專利名稱：Sg融合蛋白的制作方法
技術領域：
本發明涉及醫學生物學技術領域，是一種可用于預防和治療放、 化療所引起的造血損傷和具有增強免疫功能的融合蛋白。
背景技術：
放療和化療是治療多種惡性腫瘤的有效手段，腫瘤患者在放、化 療過程中造血系統最容易誘發損傷，同時出現免疫功能下降。目前同 步放化療的應用提高了腫瘤患者的生存率，但患者的造血和免疫系統 損傷加重，使得感染、出血等并發癥的發生率增加，影響療效，因此 盡快重建造血功能對治療順利進行至關重要。目前臨床常用于造血損 傷修復的藥物是GM-CSF、 G-CSF， GM-CSF主要作用于粒單系祖細 胞，促進其增殖分化，它對造血干細胞、髓系多能祖細胞以及紅系、 巨核系造血均有作用。但是它促進造血增殖的作用為暫時性，維持時 間短暫，停藥后效果即消失，因此尋找新的能夠修復造血損傷，同時 盡快恢復患者免疫功能的方法十分必要。
近年來趨化因子及其受體在造血調控中的作用日益引起人們的 關注，趨化因子超家族的成員多為分子量8 12KD的小分子蛋白，現 在已經知道有50多種趨化因子，其中基質細胞衍生因子(stromal cell derived factor,SDF-1)對造血功能的調節顯得最為突出。SDF-1屬CXC 型趨化因子，較低濃度的SDF-1能夠產生趨化及抗腫瘤免疫反應。同 時不會誘導腫瘤細胞產生對放化療的抵抗作用。SDF-1可與多種造血 生長因子協同，促進髓系、巨核系造血前體細胞的增殖與分化。
GM-CSF是一種能促進骨髓粒系、單核細胞系、巨噬細胞系發育 和成熟，增加外周血成熟粒細胞、單核細胞功能的一種細胞因子，主 要應用于各種原因引起的白細胞減少癥，與其它造血調控因子如EPO、 G-CSF不同，它不是刺激單一一種細胞增殖，而是作用于多種細胞而 發揮效應。臨床己應用于放化療患者的造血恢復，但效果不十分滿意,
大部分患者停藥后白細胞即下降，再次應用療效不佳。 發明內容:
本發明的目的是提供一種可用于預防和治療放、化療所引起的造 血損傷和具有增強免疫功能的融合蛋白。
本申請人在實驗中發現當SDF-1與GM-CSF聯用后，能夠快速趨 化、動員造血干/祖細胞，促進造血重建效應，與單獨應用GM-CSF相 比，效果更為迅速和持久。
本發明構建SDF-1與GM-CSF的融合基因，該融合基因由SDF1 基因、rhGM-CSF基因，連接肽設計合成。
SDF-1基因(genebank號AY802782)序列如SEQ IDNO:l所示， 具體序列如下
atgaacgcca aggtcgtggt cgtgctggtc ctcgtgctga ccgcgctctg cctcagcgac 60 gggaagcccg tcagcctgag ctacagatgc ccatgccgat tcttcgaaag ccatgttgcc 120 agagccaacg tcaagcatct caaaattctc aacactccaa actgtgccct tcagattgta 180 gcccggctga agaacaacaa cagacaagtg tgcattgacc cgaagctaaa gtggattcag 240 gagtacctgg agaaagcttt aaacaagagg ttcaagatg 279
rhGM-CSF基因(genebank號M11734)序列如SEQ ID NO:2所
示，具體序列如下
aaagttctct ggaggatgtg gctgcagagc ctgctgctct tgggcactgt ggcctgcagc 60
atctctgcac ccgcccgctc gcccagcccc agcacacagc cctgggagca tgtgaatgcc 120
atccaggagg cccggcgtct cctgaacctg agtagagaca ctgctgctga gatgaatgaa 180
acagtagaag tcatctcaga aatgtttgac ctccaggagc cgacctgcct acagacccgc 240
ctggagctgt acaagcaggg cctgcggggc agcctcacca agctcaaggg ccccttgacc 300
atgatggcca gccactacaa acagcactgc cctccaaccc cggaaacttc ctgtgcaacc 360
