發的免疫反應能產生減少腦內積的特異性功能抗體，并避免具有神經炎性的 自身免疫T細胞的產生，以Αβ1 15為基礎開發Αβ表位疫苗是當前國內外AD疫苗的發展趨 勢。而Αβ115是免疫原性很弱的內源性小分子肽，克服免疫耐受、增強Αβ115免疫原性、促 進Th2型免疫反應、提升Αβi15抗體產生是Αβ表位疫苗和AD疫苗開發的關鍵技術問題。 故本發明以Αβi15為功能表位，設計新穎融合蛋白抗原，解決當前Αβ表位疫苗的不足。
[0023] 天門冬酰胺酶II(L-AspraginaseΒ,ASE)是一種對腫瘤細胞具有選擇性抑制作 用的藥物，至今已有30多年的臨床應用史，對急性淋巴細胞白血病的療效最好，對急性粒 細胞型淋巴細胞、急性單核細胞白血病、惡性淋巴瘤也有一定療效。臨床使用中，ASE顯示 出一定的免疫原性，會誘導部分反復使用該藥的患者產生Th2免疫反應。在分子結構上， ASE是由四個相同亞基聚合形成的自聚化蛋白。大腸桿菌（Escherichiacoli)和歐文氏菌 (Erwinia)是藥用ASE的主要種屬來源，兩種來源的ASE理化性質接近、結構類似。大腸桿 菌天門冬酰胺酶11伍8(：1161'；[(31113(301；[1^-厶8口抑8；[1^86 1330厶）易于生產、免疫原性強。所 以本發明選擇EcA作為載體蛋白用于Αβ表位疫苗的制備。
[0024] 輔助性Τ細胞表位（ThE)是特異性強化Th細胞活化、增殖和分化的多肽片段，能 通過促進B細胞分化為漿細胞而提高B細胞表位的免疫原性，在表位疫苗的制備中廣泛應 用。當前常用的ThE主要有破傷風毒素Th表位（TetanusToxoidTh-cellepitope,TTe) 和人為設計的通用型HLA-DR結合表位（PanHLA-DRbinding印itope，PADRE)等。因此本 發明優選了表位PADRE作為空間肽連接EcA和Αβi15，進一步提高Αβ表位免疫原性的同 時也使新穎融合蛋白兩個功能域之間的空間位阻減到最小程度。
[0025] 因此，在本發明中，一個優選的方案，所述的用于制備Αβ表位疫苗的融合蛋白將 大腸桿菌天門冬酰胺酶II(EcA)置于融合蛋白的Ν-端，作為疫苗的載體蛋白；將Αβ42功能 Β細胞表位（Αβ115)置于融合蛋白的C-端，作為疫苗的核心抗原部分；將PADRE表位置于 融合蛋白的中部，不僅作為EcA和Αβi15空間連接，同時也可作為疫苗的效應增強元件。
[0026] 本發明將獲得的EcA、PADRE和Αβi15編碼基因克隆入質粒，構建表達載體，通過 原核或者真核細胞表達獲得表達蛋白作為疫苗免疫原。
[0027] 本發明的融合蛋白可以通過多種方式制備獲得，包括但不限于：a)化學合成；b) 將目的基因克隆入適當的載體，表達出目的融合蛋白。所述融合蛋白的三個功能片段之間 可以是帶有連接肽（Linker)的或直接相連接的；優選的，第一部分EcA和第二部分ThE之 間可用直接相連，第二部分ThE和第三部分Αβ115用連接肽（Linker)進行連接，在保證了 各自功能基團的獨立性的同時也有助于形成穩定的空間結構，幫助Αβi15表位有效呈遞到 融合蛋白四聚分子的表面。
[0028] 在本發明中，用于克隆入目的基因的載體包括任何原核細胞、酵母細胞、哺乳動物 細胞或昆蟲細胞轉化用載體，或病毒載體，尤其是各種市售的載體或病毒載體。包括但不限 于：pET、pGEX、pcDNA、pVAX、pCI等。
[0029] 在本發明中，可用于轉化所述融合基因的載體的細胞為原核或真核生物細胞，比 如E.coli、CHO、HEK293 細胞等。
[0030] 在本發明中，所述的融合蛋白在疫苗中的存在形式包括但不限于以下幾類：a)大 腸桿菌天門冬酰胺酶II(EcA)-輔助性T細胞表位（PADRE)-Ai34#々能表位（Αβι15)融合 蛋白；b)包含大腸桿菌天門冬酰胺酶II(EcA)-輔助性Τ細胞表位（PADRE)-Αβ42功能表位 (Α?^ 15)融合蛋白編碼基因的載體；c)含有b)所述的載體并且可表達所述融合蛋白的細 胞。在接種時，可直接給予a)、b)、c)任一所述的存在形式，以及藥學上可接受的載體。
[0031] 在本發明中，"藥學上可接受的"成分是適用于人和/或動物而無過度不良副反應、 有合理的效益/風險比的物質。
[0032] 在本發明中，"藥學上可接受的載體"是用于將具有活性的成分傳送給動物或人的 藥學上可接受的溶劑、懸浮劑或賦性劑。所述的載體可以是液體或固體。
