv)假單胞菌(jun)強毒株ZHDL9菌(jun)液(ye)(ye)離心，取上(shang)清液(ye)(ye)，向上(shang)清液(ye)(ye)中(zhong)加入飽和硫酸銨溶液(ye)(ye)，使上(shang)清液(ye)(ye)中(zhong)的(de)蛋(dan)(dan)白質(zhi)沉淀(dian)(dian)，離心，取沉淀(dian)(dian)的(de)蛋(dan)(dan)白質(zhi)，將沉淀(dian)(dian)的(de)蛋(dan)(dan)白質(zhi)用(yong)無菌(jun)生理(li)鹽水(shui)溶解，調整多(duo)組(zu)份蛋(dan)(dan)白濃度(du)為(wei)500ug/ml，加入佐劑，4度(du)過夜(ye)，即得。

銅綠假單胞菌強毒株ZHDL9是通(tong)過(guo)大連瓦(wa)房店水貂養殖區臨床分離得(de)到(dao)(任何公眾均(jun)可(ke)通(tong)過(guo)常規(gui)手段分離獲(huo)得(de))，這是通(tong)過(guo)提(ti)取測序比對(dui)得(de)知。

本發明中，上清液疫(yi)苗的(de)蛋(dan)白濃度是通過(guo)BCA蛋(dan)白定量試劑盒檢測，BCA蛋(dan)白定量試劑盒購自Thermo公(gong)司。

為(wei)(wei)檢驗(yan)本發明的(de)(de)步驟(zou)(1)所得的(de)(de)銅綠假單胞菌強毒株ZHDL9的(de)(de)上(shang)清(qing)液的(de)(de)毒性情(qing)況(kuang)，將離心的(de)(de)上(shang)清(qing)液0.05ml小鼠(shu)皮下多點注射，實驗(yan)結果(guo)為(wei)(wei)小鼠(shu)3天后均出現死亡。通(tong)過(guo)蛋(dan)白(bai)電泳可以觀察到離心的(de)(de)上(shang)清(qing)液中有(you)多種組分蛋(dan)白(bai)。

將本發(fa)明(ming)步驟(zou)(zou)(2)所(suo)得(de)的(de)(de)滅(mie)(mie)活(huo)(huo)(huo)(huo)后(hou)的(de)(de)上(shang)清(qing)(qing)液(ye)(ye)(ye)室溫培(pei)養(yang)72小(xiao)時后(hou)取適(shi)(shi)量(liang)滅(mie)(mie)活(huo)(huo)(huo)(huo)后(hou)的(de)(de)上(shang)清(qing)(qing)液(ye)(ye)(ye)涂布LB固體培(pei)養(yang)基，檢驗(yan)是(shi)否有銅綠(lv)假(jia)(jia)單胞菌存(cun)活(huo)(huo)(huo)(huo)。將本發(fa)明(ming)步驟(zou)(zou)(2)所(suo)得(de)的(de)(de)滅(mie)(mie)活(huo)(huo)(huo)(huo)后(hou)的(de)(de)上(shang)清(qing)(qing)液(ye)(ye)(ye)室溫培(pei)養(yang)72小(xiao)時后(hou)取適(shi)(shi)量(liang)滅(mie)(mie)活(huo)(huo)(huo)(huo)后(hou)的(de)(de)上(shang)清(qing)(qing)注射到昆明(ming)小(xiao)鼠(shu)腿部肌(ji)肉，檢測(ce)上(shang)清(qing)(qing)液(ye)(ye)(ye)中的(de)(de)毒(du)素(su)蛋白(bai)是(shi)否完全(quan)滅(mie)(mie)活(huo)(huo)(huo)(huo)。結果表明(ming)，本發(fa)明(ming)步驟(zou)(zou)(2)所(suo)得(de)的(de)(de)滅(mie)(mie)活(huo)(huo)(huo)(huo)后(hou)的(de)(de)上(shang)清(qing)(qing)液(ye)(ye)(ye)中無銅綠(lv)假(jia)(jia)單胞菌存(cun)活(huo)(huo)(huo)(huo)，步驟(zou)(zou)(2)所(suo)得(de)的(de)(de)滅(mie)(mie)活(huo)(huo)(huo)(huo)后(hou)的(de)(de)上(shang)清(qing)(qing)液(ye)(ye)(ye)中的(de)(de)毒(du)素(su)蛋白(bai)已(yi)完全(quan)滅(mie)(mie)活(huo)(huo)(huo)(huo)。

