專利名稱：治療用抗癌疫苗及其制備的制作方法
技術領域：
本發明涉及治療用抗癌疫苗及其制備，特別涉及腫瘤細胞系通過免疫調節基因修飾作為抗癌疫苗的制備方法及其在抗腫瘤治療中的應用。
背景技術：
腫瘤是目前嚴重危害人類生命的一大疾病，雖然經過多年的研究和努力，通過積極的腫瘤預防以及早期診斷、治療技術的提高，已在一定程度上減少了腫瘤的發生和危害，但是由于人們生活方式和環境情況的變化，腫瘤的總體發病和死亡數目仍居高不下，在某些地區已成為第一死因。
腫瘤的治療通常以手術、化療、放療等手段為主，雖然這些治療手段尤其是在化療藥物開發方面都有或多或少的改進和提高，但對于較為晚期的惡性腫瘤患者往往束手無策，無法在延長生存期和改善生活質量方面提供幫助。隨著人們對腫瘤的發生和發展的總體機制的研究，從上個世紀八十年代末開始，逐漸發展起了一種新的以通過生物手段對腫瘤進行治療的生物治療方式，如細胞因子治療、基因治療等。腫瘤的生物治療方式在常規手術、放化療均無法進行的情況下，仍能夠對腫瘤細胞進行一定程度的殺傷，其中通過調動機體免疫力對抗腫瘤的免疫治療是一種相對有效的腫瘤治療手段。
腫瘤的免疫治療分為被動免疫治療和主動免疫治療兩大類。在被動免疫治療中，針對某一特定的腫瘤細胞抗原的抗體在用于患者后，可與表達該抗原的腫瘤細胞結合，患者自身的免疫系統可以識別并清除這些被抗體標記的腫瘤細胞。另外，還可以將放射性同位素分子或毒素分子與抗體偶聯，在抗體結合到腫瘤細胞后直接殺傷腫瘤細胞。目前已用于臨床治療乳腺癌的Herceptin即屬于腫瘤被動免疫治療。
腫瘤的主動免疫治療是通過向腫瘤患者體內導入特定的抗原、激發患者自身的免疫反應來清除腫瘤細胞。在導入特定抗原的同時，往往還使用增強免疫反應的其它成份。這一特異性的免疫反應不僅可以刺激B細胞產生抗原特異性的抗體(體液免疫)，還可以激發抗原特異性的T細胞(細胞免疫)。純化的抗原蛋白、多肽、基于基因表達的系統、腫瘤細胞或腫瘤細胞裂解物等均可以用于腫瘤的主動免疫治療，即治療性腫瘤疫苗。
與化療不同，主動免疫治療不直接殺傷腫瘤細胞，而是通過產生一種針對腫瘤細胞的特異性的、靶向性的體液和/或細胞免疫反應，增加針對腫瘤細胞的免疫細胞、抗體的種類和數量來治療腫瘤。另外，治療性腫瘤疫苗還可以激活免疫系統，克服由于腫瘤生長和進展引起的免疫抑制。有效的腫瘤疫苗可以延長患者的無瘤期和總的生存時間，而不會有化療和其它生物治療引起的明顯的副作用。
由于癌癥發病機理的復雜性，以及得到廣譜的腫瘤特異性抗原的困難性，以腫瘤細胞為基礎的全細胞疫苗(whole cell vaccine)的開發得以積極進行。這一技術以完整的體外培養腫瘤細胞為抗原體以注射病人，經機體免疫系統識別處理后激活特異性抗腫瘤機制而產生抗癌作用(Nature Reviews Cancer 4401-411，2004)。另外，利用免疫細胞尤其是樹突狀細胞(Dendritic cell，DC)在體外培養及應用特異抗原及細胞介素共同刺激而作為抗癌疫苗也是這一技術的組成部分(NatureReviews Immunology 3，630-641，2003)。
全細胞治療用疫苗的臨床試驗目前在美國積極進行，現有多個后期臨床試驗正在進行并面臨突破(Expert Review Anticancer Therapy 5635-644，2005)。FDA有望在近期完成對此類產品的審核批準，從而開創一類自抗體類藥物開發后的抗腫瘤新的生物制品(Nature 411380-384，2001；Seminars in Oncology 301-8，2003)。本專利申請采用改進技術開發全細胞治療用抗癌疫苗。結合腫瘤細胞所特有的表型及功能缺陷而制備商業開發價值大的復合型抗癌疫苗。本專利申請利用腫瘤細胞系生產可廣泛應用的疫苗制品，在治療原則上不同于個體性疫苗(autologous orpersonalized vaccine)，具有工業化生產的可行性。在應用上可結合其他常規臨床治療或獨立使用，排除了個體性疫苗必須結合手術治療的局限性。因此，采用本專利技術可大規模生產可控制質檢的產品從而方便臨床治療應用。