cagattatca cctttgaaag tttcaaagag aacctgaagg actttctgct tgtcatcccc 420
tttgactgct gggagccagt ccaggagtga gaccggccag atgaggctgg ccaagccggg 480
gagctgctct ctcatgaaac aagag 505
連接肽為(Gly4Ser) 3，編碼該連接肽的基因序列如SEQ ID NO:3 所示，具體序列如下
ggtggcggtg gttctggtgg cggtggttct ggtggcggtg gttct本發明提供一種SG融合蛋白，編碼該蛋白的基因具有如SEQID NO:4所示的核苷酸序列，全長為850bp，具體序列如下
勘I
Kex2
gacgggaagcccgtcagcctgagctacagatgcccatgccgattcttcgaaagccatgttgccagagcc
catgaaacaagagTGAGMTTC Stop
上述基因中，頭尾部分添加了酶切位點，CTC GAG和GM TTC;中間 部分用小寫字母表示的為目的序列，加框的為連接肽；末尾添加了終 止密碼子TGA，通過^TwI/五coi I這兩個位點亞克隆入pPIC9k載體中。
SG融合蛋白的表達，因為pPIC9K質粒載體帶有兩個Xho I位點， 分別位于1193 (MCS)和5710處，需要將5710處的Xhol進行了點 突變，對pPIC9K載體進行改造，之后才能將上述目的基因在Xho I 和EcoRI雙酶切位點轉入載體，這樣表達的蛋白為分泌蛋白，而且不 帶有任何多余的氨基酸，不會對重組蛋白的結構和功能造成影響。
本發明構建新型細胞因子SDF-1/GM-CSF (SG)，這種新型細胞 因子會具有比單一細胞因子更好的生物學功能，有望成為一種在造血 調控及抗腫瘤免疫中具有應用價值的新型細胞因子。
上述的SG融合蛋白可用于制備預防和治療放療或化療所引起的 造血損傷藥物。
上述的SG融合蛋白可用于制備增強免疫功能藥物。
圖1是改造后的pPIC9K載體的結構示意圖。
具體實施例方式
下面結合附圖和實施例對本發明作進一步描述 實施例l: SG融合蛋白的制備 1. PPIC9K- SDFl-rhGM-CSFl克隆的制備
1) SDFl-rhGM-CSFl基因委托invitrogen公司合成，裝載在 pMD18-T (購自TAKARA公司)載體中。用EcoRI和Xho I(TAKARA 公司產品)雙酶切pMD18-T-SDFl-rhGM-CSFl，割膠回收小片斷，即得 到兩端帶有EcoRI和Xho I多克隆位點的SDFl-rhGM-CSFl基因片斷。
2) pPCI9K質粒(購自Invitrogen公司)同樣用EcoRI和Xho I進 行雙酶切處理后進行瓊脂糖凝膠電泳，結果顯示條帶大小正確，割膠 后用Axygen公司膠回收試劑盒回收。
pMD18-T-SDFl-rhGM-CSFl和pPCI9K質粒酶切反應體系如下
Vector (ppic9k， pMD 18-T) 8(il ( 1嗎)
10xH Buffer 2^1
10xBSA 2pl
EcoRI 0.5jil
Xho I I
H20 7^1 Total 20^1 37°C 2—3h
3) 將酶切好的片段SDFl-rhGM-CSFl和載體PPIC9K用T4 DNA Ligase (MBI公司產品)16。C連接3小時，連接體系如下
H20 Oul T4buffer M PPIC9K (已處理) 2ul SDFl-rhGM-CSFl 6ul
T4 DNA Ligase_M
Total 10ul
4) .將連接產物PPIC9K-SDFl-rhGM-CSFl進行轉化大腸桿菌ToplO 感受態細胞,37"C培養過夜,挑取轉化子，選用pPIC9K通用引物，進行 煮菌PCR驗證。
5) .挑取其中的4個菌株抽提質粒進行測序驗證，得到正確的 pPIC9K誦SDFl畫rhGM誦CSFl克隆。
2. pPIC9K- SDFl-rhGM-CSFl亞克隆轉化酵母菌株GS115
1) 重組質粒的抽提，采用華舜公司的質粒大量提取試劑盒抽提 pPIC9k及pPic9k- SDFl-rhGM-CSFl質粒(各50ml菌液)，具體操作 依試劑盒說明書進行。獲得pPic9k及pPic9k-HbsAg質粒各約40ug， 重新測序驗證。