進一步(bu)地，步(bu)驟(3)中的(de)(de)(de)佐(zuo)劑(ji)為基(ji)于鋁(lv)的(de)(de)(de)佐(zuo)劑(ji)，優選地，所述基(ji)于鋁(lv)的(de)(de)(de)佐(zuo)劑(ji)為氫氧化鋁(lv)膠(jiao)體佐(zuo)劑(ji)，可購自Sigma公司。具體地，氫氧化鋁(lv)膠(jiao)體佐(zuo)劑(ji)的(de)(de)(de)終(zhong)濃度(du)為0.5mg/ml。

本(ben)發明還公開了一(yi)種上述制備方法所制得(de)的水貂銅綠假單(dan)胞菌上清液滅活疫苗。

目前防治水貂銅(tong)綠(lv)假(jia)單(dan)胞(bao)(bao)菌(jun)的(de)(de)疫苗都是以菌(jun)體(ti)作為(wei)滅(mie)活(huo)疫苗研發二聯苗，而(er)且針對水貂出血(xue)性肺(fei)炎的(de)(de)滅(mie)活(huo)疫苗僅僅局限于區域(yu)流行的(de)(de)B型(xing)G型(xing)的(de)(de)二聯苗制備(bei)來減(jian)少免疫應(ying)急。由(you)于銅(tong)綠(lv)假(jia)單(dan)胞(bao)(bao)菌(jun)上(shang)清液釋(shi)放有膿桿菌(jun)合成(cheng)或分泌(mi)的(de)(de)可溶性毒(du)性產物如外毒(du)素A、胞(bao)(bao)外酶(mei)(S、T、U和Y等(deng))、蛋白酶(mei)、色(se)素、耐熱溶血(xue)素、殺(sha)細(xi)胞(bao)(bao)素、磷脂酶(mei)C等(deng)，本(ben)發明以銅(tong)綠(lv)假(jia)單(dan)胞(bao)(bao)菌(jun)強(qiang)毒(du)株(zhu)ZHDL9的(de)(de)上(shang)清液代替菌(jun)體(ti)，極大(da)解決了血(xue)清型(xing)差異(yi)問題，具有免疫范圍廣，降低(di)成(cheng)本(ben)，減(jian)少免疫接種(zhong)次數從而(er)減(jian)少應(ying)急，增(zeng)加(jia)經濟收(shou)入的(de)(de)效果。

本發明還公開了一種上(shang)(shang)述制備方法(fa)所制得(de)的上(shang)(shang)清液(ye)滅活(huo)(huo)疫苗在防治水貂出(chu)血性肺炎(yan)中(zhong)的應用：肌肉注射本發明的上(shang)(shang)清液(ye)多組分蛋白滅活(huo)(huo)疫苗，免疫劑量(liang)按照500ug每(mei)只。

為檢驗(yan)本發明所制(zhi)得的(de)上清液(ye)滅活(huo)疫苗(miao)的(de)安(an)全性，進行了安(an)全性檢查：將本發明所制(zhi)得的(de)水貂銅綠假單胞菌上清液(ye)滅活(huo)疫苗(miao)分(fen)別(bie)免疫小鼠和水貂，三天后觀察(cha)，結果無(wu)任何臨床癥狀。

抗(kang)(kang)體(ti)檢測(ce)：特(te)(te)異(yi)(yi)性抗(kang)(kang)體(ti)水(shui)平檢測(ce)、特(te)(te)異(yi)(yi)性分(fen)泌(mi)細胞檢測(ce)結果表明(ming)，本發明(ming)所制得的(de)銅綠假單胞菌上清(qing)液多組份蛋白滅(mie)活(huo)疫(yi)苗(miao)與常規的(de)菌體(ti)滅(mie)活(huo)疫(yi)苗(miao)特(te)(te)異(yi)(yi)抗(kang)(kang)體(ti)水(shui)平無(wu)顯(xian)著差異(yi)(yi)，特(te)(te)異(yi)(yi)性分(fen)泌(mi)細胞無(wu)顯(xian)著差異(yi)(yi)。