結合治療用抗癌疫苗的應用宗旨是刺激病人免疫系統以抵抗腫瘤發展及消滅腫瘤，本專利申請主要技術要點是采用腫瘤細胞系作為腫瘤抗原的供體，利用細胞內表達及分泌的細胞介素進行抗腫瘤免疫的刺激及調節。通過營造適合對腫瘤抗原的表達及提呈的條件，以提高機體抗腫瘤免疫反應的力度。

發明內容
本發明提供一種抗癌疫苗，其主要成分為經過免疫調節基因修飾的腫瘤細胞系，所述免疫調節基因是GM-CSF，TGF-β，HSP90，TAP-1，IL-4，IL-2，IL-12，B7.1(CD80)，B7.2(CD86)，CTLA-4等(Nature Reviews Immunology 3，630-641，2003)，優選的是GM-CSF和TGF-β。所述腫瘤細胞系是體外傳代的各類人類腫瘤細胞系，針對所制備疫苗的抗癌類型而選擇。所述免疫調節基因均克隆于人類染色體DNA，所述腫瘤細胞系來源于ATCC中心(美國)或從病人腫瘤克隆得到的原代細胞。
本發明的抗癌疫苗，其制備方法是通過將本發明經過免疫調節基因修飾的腫瘤細胞系與含有一定量的生理上可接受的輔助成分混合制成，所述輔助成分可以是DMSO，Pentastarch，血清白蛋白，緩沖溶液，水，疫苗佐劑，保護劑，穩定劑等，優選的是5％DMSO，8％Pentastarch，2％人血清白蛋白(HSA)以及適量的磷酸緩沖液，其制備過程可以根據醫藥制劑學的常規生產技術，制成單位劑量形式的供注射用的抗癌疫苗組合物制劑。
本發明的抗癌疫苗，所述單位劑量形式的供注射用的抗癌疫苗組合物制劑，其中經過免疫調節基因修飾的腫瘤細胞系的量為0.1-500×106細胞/mL與輔助組分充分混勻而成。
本發明中，腫瘤細胞系的選擇是決定疫苗制品應用對象的關鍵，針對不同腫瘤病人可采取不同細胞系。例如肝癌病人可用Hep3B，HepG2細胞系；宮頸癌病人可用HeLa，ME180細胞系；肺癌病人可用A549細胞系；也可選用有開發潛力的臨床歷史清晰的原代分離株。腫瘤細胞系經體外轉染(transfection)而獲得其它轉基因表達。經篩選及建立穩定細胞系以用于抗癌疫苗的生產。
轉基因表達及建立穩定細胞系采用逆轉錄病毒(retroviral vector)，DNA體外轉染等技術。所用病毒載體構建采用Moloney murine leukaemia virus(MMLV)。帶有轉基因的非自主性復制的MMLV病毒在特定條件下生產后，用于腫瘤細胞系的外源基因導入。陽性轉化細胞先經過特定抗藥標記進行初選，再利用抗體免疫聯聯染色或其他分子生物學方法進行篩選，選出的陽性細胞株用于制備腫瘤疫苗。本專利申請的核心在于所導入的外源基因組合對于腫瘤細胞抗原體在體內被免疫系統的識別及表達起關鍵作用。所選出的腫瘤疫苗細胞經放射滅活后再作臨床應用。
本發明所述免疫調節基因是外源基因，本發明所應用的外源基因如下GM-CSF高效的巨嗜細胞(macrophage)和DC細胞的調節因子。當腫瘤細胞抗原體疫苗接種至體內后，所攜帶的特異性腫瘤抗原可經cross presentation機制進行抗原呈遞(Annual Review of Immunology，1947-64，2001)。在這一過程中GM-CSF起極其重要的調節及促進作用。