[0033] 本發明所構建的融合蛋白所制備的Αβ表位疫苗，經皮下注射免疫小鼠的方法， 證實其可以突破免疫耐受、強化Αβi15免疫原性，誘導很強的針對Αβ42的特異性體液免 疫，并誘導細胞免疫向利于抗體生成的Th2方向偏移，具有比傳統疫苗更好的有效性和安 全性。
【附圖說明】
[0034] 圖1顯示了融合蛋白ETA和EPA的結構模式圖。A為融合蛋白ETA的結構模式圖； B為融合蛋白EPA的結構模式圖。
[0035] 圖2顯示了融合蛋白ETA和EPA表達質粒pETA和pEPA的構建示意圖。A為表達 質粒pETA的結構模式圖；B為表達質粒pEPA的結構模式圖。
[0036] 圖3顯不了表達質粒pETA和pEPA正、反向測序結果的拼接序列。下劃線字母表 示開放閱讀框序列，黑體字表示限制性內切酶NcoI、BamHI和Xhol位點。A為融合蛋白EPA 表達載體質粒pEPA測序結果；B為融合蛋白ETA表達載體質粒pETA測序結果。
[0037] 圖4顯示了融合蛋白制備結果。A為融合蛋白EPA的表達、提取與分離純化， Μ:蛋白質分子量標準，1 :誘導表達EPA后的細菌總蛋白，2 :細菌裂解上清總蛋白，3 : Ni-s印harose?HP穿透峰，4-8 :分別為20、80、100、300和500mmol/L咪唑洗脫峰；Β為融 合蛋白ETA的表達、提取與分離純化。Μ:蛋白質分子量標準，1 :宿主細菌BL21總蛋白，2 : 誘導表達ΕΤΑ后的細菌總蛋白，3 :細菌裂解上清總蛋白，4 :細菌裂解沉淀總蛋白，5 :洗滌 后的包含體，6 :Ni-s印harose?HP親和純化后的變性包含體蛋白，7 :透析復性后的ΕΤΑ蛋 白，8 :經過SephacrylS-200純化后的復性蛋白。
[0038] 圖5顯示了融合蛋白EPA的抗原性鑒定結果。A為融合蛋白與小鼠抗組氨酸標簽 (His*tag)抗體發生抗原-抗體反應的Western-blot檢測結果，1:純化后的融合蛋白EPA， 2 :純化后的載體蛋白EP(EcA-PADRE) ;B為融合蛋白與小鼠抗Αβi15單克隆抗體（6E10)發 生抗原-抗體反應的Western-blot檢測結果，1:純化后的融合蛋白EPA，2:純化后的載體 蛋白EP(EcA-PADRE)。
[0039] 圖6顯示了融合蛋白EPA的聚集性鑒定結果。采用Native-PAGE檢測，1:純化后的 融合蛋白EPA(上樣緩沖液中含SDS和β-ME)，2 :純化后的天然EcA(上樣緩沖液中含SDS 和β-ME)，3 :純化后的EPA融合蛋白（上樣緩沖液中不含SDS和β-ME)，4 :純化后的天然 EcA(上樣緩沖液中不含SDS和β-ME)。
[0040] 圖7顯示了融合蛋白EPA中Αβi15表位的表面可及性鑒定結果。
[0041] 圖8顯不了融合蛋白針對Αβ42的體液免疫應答強度的體內鑒定結果。
[0042] 圖9顯示了融合蛋白ΕΡΑ誘導的抗-Αβ42抗體的表位特異性鑒定結果。
[0043] 圖10顯示了融合蛋白ΕΡΑ誘導產生的抗-Αβ42抗體的亞類分布鑒定結果。
[0044] 圖11顯示了融合蛋白ΕΡΑ誘導產生的抗-Αβ42抗體的功能性鑒定結果。Α為融合 蛋白免疫血清經Αβ42預孵育后與AD模型小鼠腦切片進行的免疫組化檢測結果；B為融合 蛋白免疫血清與AD模型小鼠腦切片進行的免疫組化檢測結果；C為Αβ42標準抗體后與AD 模型小鼠腦切片進行的免疫組化檢測結果。
【具體實施方式】
[0045] 以下是本發明的具體實施例，所述的實施例是用于描述本發明的使用和用途，而 不是限制本發明。
[0046] 實施例中采用的質粒、菌種、動物及試劑如下： 質粒、菌種和動物：質粒pET28a(+)和pMD19T-EcA、菌種E.coliDH5a和BL21(DE3)為 本實驗室保存。4~6周齡雌性C57BL/6小鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。
[0047]試劑：限制性內切酶Ncol、BamHI、Xhol，DNA聚合酶ExTaq、rTaq，dNTP，以及DNA分子量標準購自TaKaRa公司；T4DNA連接酶、蛋白質分子量標準，及預染蛋白質Marker為 Fementas公司產品；胰蛋白胨和酵母提取物購自0X0ID公司；質粒抽提試劑盒為OMEGA 公司產品；PCR產物純化試劑盒和瓊脂糖膠回收試劑盒購自上海華舜生物技術有限公司； Ni-sepharose?HP填料，SephacrylS-200 凝膠，以及層析柱為GEHealthcare公司產品； 小鼠抗組氨酸標簽抗體購自Invitrogen公司；小鼠抗Αβ115單克隆抗體（6E10)為Covance 公司產品；H