專利名稱：一種雞亞單位三聯疫苗及其制備和應用的制作方法
一種雞亞單位三聯疫苗及其制備和應用技術領域
本發明屬于禽類疫苗制造領域，具體涉及一種雞亞單位三聯疫苗及其制備和應用，即一種雞新城疫-傳染性支氣管炎-傳染性法氏囊病三聯疫苗。
背景技術：
雞新城疫(newcastle disease，ND)是由雞新城疫病毒(NDV)引起的禽類急性傳染病，傳播速度快，長期以來給我國養禽業帶來了巨大的威脅。雞新城疫活疫苗雖然效果好、 價格低廉、使用方便，但其免疫期短、免疫易受母源抗體干擾，且容易引起呼吸道副作用，干擾實驗室診斷病毒分離，因此，1980年以來，使用雞新城疫滅活疫苗逐漸成為我國雞場防治雞新城疫的常規方法之一。
雞傳染性法氏囊病(Infectious Bursal Disease, IBD)又稱雞傳染性腔上囊病， 是由傳染性法氏囊病毒引起的一種急性、接觸傳染性疾病。以法氏囊發炎、壞死、萎縮和法氏囊內淋巴細胞嚴重受損為特征，能夠引起雞的免疫機能障礙，干擾各種疫苗的免疫效果。 該病發病率高，是目前養禽業最重要的疾病之一。而且，近年來由于超強毒的出現，傳統的疫苗免疫失敗屢屢發生，因此，有必要篩選雞傳染性法氏囊病毒的不同等位基因，并借助基因工程亞單位疫苗的方法為雞傳染性法氏囊病預防提供了一條新的途徑。
雞傳染性支氣管炎(Avian infectious bronchitis, IB)是急性接觸性傳染性呼吸道疾病，其特征為病雞咳嗽、噴嚏、氣管啰音，蛋雞產蛋數量和質量下降。IB為世界各國集約化養雞普遍存在的疫病，有的地區陽性率可達100%。我國主要流行的病原血清型是 Massachusetts型，該型毒株異型毒株也能產生較好的免疫力，我國普遍選用M41株做為疫苗毒株。
為了有效控制ND、IB和IBD，減少接種次數，便于生產應用，因此，有必要提供一種雞新城疫、傳染性支氣管炎和傳染性法氏囊病三聯疫苗來滿足市場的要求。發明內容
本發明的目的是制備一種可以同時預防雞新城疫、雞傳染性支氣管炎和雞傳染性法氏囊病特別是超強毒感染的疫苗，其中的雞傳染性法氏囊病部分是采用大腸桿菌表達的主要抗原保護性蛋白VP2蛋白制成的亞單位疫苗。
本發明的三聯疫苗由抗原和疫苗輔劑組成，所述的抗原為雞新城疫病毒、雞傳染性支氣管炎病毒和序列為SEQ ID NO 1的雞傳染性法氏囊病VP2蛋白。
上述的三聯疫苗的制備方法，是將新城疫病毒接種雞胚后，收獲胚液加入甲醛滅活；將雞傳染性支氣管炎病毒接種雞胚后，收獲胚液加入甲醛滅活；然后將滅活的新城疫病毒胚液、雞傳染性支氣管炎病毒胚液與雞傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白混合后，加入疫苗佐劑乳化制成的。
上述的新城疫病毒為新城疫病毒Clone30。
上述的傳染性支氣管炎為傳染性支氣管炎M41。
本發明三聯疫苗免疫21日齡的雞，可同時預防雞新城疫、雞傳染性支氣管炎和雞傳染性法氏囊病，免疫效果與雞新城疫單苗、雞傳染性支氣管炎滅活疫苗及雞傳染性法氏囊病單苗效果相似，達到了減少免疫次數，降低應激的目的。
具體實施例方式IBDV的主要結構蛋白VP2蛋白是最主要宿主保護性抗原，本發明是用PCR方法擴增了 IBD超強毒的VP2基因，克隆到pET-28a載體上，轉化BL21 (DE3)，經IPTG誘導后VP2蛋白獲得了表達，將表達菌體高壓勻漿破碎后離心取上清即為VP2蛋白溶液。新城疫病毒Clone30株接種10日齡SPF胚，收取培養48 96小時的雞胚液，超濾濃縮法將病毒液濃縮，加入終濃度為0. 1%的甲醛。雞傳染性支氣管炎病毒M42株接種l(Tll日齡SPF胚，收取培養24 48小時的雞 胚液，超濾濃縮法將病毒濃縮，加入終濃度為0. 1%的甲醛。將VP2蛋白液與新城疫病毒液、雞傳染性支氣管炎病毒液混合后乳化配苗。下面結合具體的實施例對本發明的雞新城疫-傳染性支氣管炎-傳染性法氏囊病毒VP2亞單位三聯疫苗進行詳細的描述。一、新城疫病毒液的制備將新城疫病毒Clone30株(購自中國獸醫藥品監察所)，用滅菌生理鹽水做適當稀釋，經尿囊腔接種擴10日齡易感雞胚，每胚0. 1ml，接種后密封針孔，直36 37°C繼續孵育。