一種斑點叉尾鮰愛德華氏菌病疫苗的制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及水產養殖病害防治領域，具體涉及一種斑點叉尾鮰愛德華氏菌病疫苗 的制備方法。
【背景技術】
[0002] 斑點叉尾鮰（IctalurusPunctatus (Raf inesque)亦稱溝艙（ChannelCatf ish)，屬 于鯰形目（Siluriformes)、鮰科（Ictaluridae)魚類。具有食性雜、生長快、適應性廣、易 飼養、易起捕以及肉質上乘等優點，是世界聞名的養殖品種和游釣對象。斑點叉尾鮰含肉率 高，而且營養豐富，據測定，含肉率為75. 71 % ;肌肉中粗蛋白占19. 42%，脂肪占1. 01 %，水 分占77. 58%，灰分占1. 12%，碳水化合物占0. 87% ;肌肉中含有18種氨基酸，占肌肉總量 的18. 72%，其中人體必需氨基酸占總氨基酸的42. 26%。礦物質含量中Fe、Zn的含量較 高，而對人體健康有害的物質如Pb、As等的含量很低。因此，斑點叉尾鮰歷來深受東南亞各 國和港、澳市場的歡迎，是我國外貿出口的重要水產品之一。當前隨著斑點叉尾鮰養殖規模 的擴大，集約化養殖程度的提高，其病害的危害也越來越大，其危害程度有加劇趨勢，其常 見病有：水霉病、腐皮病、出血性腐敗癥、愛德華氏菌病、柱狀病、小瓜蟲病、魚波豆蟲病等， 特別是斑點叉尾鮰愛德華氏菌病傳染性強，發病率高、死亡率最高，可造成魚種、成魚大量 死亡，給養殖戶造成較大經濟損失。其病原體是愛德華氏菌（Edwardsiella tarda)，是該菌 廣泛分布于自然界，菌體短桿狀，具周鞭毛，有動力，革蘭氏染色陰性。當皮膚受傷可使病原 菌侵入機體而發病，引起外傷的主要原因有捕撈損傷和寄生蟲寄生損傷等。
[0003] 近幾年來，國產、進口的藥物對斑點叉尾鮰愛德華氏菌病均無明顯療效或成本太 高，效果不明顯。只能通過免疫的途徑進行預防，而這種疫苗目前在還是空白。

【發明內容】

[0004] 本發明提供了一種斑點叉尾鮰愛德華氏菌病疫苗的制備方法，本發明成本低廉， 操作方便，可有效提高斑點叉尾鮰免疫力，防治斑點叉尾鮰愛德華氏菌病發生。
[0005] 本發明是通過下面的技術方案來實現的。
[0006] -種斑點叉尾鮰愛德華氏菌病疫苗的制備方法，其特征在于，具體步驟如下：
[0007] (1)、提取菌種：從患有明顯愛德華氏菌病癥狀的斑點叉尾鮰肝臟、腎臟、血液、腹 水中分離出病原菌愛德華氏菌，立即放入4-8°C的冰箱中保存；
[0008] (2)、感染：將分離的病原菌接種于健康的斑點叉尾鮰體內，在室內進行感染試驗， 每只斑點叉尾鮰接種的病原菌數為1-2X10 9個，檢查是否有毒力，證明確有毒力才用作制 疫苗材料；
[0009] (3)、取材：取上述斑點叉尾鮰發病組織材料，稱重，每克組織材料中加0. 85%生 理鹽水10毫升，用研缽或勻漿器進行勻漿，制成10%濃度的組織懸液，將制得的組織懸液 直接置于-30°C~-40°c低溫冰箱中保存，或者向制得的組織懸液中按10%加入50%的磷 酸緩沖甘油，將其置4-8 °C的冰箱中保存。
[0010] (4)、懸液制備：將步驟（3)分離出的致病菌愛德華氏菌接種在普通瓊脂營養基或 肉湯培養基內，培養24-48小時，加入少量生理鹽水，用接種環將菌苔刮下，充分振蕩，制成 細菌分布均勻的懸液；
[0011] (5)、擴大培養：取單個菌落在25-30°C條件下培養48-72小時，振蕩使培養斜面上 的菌落洗下，或用滅菌接種環輕輕刮下，進行滅活處理；
[0012] (6)、滅活：將擴大培養結束的愛德華氏菌懸液搖勻，放入60-70 °C恒溫水浴 1. 5-2. 5小時滅活或32°C恒溫水浴中70-73小時滅活，即制成滅活疫苗；
[0013](7)、合成：將滅活后的菌液置于高速離心機中，用3000轉/分離心機離心30-40 分鐘，分離出上清液，向分離出的上清液中添加一定量得青霉素、鏈霉素和濃度為10%的福 爾馬林溶液，并搖勻，其中，每10毫升上清液中加入青霉素8000單位、鏈霉素8000單位， 10 %濃度的福爾馬林溶液0. 1毫升；
[0014] (8)、稀釋：用0.85%的無菌鹽水稀釋滅活菌液至濃度為5父10 9(^11/1111;
[0015](9)、分裝：將稀釋后的滅活菌液，置于4_8°C冰箱中保存備用；