TGF-β(transforming growth factor β)這是一類由大多數細胞所共有的調節因子。它主要可以抑制免疫系統功能，尤其抑制腫瘤抗原被細胞免疫系統所識別(Nature Medicine 71118-1122，2001)。這一基因在腫瘤疫苗制備過程中利用siRNA技術予以抑制(Cancer Research 647596-7603，2004；Gene Therapy125-11，2005)。
TAP-1(transporter associated with antigen processing)這一基因產物在抗原呈遞過程中起傳導器作用。許多癌癥細胞中這一基因呈突變缺失，從而使這些腫瘤細胞不為免疫系統所識別(Nature Reviews Cancer 5263-274，2005)。
HSP90(heat shock protein 90)這是一類為大多數細胞所共有的基因，在應急狀態下表達提高。這類基因表達的產物在細胞中擔任chaperons，幫助其他蛋白形成正常結構以行使功能，以及輔助蛋白在細胞內的傳遞及處理。因此，這類HSP蛋白會和細胞內的各種蛋白包括腫瘤抗原相結合，為抗原呈遞所必需(InternationalJournal of Hyperthermi a 21717-722，2005)。
本專利申請以上述外源基因應用于抗癌疫苗的制備，采用不同外源基因組合而提高抗癌能力，具有協同作用。優選的組合方式列在本發明實施例中。


圖1為Hep3B-GMCSF/TGF siRNA抗癌疫苗細胞系GM-CSF的表達和TGF-β抑制的實驗分析結果。AELISA方法檢測GM-CSF的表達。BWestern blot方法檢測TGF-β的表達。
圖2為抗癌疫苗細胞系所表達的GM-CSF的生物學功效分析。
圖3為抗癌疫苗細胞系的抗癌功效比較。三組(n＝10)C57B1/6小鼠在第一天接受不同疫苗(2×106經放射處理的細胞)，并在第10天再次免疫同樣細胞。在第30天接受B16腫瘤細胞(2×105)SC攻擊。第50天三組動物的腫瘤發生進行比較。
圖4為抗癌疫苗細胞系的抗癌功效比較。所有動物在第一和十天接受不同疫苗(2×106經放射處理的細胞)，在第30天接受B16腫瘤細胞(2×105)SC攻擊。動物存活比例經圖示比較。
具體實施例方式以下通過實施例進一步說明本發明，但不作為對本發明的限制。
實施例1腫瘤細胞表達GM-CSF及抑制TGF-β的疫苗此類腫瘤細胞疫苗同時帶有兩種新的特征，即GM-CSF的高效表達及利用siRNA技術抑制了TGF-β的產生。此類疫苗提高了在腫瘤全細胞中單純表達GM-CSF而產生的抗癌免疫功能，具有協同作用。
GM-CSF基因經DNA克隆技術插入逆轉錄病毒轉染載體rkat43.2而構建rkat43.2GM-CSF。此一載體的構建及特征已在過去有所描述(Roberts，等，1998；J Immunol，161375-384.)。GM-CSF基因經由BamHI和ApaI內切酶而克隆進上述質粒載體。根據文獻中所描述的具體方法，有感染活力的帶有GM-CSF基因的逆轉錄病毒載體通過復合轉染MCVecog/p和6.1CMVamphoenv DNA質粒以及上述質粒載體到包裝細胞293T中。DNA轉染后約4-5天，細胞裂解液即可制備成帶有GM-CSF基因的逆轉錄病毒載體，其感染活力經病毒滴度測定后而進一步用于GM-CSF基因表達的穩定細胞系的制備。