棄去48小時前死亡雞胚，此后4 8小時照蛋一次，死亡胚隨時取出，直至96小時全部取出，置疒8°C冷卻12 24小時。收獲雞胚尿囊液及羊水，棄去血凝價低于1:128，進行無菌檢驗。新城疫病毒液的濃縮將收獲的病毒液用二級預過濾柱除去大顆粒雜質，然后用病毒超濾法濃縮系統將新城疫病毒液濃縮至原體積的1/4。滅活將濃縮后的病毒液置于滅活罐內，加入終濃度為0. 1%的甲醛，隨加隨攪拌，使其充分混合。37°C滅活16小時。二、雞傳染性支氣管炎病毒液的制備將雞傳染性支氣管炎病毒M41株(購自中國獸醫藥品監察所)用滅菌生理鹽水適當稀釋，經尿囊腔接種l(Tll日齡易感雞胚，每胚0. lml，接種后密封針孔，直36 37°C繼續孵育。棄去24小時前死亡雞胚，此后4飛小時照蛋一次，死亡胚隨時取出，直至48小時全部取出，置2 8°C冷卻12 24小時。收獲雞胚尿囊液及羊水。雞傳染性支氣管炎病毒液的濃縮將收獲的病毒液用二級預過濾柱除去大顆粒雜質，然后用病毒超濾法濃縮系統將新城疫病毒液濃縮至原體積的1/4。滅活將濃縮后的病毒液置于滅活罐內，加入終濃度為0. 1%的甲醛，隨加隨攪拌，使其充分混合。37°C滅活16小時。三、VP2基因的篩選用Primer5. 0軟件設計了一對擴增雞傳染性法氏囊病病毒VP2全基因引物，并在上游引物5'端加入保護性堿基及BamH I酶切位點，在下游引物的5'端加入保護性堿基和Xho I酶切位點，引物序列為
Primer I 5/ -GCG TCG ACA TGA CAA ACC TGC AAG ATC - 3'
Primer 2 5/ -CCC TCG AGT TAT CCT TAT GGC CCG GAT T -3'
取200 μ 用臨床分離的疑似IBDV的病料感染的雞胚接種尿囊膜懸液上清液，按 RNAisoReagent說明書所述方法提取病毒RNA,按反轉錄試劑盒使用說明書進行反轉錄合成cDNA，進行PCR擴增，擴增體系為(50 μ ):10XPCR Buffer δμΙ, ΝΤΡ (IOmM each) μ , 上、下游引物(IOmM)各 μ ，cDNA 3 μ , 25mM MgC12 4 μ , Taq酶(5υ/μ1 ) μ1，(ΜΗ20 34μ1 ;PCR 反應參數95 °C 5min，95°C lmin，58°C 2min，72°C 2min，35 個循環，72 °C IOmin。得到一個1300bp左右的片段，切膠回收該片段，與pMD-18T載體連接。PCR回收片段 6μ1，Τ 載體 2μ1 (稀釋 10 倍后)，T4 DNA 連接酶 μ1，Τ4 buffer 2. 5μ1，水13. 5μ1，總計25μ1。16°C過夜連接，取20 μ 連接產物轉化感受態大腸桿菌JM109，挑選10個白色菌落培養，提取質粒鑒定正確的選取3個測序，結果3個質粒的測序結果都一致，證明獲得的核苷酸片段在擴增的過程中沒有產生錯誤，其核苷酸序列為SEQ ID Ν0:2，翻譯的氨基酸序列為 SEQ ID NO: I。
將該核苷酸序列在NCBI上Blast比對，有十幾個堿基發生了點突變，表明該毒株為一株新的流行毒株。這是由于VP2蛋白是主要宿主保護性抗原，經常發生突變而導致抗原性發生差異。
VP2重組蛋白的表達
將鑒定正確的上述一個質粒用BamH I和Xho I雙酶切回收基因片段，與用這兩個酶切的pET-28a載體連接，轉化感受態大腸桿菌JM109，提取質粒鑒定正確后轉化感受體的 BL21 (DE3)，挑取單菌落，轉接5mlLB小管培養基，37°C振蕩培養3 4小時至0D600為O. 6 時，加入終濃度為O. 8mM的IPTG誘導4飛小時，SDS-PAGE電泳結果證實為分泌表達。
將表達菌用5倍菌體濕重PBS重懸，高壓勻漿破碎細菌，離心取上清，做瓊脂免疫擴散試驗，結果瓊擴效價不低于1:64。
VP2蛋白的純化
用鎳柱純化，200mM的咪唑洗脫，洗脫液用PBS透析過夜。所得透析液即為純化的蛋白，可用于制苗。
VP2亞單位疫苗的制備
取注射用白油94份、司本-80 6份，混合后加入硬脂酸鋁2份加熱溶化，116°C滅菌30分鐘，做為制苗用油相；加入滅菌的吐溫-80 4份，然后加入上述制備的VP2重組蛋白發酵提取液96份，充分振搖，使吐溫-80完全溶解，做為制苗用水相；取油相3份放于膠體磨內，開動電機慢速轉動攪拌，同時徐徐加入水相I份，加完后再以10000r/min攪拌2 5 分鐘，在終止攪拌前加入I %硫柳汞溶液，使其最終濃度為O. 01 %。