[0016] (10)、檢驗：對上述稀釋好的滅活菌液進行無菌、安全及免疫效果三項檢驗，要求， 滅活菌液中沒有活菌存在，滅活細菌的安全的系數要達到100%，免疫保護率達到80%以 上；
[0017](11)、檢驗合格后的滅活菌液，繼續置于4_8°C冰箱中保存備用。
[0018] 步驟（7)合成時，每10毫升上清液中加入青霉素8000單位、鏈霉素8000單位， 10%濃度的福爾馬林溶液0. 1毫升。
[0019] 步驟（10)所述的無菌檢驗方法具體操作是：提取0. 2ml滅活菌樣本接種在普通營 養瓊脂培養基上，在25-28°C條件下培養48小時，觀察是否形成菌落，若形成菌落則說明疫 苗含菌，必須重新滅活，只有在瓊脂平板上沒有出現菌落出現才說明滅活徹底，滅活菌液中 確實沒有活菌存在。
[0020] 步驟（10)所述的安全檢驗方法具體操作是：對當年健康斑點叉尾鮰魚種進行腹 腔注射，每尾注射0. 3-0. 5毫升，在水溫25-28°C的水缸中飼養，經15d觀察無發病或死亡說 明該滅活細菌是安全的，必須做到100 %安全才可使用。
[0021] 步驟（10)所述的免疫效果檢驗方法具體操作是：在給健康斑點叉尾鮰接種上述 制備的疫苗，二周后進行攻毒，觀察免疫保護率，具體操作方法是取上述疫苗，每尾斑點叉 尾鮰注射疫苗量為〇. 3-0. 5ml，每天觀察斑點叉尾鮰的發病及癥狀等情況并做好記錄，另外 用新鮮的或甘油保存的病魚組織制成的未經滅活處理的濃度為10%的組織懸液，分別注射 到已注射過疫苗的斑點叉尾鮰和沒有注射過疫苗的斑點叉尾鮰體內進行對照，每尾按0. 5 毫升進行腹腔注射，繼續觀察15天，如果對照組全部發生愛德華氏菌病，死亡率在70%以 上，病斑點叉尾鮰癥狀與天然發病的癥狀一樣或相似，而免疫組仍健康存活，免疫保護率在 80%以上，證明此疫苗有效。
[0022] 免疫方法：
[0023] 1、注射法。
[0024] ①注射部位：一般通過肌注或腹腔注射進行免疫，這樣操作用量較均，避免浪費。
[0025] ②注射時間：一般在放養魚種階段進行。
[0026] ③注射劑量：注射一次見效，注射劑量：魚苗為〇. 3-0. 5毫升/尾，成魚為2毫升/ 公斤，每毫升疫苗中含有50億菌，
[0027] 2、口服方法三天為一個療程，魚苗第一天用量為100毫升/公斤飼料，第二、三天 減半；成魚第一天用量為150毫升/公斤飼料，第二天為100毫升/公斤飼料，第三天為50 毫升/公斤飼料。在菌苗拌入飼料時，要攪拌均勻，同時菌苗要在投喂前1-4小時拌入飼料， 不宜過早，切忌過夜，以免菌苗變質，一般拌有菌苗的飼料為平時每日投喂量的1/5或2/5， 等拌有菌苗的飼料吃完后再投放其余飼料。
[0028] 3、浸浴免疫適用于大批魚群的免疫，目前在國內應用于生產性魚池的浸浴免疫方 法有：疫苗加莨菪堿法，即用0. 5%濃度下充氧浸浴3小時。
[0029] 本發明的有益效果：
[0030] 本發明方法制備的斑點叉尾鮰愛德華氏菌病疫苗，具有成本低廉，操作方便，可有 效提高斑點叉尾鮰免疫力，對斑點叉尾鮰保護率可以達到80%以上，且防治效果顯著，操作 方便，易于實現，無任何副作用，可給斑點叉尾鮰養殖戶帶來巨大的經濟效益和社會效益。
【具體實施方式】
[0031] 斑點叉尾鮰愛德華氏菌病疫苗的制備方法，具體操作步驟如下：
[0032] 1、提取菌種：從患有明顯愛德華氏菌病癥狀的斑點叉尾鮰肝臟、腎臟、血液、腹水 中分離出病原菌愛德華氏菌，立即放入4_8°C的冰箱中保存；
[0033] 2、感染：將分離的病原菌以1-2X 1〇7只的濃度接種于健康的斑點叉尾鮰體內，感 染試驗在室內進行，檢查是否有毒力，證明確有毒力才用作制疫苗材料；
[0034] 3、取材：取上述斑點叉尾鮰發病組織材料，稱重，每克組織材料中加0.85 %生 理-30°C~-40°C低溫冰箱中保存，或者放入50%的磷酸緩沖甘油中，置4-8°C的冰箱中保 存（使用時一定要用無菌蒸餾水沖洗3次，最后用生理鹽水沖洗1次），按上述從發病的斑 點叉尾鮰體內提取菌種的方法分離出愛德華氏菌；
[0035] 4、懸液制備：將致病菌愛德華氏菌接種在普通瓊脂營養基或肉湯培養基內，培養 24-48小時，加入少量生理鹽水，用接種環將菌苔刮下，經過振蕩，使成濃厚懸液。須使細菌 分布均勻，切忌成塊、成團，如果是液體（如肉湯）培養就不必用鹽水洗刮；
[0036] 5、擴大培養：取單個菌落在25_30°