為檢驗本(ben)發(fa)明所制(zhi)得的上(shang)清液滅活疫苗的免(mian)疫保(bao)護(hu)(hu)效力，進(jin)行(xing)了(le)保(bao)護(hu)(hu)率(lv)(lv)實驗，結(jie)果表明，在感染銅(tong)(tong)綠假(jia)單(dan)(dan)胞菌15天后，銅(tong)(tong)綠假(jia)單(dan)(dan)胞菌上(shang)清液多組份疫苗免(mian)疫水貂存活率(lv)(lv)100％。

應用發(fa)病率(lv)：實驗(yan)于諸城市大(da)森林特種(zhong)動物(wu)養殖區進(jin)行，實驗(yan)結果表(biao)明，本發(fa)明的上清液多(duo)組(zu)份致病蛋白疫苗對水貂具有良(liang)好的保護作用。

與現有(you)技術相(xiang)比，本(ben)發(fa)明(ming)的(de)(de)(de)(de)有(you)益效果在于(yu)：本(ben)發(fa)明(ming)制備(bei)的(de)(de)(de)(de)上清液(ye)多組份致病蛋白疫(yi)(yi)苗與常(chang)規的(de)(de)(de)(de)菌體滅活疫(yi)(yi)苗經安全性性檢查、特異(yi)性抗體水(shui)平(ping)及水(shui)貂(diao)保護率比較無顯(xian)著差異(yi)。本(ben)發(fa)明(ming)以銅(tong)綠假單胞菌強毒株ZHDL9的(de)(de)(de)(de)上清液(ye)代(dai)替菌體，極(ji)大解決了血清型差異(yi)問題，具有(you)免(mian)疫(yi)(yi)范圍廣(guang)，降(jiang)低成(cheng)本(ben)，減(jian)少免(mian)疫(yi)(yi)接(jie)種次數從而減(jian)少應急，增加(jia)經濟收入(ru)的(de)(de)(de)(de)效果，并且對水(shui)貂(diao)具有(you)良好的(de)(de)(de)(de)保護作用。

附圖說明

圖(tu)1為特異性(xing)抗(kang)體水(shui)平檢測結果圖(tu)示；

圖(tu)2為(wei)特異(yi)性細(xi)胞分泌抗(kang)體(ti)檢(jian)測結果圖(tu)示(shi)；

圖3為ZHDL9強毒株攻毒保護實驗結果圖示。

具體實施方式

以下的實(shi)施(shi)例便于更(geng)好地(di)理解本發(fa)明(ming)，但并不(bu)限定本發(fa)明(ming)。下述實(shi)施(shi)例中(zhong)的實(shi)驗方法，如無特殊說(shuo)明(ming)，均為常規方法。

本發(fa)明制備滅活疫苗所用(yong)的銅綠假單胞(bao)(bao)菌ZHDL9及檢(jian)驗所用(yong)的銅綠假單胞(bao)(bao)菌ZHDL9是(shi)通(tong)過(guo)大連瓦房(fang)店水貂養殖區臨床分離(li)得(de)到(任何公眾均(jun)可(ke)通(tong)過(guo)常規手(shou)段(duan)分離(li)獲得(de))，通(tong)過(guo)提取(qu)測序比對得(de)知。

實施例1

一種水(shui)貂出血(xue)性肺炎滅(mie)活疫苗制(zhi)備方(fang)法，包括以下步(bu)驟(zou)：

(1)培養(yang)分(fen)離鑒(jian)(jian)定的(de)銅(tong)綠(lv)假單(dan)胞菌(jun)(jun)強毒株ZHDL9：將分(fen)離鑒(jian)(jian)定的(de)銅(tong)綠(lv)假單(dan)胞菌(jun)(jun)強毒株ZHDL9接(jie)種于(yu)LB瓊脂(zhi)培養(yang)基(ji)，無菌(jun)(jun)環境下挑選單(dan)菌(jun)(jun)落(luo)于(yu)液(ye)體培養(yang)基(ji)中，培養(yang)至(zhi)細(xi)菌(jun)(jun)培養(yang)液(ye)在OD600處(chu)的(de)吸光度值為0.62時(shi)，再37℃擴大培養(yang)12h，然(ran)后25℃避光靜止培養(yang)三天以上直(zhi)至(zhi)呈綠(lv)色(se)熒光；