表達GM-CSF穩定細胞系的制備是通過感染相關腫瘤細胞系并進行體外細胞培養篩選而進行的(Cytotechnology 2831-42，1998)。例如制備抗肝癌疫苗，首先將體外培養的Hep3B細胞進行GM-CSF表達的逆轉錄病毒的感染。一周后，將所剩存的細胞作限定性稀釋并在96孔培養板進行細胞克隆培養。所建立的單克隆細胞株經GM-CSF表達篩選而得到高表達的Hep3B/GM-CSF細胞株。
TGF-β的抑制通過pSilencer質粒來傳遞siRNA技術而完成。Ambion公司(美國)的pSilencerTM 4.1-CMV neo System被用于制備抑制TGF-β基因表達的siRNA載體。參照該系統使用說明書，siRNA寡核苷酸插入質粒載體中，由修飾過的CMV啟動子進行siRNA發夾結構的合成表達。所用于產生TGF-βsiRNA的寡核苷酸序列TGF-β1/oligoA及TGF-β1/oligoB由傳統克隆技術導入質粒載體DNA。TGF-β1/oligoA5’-GATCCCC GACTATCGACATGGAGCTGttcaagagaCAGCTCCATGTCGATAGTCTTTTTGGAAATGF-β1/oligoB5’-TCGATTTCCAAAAAGACTATCGACATGGAGCTGtctcttgaaCAGCTCCATGTCGATAGTCGGG攜帶TGF-β1 siRNA的質粒載體經轉染而導入腫瘤細胞并抑制TGF-β的表達，從而使腫瘤細胞產生新的生物學特征。例如已建立的表達GM-CSF的Hep3B細胞，由TGF-β1 siRNA質粒載體轉染而導入。經過2-3星期的G418藥物篩選培養，建立穩定細胞株。其中抑制了TGF-β表達的穩定細胞系經由RT-PCR技術進行篩選。所獲得的穩定細胞系經由Cell Factory或生物反應器(Bio-reactor)進行細胞培養而大量生產，經放射滅活后用于臨床試驗治療。
利用ELISA和Western Blot方法，可以有效地分析GM-CSF和TGF-β的表達情況。圖1顯示肝癌Hep3B抗癌疫苗細胞系的實驗分析，與原始細胞系的比較表明，新構建的疫苗細胞系表達GM-CSF蛋白，同時TGF-β的表達被明顯地抑制了。肝癌Hep3B抗癌疫苗細胞系所表達的GM-CSF被實驗證實為有生物學活性。圖2為TF-1細胞的特異擴增試驗結果。Hep3B抗癌疫苗細胞系的細胞培養液和各種不同的對照與TF-1細胞共同培養，只有疫苗株的培養液表現出與GM-CSF標準品對照相似的特異擴增結果，證實疫苗株表達具有生物學活性的GM-CSF。
以上試驗表明，所制備的Hep3B-GMCSF/TGF siRNA抗癌疫苗細胞系不僅表達較高的GM-CSF，并且抑制了細胞內TGF-β的表達，達到了疫苗設計要求。為進一步證明疫苗抗癌功效，相關體內動物試驗也同時進行。由于人類腫瘤模型難于在免疫功能健全的動物體內進行研究，小鼠GM-CSF和TGF-β1基因被用于構建不同的細胞株，從而建立了試驗動物模型驗證GM-CSF表達和TGF-β1 siRNA抑制的免疫學功效。在圖3的試驗中，有GM-CSF表達的細胞和有GM-CSF表達以及TGF-β1 siRNA抑制的細胞同時顯示抗癌免疫疫苗功效，而后者由于TGF-β1 siRNA的抑制更顯示了比只有GM-CSF表達更好的免疫學功效。
根據以上所述疫苗構建方法，表達GM-CSF及TGF-β1 siRNA的各類腫瘤細胞系已被克隆，包括肺癌A549細胞，腸癌LoVo細胞，胃癌SNU5細胞，宮頸癌HeLa細胞，等等。