VP2亞單位疫苗的免疫效果
將20只SPF雞隨機分為兩組，每組10只，其中一組在21日齡時以O. 3ml/只的劑量皮下注射VP2亞單位疫苗，免疫21日后連同不免疫對照組每只經點眼途徑接種100BID 雞傳染性法氏囊病強毒BC6-85株毒液，攻毒后每天觀察雞只的臨床表現及死亡情況，記錄發病和死亡雞數，剖檢觀察死亡雞法氏囊等病變，72 96小時撲殺存活雞，逐只剖解，觀察法氏囊等病理變化。結果不免疫對照組8只雞發病，而免疫組雞只無發病。上述結果證明本發明制備的VP2亞單位疫苗具有很好的免疫原性。四、三 聯疫苗的制備取注射用白油94份、司本-80 6份混合后加入硬脂酸鋁2份，加熱溶化，116°C滅菌30分鐘做為制苗用油相；加入滅菌的吐溫-80 4份；將上述制備的滅活新城疫病毒液、滅活的傳支病毒液和VP2重組蛋白發酵提取液按照I :1 2的比例混合均勻制成抗原液；取混和均勻的抗原液96份做為制苗用水相；取油相3份放于膠體磨內，開動電機慢速轉動攪拌，同時徐徐加入水相I份，加完后再以10000r/min攪拌2 5分鐘，在終止攪拌前加入I %硫柳汞溶液，使其最終濃度為0. 01%，完成三聯疫苗的制備。對于三聯疫苗中活新城疫病毒液、滅活的傳支病毒液和VP2重組蛋白發酵提取液的比例，本發明并不做特別的限定，只要制備的三聯疫苗能夠有效的預防雞新城疫、雞傳染性支氣管炎和雞傳染性法氏囊病即可。三聯疫苗的使用效果將40只21日齡SPF雞隨機分為4組，每組10只，其中兩組皮下注射免疫三聯疫苗0. 3ml，免疫后21日，取一組免疫雞連同不免疫的對照用新城疫北京株攻毒，另一組免疫雞連同另一組不免疫的對照用雞傳染性法氏囊病病毒攻毒，結果免疫組20只雞有一只出現輕微的法氏囊癥狀，其余均無異常；而新城疫攻毒對照組10/10發病死亡，雞傳染性法氏囊病病毒攻毒對照組8/10發病。將10只21日齡SPF雞個點眼接種I羽份的雞傳染性支氣管炎活疫苗(H120)在負壓隔離器里飼養觀察，另取5只不免疫做對照。免疫后21日分別采血，分離血清測HI抗體效價，同時肌肉注射三聯苗0. 5ml。加強免疫后28日分別采血測HI抗體效價，結果二免的抗體效價幾何平均數是首免的3. 6倍，而未免疫對照組為1:4，表明該三聯疫苗傳支部分是有效的。
權利要求
1.一種三聯疫苗，由抗原和疫苗輔劑組成，所述的抗原為雞新城疫病毒、雞傳染性支氣管炎病毒和序列為SEQ ID NO 1的雞傳染性法氏囊病VP2蛋白。
2.如權利要求I所述的三聯疫苗，其特征在于所述的雞新城疫病毒為新城疫病毒Clone30o
3.如權利要求I所述的三聯疫苗，其特征在于所述的雞傳染性支氣管炎病毒為雞傳染性支氣管炎病毒M41。
4.權利要求I所述的三聯疫苗的制備方法，是將新城疫病毒接種雞胚后，收獲胚液加入甲醛滅活；將傳染性支氣管炎病毒接種雞胚后，收獲胚液加入甲醛滅活；然后將新城疫病毒胚液、傳染性支氣管炎病毒胚液和雞傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白混合后，加入疫苗佐劑乳化制成的。
5.權利要求I所述的三聯疫苗在預防雞新城疫、雞傳染性支氣管炎和雞傳染性法氏囊病中的應用。
全文摘要
本發明的目的是制備一種可以同時預防雞新城疫、雞傳染性支氣管炎和雞傳染性法氏囊病特別是超強毒感染的疫苗，包含有序列為SEQ ID NO1的雞傳染性法氏囊病VP2蛋白和新城疫病毒、雞傳染性支氣管炎病毒。本發明三聯疫苗免疫21日齡的雞，可同時預防雞新城疫、雞傳染性支氣管炎和雞傳染性法氏囊病，免疫效果與雞新城疫單苗、雞傳染性支氣管炎滅活疫苗及雞傳染性法氏囊病單苗效果相似，達到了減少免疫次數，降低應激的目的。
文檔編號A61K39/12GK102973935SQ20121050664
公開日2013年3月20日 申請日期2012年12月3日 優先權日2012年12月3日
發明者王雷, 凌紅麗, 蔣皓靜, 楊光烈 申請人:青島康地恩藥業股份有限公司, 青島寶依特生物制藥有限公司