(2)滅活處理：向銅綠假單胞菌菌液(ye)中緩慢加入(ru)甲醛(quan)滅活，邊加入(ru)邊震(zhen)蕩，使其充(chong)分混(hun)勻，直至甲醛(quan)溶液(ye)的(de)終濃度為菌液(ye)體積總量的(de)0.4％，置于37°搖(yao)床震(zhen)蕩處理，搖(yao)床轉速160r/min，滅活處理72小(xiao)時，涂(tu)板檢驗菌液(ye)是(shi)否徹(che)底滅活；

(3)配苗：將滅活檢(jian)驗(yan)合格的(de)銅綠(lv)假單胞菌(jun)強毒株ZHDL9菌(jun)液13000rpm離心(xin)，取(qu)上清液，向上清液中加入(ru)飽和硫酸銨溶液，使上清液中的(de)蛋(dan)白質(zhi)沉淀，離心(xin)，取(qu)沉淀的(de)蛋(dan)白質(zhi)，將沉淀的(de)蛋(dan)白質(zhi)用無菌(jun)生(sheng)理(li)鹽水溶解，調整(zheng)多(duo)組份蛋(dan)白濃度為500ug/ml，加入(ru)佐劑，4度過夜，即得。所述氫氧(yang)化(hua)鋁膠體佐劑可(ke)購自Sigma公司。

實施例2

一種水貂出血性(xing)肺(fei)炎滅活疫苗制備(bei)方法，包括以(yi)下步驟：

(1)培養(yang)(yang)分離(li)鑒(jian)定的銅綠假單胞菌(jun)強(qiang)毒株ZHDL9：將分離(li)鑒(jian)定的銅綠假單胞菌(jun)強(qiang)毒株ZHDL9接種(zhong)于LB瓊脂培養(yang)(yang)基(ji)，無菌(jun)環境(jing)下挑選單菌(jun)落于液體(ti)培養(yang)(yang)基(ji)中，培養(yang)(yang)至(zhi)細菌(jun)培養(yang)(yang)液在OD600處的吸光度(du)值為0.62時，再37℃擴大培養(yang)(yang)12h，然(ran)后(hou)25℃避光靜止培養(yang)(yang)三天以上直至(zhi)呈(cheng)綠色熒光；

(2)滅活(huo)處(chu)理(li)：向銅綠假(jia)單胞菌(jun)菌(jun)液中緩慢(man)加(jia)入甲醛(quan)滅活(huo)，邊加(jia)入邊震(zhen)蕩(dang)，使其充(chong)分(fen)混勻，直至甲醛(quan)溶液的(de)終濃度為菌(jun)液體(ti)積總量的(de)0.4％，置(zhi)于37°搖(yao)床(chuang)震(zhen)蕩(dang)處(chu)理(li)，搖(yao)床(chuang)轉速(su)170r/min，滅活(huo)處(chu)理(li)72小時(shi)，涂(tu)板檢驗菌(jun)液是否(fou)徹底(di)滅活(huo)；

(3)配苗(miao)：將滅活檢驗合格的銅(tong)綠假單胞菌強毒(du)株ZHDL9菌液離(li)心，取上(shang)清(qing)液，向上(shang)清(qing)液中(zhong)加(jia)入(ru)(ru)飽(bao)和硫酸銨溶液，使(shi)上(shang)清(qing)液中(zhong)的蛋白質沉淀(dian)，離(li)心，取沉淀(dian)的蛋白質，將沉淀(dian)的蛋白質用無菌生理鹽(yan)水溶解，調(diao)整多組份蛋白濃度為500ug/ml，加(jia)入(ru)(ru)佐(zuo)劑(ji)(ji)，4度過夜，即得(de)。所述氫氧化鋁膠(jiao)體(ti)佐(zuo)劑(ji)(ji)可購自(zi)Sigma公(gong)司，氫氧化鋁膠(jiao)體(ti)佐(zuo)劑(ji)(ji)的終濃度為0.5mg/ml。