實施例2腫瘤細胞表達GM-CSF及HSP90并抑制TGF-β的疫苗此類腫瘤細胞疫苗除以上特征外，同時增加了HSP的表達。表達HSP是通過在GM-CSF基因后加入Foot Mouth Disease Virus(FMDV)2A序列及后續的HSP90基因。FMDV 2A序列為第二個基因HSP90的表達提供必需的信號(Donnelly等，2001，Journal of General Virology，821027-1041.)。由此構建的逆轉錄病毒轉染載體rkat43.2GM-CSF/HSP90被用于制備有感染活力的帶有GM-CSF和HSP90基因的逆轉錄病毒載體而進一步用于制備表達GM-CSF和HSP90基因的穩定細胞系。
新的表達GM-CSF和HSP90基因的穩定腫瘤細胞系經轉染pSilencer質粒載體而導入TGF-β1 siRNA，從而建立抑制TGF-β表達的穩定細胞系。具體制備過程類同于例一所述的Hep3B/GM-CSF/TGF-β1 siRNA細胞的制備。
此類疫苗可進一步提高腫瘤抗原的呈遞及免疫系統識別。圖4為幾種不同基因組合用于小鼠腫瘤模型B16中的體內試驗結果。在此試驗中，B16細胞經體外轉染而構建B16-GMCSF/TGF-β-和B16-GMCSF/TGF-β-/HSP細胞系，三種不同細胞系用于B16腫瘤的治療。首先，在試驗第一天，帶有約100mm3大的B16腫瘤的小鼠分為三組(n＝8)，每組接種一種已放射滅活的抗癌疫苗細胞系。在第60天，小鼠再次接受B16細胞注射。三組動物的存活紀錄經圖顯示比較，B16-GMCSF/TGF-β-/HSP細胞系所制備的疫苗表現出最強的抗癌功效。
根據以上所述疫苗構建方法，表達GM-CSF，HSP及TGF-β1 siRNA的各類腫瘤細胞系已被克隆，包括肺癌A549細胞，腸癌LoVo細胞，胃癌SNU5細胞，宮頸癌HeLa細胞，等等。
實施例3腫瘤細胞表達GM-CSF，HSP90及TAP-1并抑制TGF-β的疫苗此類腫瘤細胞疫苗細胞系具有多種新特征以提高腫瘤抗原的呈遞，可成為高效復合型抗癌疫苗，具有明顯的協同作用。
利用DC細胞的cross presentation機制來針對性地進行腫瘤抗原呈遞目前已展示出一定臨床抗癌功效。采用腫瘤細胞來制備全細胞抗癌疫苗將可能成為新一代的抗癌生物制品。本專利申請科學地應用抗原呈遞中的免疫機制以提高腫瘤抗原的呈遞和識別，所開發的全細胞抗癌疫苗可大規模工業化生產，疫苗的腫瘤抗原呈遞及免疫系統識別可望大大提高，從而增強疫苗的抗癌能力。
實施例4本發明抗癌疫苗的臨床應用在臨床應用上，針對病人的癌癥類型，相關腫瘤細胞系(例如肺癌或肝癌細胞系)用于表達GM-CSF(及或HSP)以及抑制TGF-β而構建此類抗癌疫苗。所獲得的穩定疫苗細胞系經由Cell Factory或生物反應器(Bio-reactor)進行細胞培養而大量生產，所獲細胞經洗滌分離并制成懸浮液(0.1～500×106細胞/mL/支)，經放射處理滅活后保存于液氮或低溫冰箱。在用于臨床試驗治療前，冷凍保存的抗癌疫苗細胞制劑化凍后給病人做注射(例如皮下注射)。一般情況下，每個病人需要一至六次注射為一個療程(每周或每月一次，每次一支)，歷時六至24個星期。
實施例5腫瘤細胞表達GM-CSF及抑制TGF-β的疫苗的制備實施例1方法制備的疫苗0.1×106細胞/mL，加入5％DMSO，8％Pentastarch，2％人血清白蛋白(HSA)的磷酸生理條件緩沖液，混合均勻，經放射滅活處理，冷凍。
實施例6腫瘤細胞表達GM-CSF及抑制TGF-β的疫苗的制備實施例1方法制備的疫苗500×106細胞/mL，加入5％DMSO，8％Pentastarch，2％人血清白蛋白(HSA)的磷酸生理條件緩沖液，混合均勻，經放射滅活處理，冷凍。