實施例3

一種水貂出血性(xing)肺(fei)炎滅活疫苗制備(bei)方法，包括以下(xia)步驟：

(1)培(pei)養(yang)(yang)(yang)分離鑒定的銅(tong)綠(lv)假單(dan)胞(bao)菌強毒(du)株ZHDL9：將分離鑒定的銅(tong)綠(lv)假單(dan)胞(bao)菌強毒(du)株ZHDL9接種于(yu)LB瓊(qiong)脂培(pei)養(yang)(yang)(yang)基，無菌環境(jing)下挑(tiao)選單(dan)菌落(luo)于(yu)液體培(pei)養(yang)(yang)(yang)基中，培(pei)養(yang)(yang)(yang)至細菌培(pei)養(yang)(yang)(yang)液在OD600處的吸光(guang)度(du)值(zhi)為0.76時，再37℃擴(kuo)大培(pei)養(yang)(yang)(yang)12h，然后(hou)常溫(wen)(25℃)避光(guang)靜止(zhi)培(pei)養(yang)(yang)(yang)三天以上直至呈(cheng)綠(lv)色熒光(guang)；

(2)滅活處理：向銅綠假(jia)單胞菌(jun)(jun)菌(jun)(jun)液中緩(huan)慢加入甲(jia)醛(quan)滅活，邊(bian)加入邊(bian)震(zhen)蕩(dang)，使其(qi)充分混勻，直至甲(jia)醛(quan)溶液的終濃(nong)度為菌(jun)(jun)液體(ti)積總量的0.4％，置于37°搖床震(zhen)蕩(dang)處理，搖床轉速180r/min，滅活處理72小時，涂板檢驗菌(jun)(jun)液是否徹底滅活；

(3)配苗(miao)：將滅活檢驗(yan)合格(ge)的(de)銅綠假單(dan)胞菌(jun)(jun)強毒株ZHDL9菌(jun)(jun)液(ye)(ye)離心，取(qu)上清(qing)(qing)液(ye)(ye)，向上清(qing)(qing)液(ye)(ye)中加入(ru)飽和硫酸(suan)銨溶液(ye)(ye)，使上清(qing)(qing)液(ye)(ye)中的(de)蛋(dan)白質沉淀(dian)，離心，取(qu)沉淀(dian)的(de)蛋(dan)白質，將沉淀(dian)的(de)蛋(dan)白質用無(wu)菌(jun)(jun)生理鹽水溶解，調整多組(zu)份(fen)蛋(dan)白濃(nong)度為500ug/ml，加入(ru)佐劑，4度過(guo)夜，即得。

上清液毒性檢測實驗

為(wei)檢驗本(ben)發明的步(bu)驟(zou)(zou)(1)所得的銅綠假單(dan)胞(bao)菌(jun)強(qiang)毒株(zhu)ZHDL9的上清液的毒性情況(kuang)，將實(shi)施例(li)1-實(shi)施例(li)3的步(bu)驟(zou)(zou)(1)離心所得的上清液分(fen)別0.05ml小鼠皮(pi)下多點注射，實(shi)驗結果為(wei)小鼠3天后均出(chu)現死亡。通過蛋白(bai)電(dian)泳可以觀(guan)察(cha)到(dao)步(bu)驟(zou)(zou)(1)離心所得的上清液中(zhong)有多種組(zu)分(fen)蛋白(bai)。

實驗用小鼠購自哈藥(yao)集團三精制藥(yao)有限公(gong)司，為6周齢雌(ci)性SPF級昆明小鼠20±2g。

上清液(ye)滅活疫苗的滅活情況檢測(ce)實驗

將(jiang)實(shi)施例1-實(shi)施例3的(de)步(bu)驟(2)所(suo)得(de)的(de)滅(mie)活(huo)后(hou)(hou)的(de)上(shang)清(qing)液(ye)分(fen)(fen)別室溫(wen)培養72小(xiao)時(shi)(shi)后(hou)(hou)分(fen)(fen)別取適(shi)量(liang)滅(mie)活(huo)后(hou)(hou)的(de)上(shang)清(qing)液(ye)涂布LB固體培養基，分(fen)(fen)別檢驗是否有銅綠假(jia)單胞菌存活(huo)。將(jiang)本發(fa)明實(shi)施例1-實(shi)施例3的(de)步(bu)驟(2)所(suo)得(de)的(de)滅(mie)活(huo)后(hou)(hou)的(de)上(shang)清(qing)液(ye)分(fen)(fen)別室溫(wen)培養72小(xiao)時(shi)(shi)后(hou)(hou)分(fen)(fen)別取適(shi)量(liang)滅(mie)活(huo)后(hou)(hou)的(de)上(shang)清(qing)注射到昆明小(xiao)鼠腿部肌肉，檢測(ce)上(shang)清(qing)液(ye)中的(de)毒(du)素蛋白(bai)是否完全滅(mie)活(huo)。

實驗用昆明小鼠購自哈藥集團三精制藥有限公司，為6周齢雌性SPF級昆明小鼠20±2g。

結果表明，本(ben)發明實施(shi)例1-實施(shi)例3的(de)(de)步驟(2)所得(de)的(de)(de)滅活后的(de)(de)上清液中(zhong)無(wu)銅綠假(jia)單胞菌存活，步驟(2)所得(de)的(de)(de)滅活后的(de)(de)上清液中(zhong)的(de)(de)毒(du)素(su)蛋(dan)白(bai)已完全滅活。

安全性檢查實驗

為檢驗(yan)本發明所(suo)制(zhi)得的(de)上(shang)清液滅(mie)活疫(yi)苗的(de)安全(quan)性，進行了安全(quan)性檢查：將本實(shi)(shi)施例1-實(shi)(shi)施例3的(de)所(suo)制(zhi)得的(de)水貂銅綠假單胞菌上(shang)清液滅(mie)活疫(yi)苗分(fen)別免疫(yi)小鼠和水貂，三(san)天后觀察，結(jie)果無任何臨床癥(zheng)狀(zhuang)。

實驗用小鼠(shu)購自哈藥集(ji)團三精(jing)制(zhi)藥有限(xian)公司，為20±2g清潔級(ji)昆明(ming)小鼠(shu)。

實(shi)驗用(yong)水(shui)貂購自諸(zhu)城(cheng)市大森(sen)林特(te)種動物(wu)養(yang)殖區，為2～5月齡健康(kang)易感激素水(shui)貂。

抗體檢測實驗

本實驗(yan)(yan)中，水貂銅綠假單胞(bao)菌上(shang)(shang)清(qing)液多(duo)(duo)組分疫(yi)苗(miao)組所用疫(yi)苗(miao)為本發明實施例2所制得(de)的(de)水貂銅綠假單胞(bao)菌上(shang)(shang)清(qing)液滅活疫(yi)苗(miao)。向實驗(yan)(yan)水貂肌肉注射本發明實施例2所得(de)的(de)上(shang)(shang)清(qing)液多(duo)(duo)組分蛋白滅活疫(yi)苗(miao)，免疫(yi)劑(ji)量按照500ug每(mei)只。

銅綠假單胞(bao)菌菌體(ti)疫(yi)苗(miao)(miao)組所(suo)用疫(yi)苗(miao)(miao)的具體(ti)制備方(fang)法如下：

(1)培(pei)養分離(li)鑒(jian)定的銅綠假(jia)單胞菌(jun)(jun)強毒(du)株ZHDL9：將分離(li)鑒(jian)定的銅綠假(jia)單胞菌(jun)(jun)強毒(du)株ZHDL9接種于LB瓊脂培(pei)養基，無菌(jun)(jun)環境下(xia)挑選(xuan)單菌(jun)(jun)落于液(ye)體培(pei)養基中(zhong)，培(pei)養至細菌(jun)(jun)培(pei)養液(ye)在(zai)OD600處的吸光度值為0.75時，再37℃擴(kuo)大培(pei)養12h，得銅綠假(jia)單胞菌(jun)(jun)強毒(du)株ZHDL9菌(jun)(jun)液(ye)；

(2)滅(mie)活(huo)處(chu)理(li)(li)：向銅綠假單胞菌(jun)強毒株ZHDL9菌(jun)液(ye)中緩慢加入(ru)甲醛(quan)(quan)滅(mie)活(huo)，邊(bian)加入(ru)邊(bian)震(zhen)蕩(dang)(dang)，使其充分混勻，直至甲醛(quan)(quan)溶液(ye)的終濃度為(wei)菌(jun)液(ye)體積總量的0.4％，置于37°搖床震(zhen)蕩(dang)(dang)處(chu)理(li)(li)，搖床轉速160-180r/min，滅(mie)活(huo)處(chu)理(li)(li)72小(xiao)時；