實施例7腫瘤細胞表達GM-CSF及HSP90并抑制TGF-β的疫苗的制備實施例2方法制備的疫苗100×106細胞/mL，加入5％DMSO，8％Pentastarch，2％人血清白蛋白(HSA)的磷酸生理條件緩沖液，混合均勻，經放射滅活處理，冷凍。
實施例8腫瘤細胞表達GM-CSF及HSP90并抑制TGF-β的疫苗的制備實施例2方法制備的疫苗10×106細胞/mL，加入5％DMSO，8％Pentastarch，2％人血清白蛋白(HSA)的磷酸生理條件緩沖液，混合均勻，經放射滅活處理，冷凍。
權利要求
1.一種抗癌疫苗，通過免疫調節基因的內源性表達，輔助機體免疫系統對疫苗所攜帶的腫瘤細胞抗原的識別，激發機體抗癌免疫機能，其特征在于，疫苗成分為經過免疫調節基因修飾的腫瘤細胞系。
2.權利要求1的疫苗，其特征在于，所述腫瘤細胞系攜有外源性的免疫調節基因，所述免疫基因的調節包括增強基因表達和抑制基因表達。
3.權利要求1的疫苗，免疫調節基因與腫瘤細胞系在體外重組而賦予腫瘤細胞系以新的基因表達特征，所述腫瘤細胞系是體外傳代的各類人類腫瘤細胞系，針對所制備疫苗的抗癌類型而選擇，其特征在于，所述免疫調節基因選自GM-CSF，TGF-β，HSP90，TAP-1，IL-2，IL-4，IL-12，B7.1，B7.2，CTLA4等。
4.權利要求1的疫苗，其特征在于，含有有效量的經過免疫調節基因修飾的腫瘤細胞系和生理上可接受的輔助成分，所述輔助成分選自DMSO，Pentastarch，血清白蛋白，緩沖溶液，水，疫苗佐劑，保護劑，穩定劑等。
5.權利要求4的疫苗，其特征在于，所述有效量的經過免疫調節基因修飾的腫瘤細胞系的量是0.1-500×106細胞/mL。
6.權利要求4的疫苗，其特征在于，所述腫瘤細胞系經放射滅活處理，所述輔助成分選自5％DMSO，8％Pentastarch，2％人血清白蛋白的磷酸緩沖液。
7.權利要求1的疫苗在制備抗癌疫苗藥物制劑中的應用。
8.權利要求7的應用，其特征在于，所述癌為肝癌，肺癌，腸癌，胃癌，鼻咽癌，宮頸癌，乳癌，頭頸癌，胰腺癌，白血病等。
9.權利要求1的疫苗的制備方法，其特征在于，免疫調節基因與腫瘤細胞系在體外重組進行構建，經過以下步驟a經過免疫調節基因修飾的腫瘤細胞系的制備，其步驟為以病毒或質粒DNA載體導入外源基因，續而進行穩定細胞系篩選而得到。b經過免疫調節基因修飾的腫瘤細胞系經放射滅活處理和生理上可接受的輔助成分混合制成，所述輔助成分選自DMSO，Pentastarch，血清白蛋白，緩沖溶液，水，疫苗佐劑，保護劑，穩定劑等。
10.權利要求9的制備方法，其特征在于，經過免疫調節基因修飾的腫瘤細胞系量是0.1-500×106細胞/mL，調節基因選自GM-CSF，TGF-β，HSP90，TAP-1，IL-2，IL-4，IL-12，B7.1，B7.2，CTLA4等，所述輔助成分選自5％DMSO，8％Pentastarch，，2％人血清白蛋白的磷酸緩沖液。
全文摘要
本發明涉及治療用抗癌疫苗及其制備，特別涉及腫瘤細胞系通過免疫調節基因修飾作為抗癌疫苗的制備方法及其在抗腫瘤治療中的應用，疫苗的主要成分為經過免疫調節基因修飾的腫瘤細胞系，所述免疫調節基因是GM－CSF，TGF－β，HSP90，TAP－1，IL－4，IL－2，IL－12，B7.1(CD80)，B7.2(CD86)等。
文檔編號A61P35/00GK1824328SQ200510135330
公開日2006年8月30日 申請日期2005年12月30日 優先權日2005年12月30日
發明者俞德超, 姜敏 申請人:俞德超, 姜敏