(3)將滅活檢驗合格的銅綠假單胞菌強毒株ZHDL9離心(13000rpm)，收集沉淀細菌，再用PBS磷酸緩沖溶液或生理鹽水懸浮沉淀，調節細菌細胞濃度至10⁸～10⁹cells/ml。取樣，按現行(xing)《中國獸藥典》附錄進行(xing)無(wu)菌(jun)檢驗，無(wu)菌(jun)生長。

銅綠假單胞菌(jun)菌(jun)體(ti)疫苗組(zu)的處理(li)為(wei)：向實(shi)驗(yan)水貂肌肉(rou)注(zhu)(zhu)射銅綠假單胞菌(jun)菌(jun)體(ti)疫苗組(zu)的疫苗(即(ji)為(wei)常規菌(jun)體(ti)滅活疫苗)，免疫劑(ji)量按照500ug每只。空白對照組(zu)不(bu)接種任(ren)何(he)疫苗、注(zhu)(zhu)射500ug生理(li)鹽水。

由圖1和圖2可見，特(te)異(yi)(yi)性抗體水平(ping)檢測、特(te)異(yi)(yi)性分泌細胞檢測結果表明，本發明實施(shi)例2所得的(de)銅綠假單(dan)胞菌(jun)上清(qing)液多組份蛋白滅(mie)活疫苗(miao)與常規的(de)菌(jun)體滅(mie)活疫苗(miao)(銅綠假單(dan)胞菌(jun)菌(jun)體疫苗(miao)組)相比特(te)異(yi)(yi)抗體水平(ping)無(wu)(wu)顯著(zhu)差異(yi)(yi)，特(te)異(yi)(yi)性分泌細胞無(wu)(wu)顯著(zhu)差異(yi)(yi)。

實驗用水貂(diao)購自(zi)諸城市(shi)大森林特種動物養殖區，為2～5月齡健康易(yi)感激素(su)水貂(diao)。

保護率實驗

為檢(jian)驗(yan)本發明所制得的(de)上清液滅活(huo)疫苗的(de)免疫保護(hu)效力，進行了保護(hu)率實驗(yan)。

水貂(diao)銅綠(lv)假單胞菌上清液(ye)多(duo)組(zu)分(fen)疫(yi)苗(miao)(miao)組(zu)(第一組(zu))所(suo)用疫(yi)苗(miao)(miao)為(wei)本發明(ming)實施例2所(suo)制(zhi)得的水貂(diao)銅綠(lv)假單胞菌上清液(ye)滅活疫(yi)苗(miao)(miao)。

銅綠假單胞菌菌體疫苗組(第二組)所用(yong)疫苗的具體制備方法如下：

(1)培(pei)(pei)養分離鑒定的銅綠假單胞(bao)菌(jun)(jun)強(qiang)毒株ZHDL9：將分離鑒定的銅綠假單胞(bao)菌(jun)(jun)強(qiang)毒株ZHDL9接種于(yu)LB瓊脂培(pei)(pei)養基(ji)，無(wu)菌(jun)(jun)環(huan)境下挑(tiao)選(xuan)單菌(jun)(jun)落于(yu)液體培(pei)(pei)養基(ji)中，培(pei)(pei)養至細菌(jun)(jun)培(pei)(pei)養液在(zai)OD600處(chu)的吸光度值為0.75時，再37℃擴大培(pei)(pei)養12h，得銅綠假單胞(bao)菌(jun)(jun)強(qiang)毒株ZHDL9菌(jun)(jun)液；

(2)滅(mie)活處理：向(xiang)銅綠(lv)假(jia)單胞菌(jun)強毒株ZHDL9菌(jun)液中緩慢加入甲(jia)醛(quan)滅(mie)活，邊加入邊震蕩，使其充分混勻，直至(zhi)甲(jia)醛(quan)溶液的終濃度為菌(jun)液體積(ji)總(zong)量的0.4％，置于37°搖床(chuang)(chuang)震蕩處理，搖床(chuang)(chuang)轉速160-180r/min，滅(mie)活處理72小時；

(3)將滅活檢驗合格的銅綠假單胞菌強毒株ZHDL9離心(13000rpm)，收集沉淀細菌，再用PBS磷酸緩沖溶液或生理鹽水懸浮沉淀，調節細菌細胞濃度至10⁸～10⁹cells/ml。取樣按現行(xing)《中國獸藥典(dian)》附錄進行(xing)無菌(jun)檢驗，無菌(jun)生(sheng)長。

對照組(第三組)為不接(jie)種任(ren)何疫苗的處(chu)理組(生(sheng)理鹽水代替)。

免疫30天后，對各(ge)實(shi)驗組(zu)(zu)和對照組(zu)(zu)的(de)水貂感(gan)染銅綠假單胞菌。

實驗處理見表1：

表1銅綠假(jia)單胞菌上清液多組(zu)份(fen)滅活疫苗與菌體滅活疫苗特異(yi)抗(kang)保護性實(shi)驗

結果：在(zai)感(gan)染銅(tong)綠假(jia)單(dan)(dan)胞菌(jun)第一天(tian)(tian)，所有實驗(yan)組(zu)沒有出現死亡(wang)。在(zai)感(gan)染的第二天(tian)(tian)，對照組(zu)的水貂(diao)開始萎靡(mi)、食欲(yu)減退，第三天(tian)(tian)后出現出血性死亡(wang)。在(zai)感(gan)染15天(tian)(tian)后，銅(tong)綠假(jia)單(dan)(dan)胞菌(jun)上(shang)清液多組(zu)份疫(yi)苗(miao)組(zu)存(cun)活率(lv)(lv)(lv)顯著高于(yu)銅(tong)綠假(jia)單(dan)(dan)胞菌(jun)菌(jun)體疫(yi)苗(miao)組(zu)(p<0.05)，銅(tong)綠假(jia)單(dan)(dan)胞菌(jun)菌(jun)體免疫(yi)水貂(diao)存(cun)活率(lv)(lv)(lv)80％，銅(tong)綠假(jia)單(dan)(dan)胞菌(jun)上(shang)清液多組(zu)份疫(yi)苗(miao)免疫(yi)水貂(diao)存(cun)活率(lv)(lv)(lv)100％。

實驗用(yong)水(shui)貂購自諸城市大森林(lin)特種動物養殖區(qu)，為2～5月齡健康易(yi)感水(shui)貂。

應用發病率實驗

實(shi)驗(yan)于諸城市大森(sen)林特種(zhong)動物(wu)養(yang)殖(zhi)區(qu)進行，實(shi)驗(yan)過程中觀察并記錄實(shi)驗(yan)情況，實(shi)驗(yan)結果見表2：

表2應用發病率實驗

實驗結(jie)果(guo)表明(ming)：本(ben)發(fa)明(ming)制備的(de)(de)上(shang)清(qing)液多(duo)組份致病蛋(dan)白疫(yi)苗與(yu)常規的(de)(de)菌(jun)體滅活疫(yi)苗經安全性(xing)性(xing)檢查、特(te)異性(xing)抗體水平(ping)及水貂(diao)保護(hu)率比較(jiao)無顯著(zhu)差異。本(ben)發(fa)明(ming)以銅綠假單胞菌(jun)強毒株ZHDL9的(de)(de)上(shang)清(qing)液代替菌(jun)體，極(ji)大解決了血(xue)清(qing)型差異問題，具有(you)免(mian)疫(yi)范圍(wei)廣，降低成本(ben)，減少免(mian)疫(yi)接種(zhong)次數從而(er)減少應急，增加經濟收(shou)入的(de)(de)效果(guo)，并(bing)且對水貂(diao)具有(you)良(liang)好的(de)(de)保護(hu)作用。

以上所(suo)述(shu)僅是本(ben)發明(ming)的優(you)選實(shi)施方式，應當指出：對于本(ben)技(ji)術領域的普(pu)通技(ji)術人員來說，在不脫離(li)本(ben)發明(ming)原(yuan)理的前提下(xia)，還(huan)可以做出若干改進(jin)，這些(xie)改進(jin)應視為本(ben)發明(ming)的保護范圍。