2) 質粒線性化，用SalI酶切pPIC9k及pPic9k-SDFl-rhGM-CSFl
質粒，條件如下
Sal I 50 U
10 XH buffer 5 ul
pPIC9k-SDFl 15 ug
ddH20 add to 50 ul
37°C 3 h
3) 將上述酶切后的質粒分別用酚-氯仿，氯仿各抽提一次，隨后加 入1/10體積3 M的NaAc(pH 4.8)和2.5倍體積的無水乙醇，-20。C放置 20 min后，15000g離心15 min沉淀DNA，質粒干燥后溶于5ul無菌 超純水中。
4) 將已線性化的pPIC9K- SDFl-rhGM-CSFl質粒DNA電轉化宿主 菌GS115感受態細胞(購自Invitrogen公司)中。將轉化產物涂布于 缺乏組氨酸的RDB營養缺陷平板，3-4天后可見重組克隆長出。電轉 化儀為Bio-Rad公司產品；電轉條件電壓，1.5KV;電容，25|LlF; 電阻，200Q;電擊時間，3.8 5ms。
3. 畢赤酵母表達菌株的篩選和條件優化
1)挑取48個長勢較好的酵母轉化菌落進行小規模發酵，用Dolt Bolting方法進行初步篩選。
①在48孔深孔版中加入3 mLBMGY培養基中，接種單菌落，于 30°C ， 250 rpm培養至OD綱約5-6 (20-24h)
② 1500g， 5min離心收集菌體，用BMMY重懸菌體，使006。。約在 10-15左右(約lmL),于3(TC，250rpm繼續培養至OD6。o約為20(6-8h)
(另取一部分菌株在YPD培養基中做快速表達實驗)。
③ 每24h向培養基中添加100%甲醇至終濃度為0.5-1.0%
④ 表達48小時后取樣，在醋酸纖維膜上點樣lul (x2)，用SDF1 抗體做Dolt Bolting檢測目的蛋白的表達情況。
2)高拷貝重組子煮菌PCR驗證Taq buffer2ul
10mMdNTPslul
10mM SHH-Flul
10mM SHH-Rlul
Taq酶0.5U
水補充至20ul
95 °C5min
95 。C30sec
50°C30sec
72 °C45 sec
以上35個循環
挑取以上7個表達菌株按以上程序進行PCR
3)將上述篩選出有表達的酵母轉化子菌株進行放大誘導表達實驗。 用SDS-PAGE和免疫印跡(WesternBolt)驗證篩選高水平表達菌株。
① .挑選上述的4個菌落和空載體對照株，接種于裝有25 ml BMGY 培養基的250 ml搖瓶中，于30。C/250 rpm培養至OD, = 2-6 (16-18 h);
② .室溫下1500 3000 g離心5min，收集菌體，用1/5到1/10原培養 體積的BMMY重懸菌體(約10 20ml);
③ .將步驟2所得的菌液置于100 ml的搖瓶中，用雙層紗布或粗棉布 封口，放置于30。C/250rpm的搖床上繼續生長；
.每24h向培養基中添加100X甲醇至終濃度為0.5 1.0%; ⑤.按時間點分別取菌液樣品，取樣量約為lml (似需要量取樣)， 置于1.5ml EP管中，最大轉速離心2 3min，分別收集上清和菌體，分
析目的蛋白的表達量和菌液最佳收獲時間。時間點一般取0、 24、 48、 72、 96和120h;
⑥.12， OOOrpm離心30分鐘，收集樣品的上清液，用SDS-PAGE和 Western blotting鑒定融合蛋白的表達。
4) SDS-PAGE
① .取第一天發酵上清15ul上樣，12%SDS PAGE檢查蛋白表達情況。
② .發酵液上清濃縮10倍SDS-PAGE電泳
實驗方法在第6天樣品發酵上清液中加入2倍體積的乙醇，-20°C 沉淀2h，用1/10體積的1Xloadingbuffer溶解，上樣15u1, 15%SDS PAGE
膠電泳，考馬斯亮藍染色，掃描膠片。
5) 表達上清的Western Blotting檢領!j
取發酵液上清原液lOul上樣，SDS-PAGE蛋白電泳完成后，將蛋 白轉印至PVDF膜上，結合一抗(SDF1單抗，鼠抗)和HRP標記 的二抗(兔抗鼠)，然后用immobion western chemiluminescent hrp substrate (MiUipore公司產品)顯色并顯影到膠片上。
將經過優化的化學全合成的SDFl-rhGM-CSFl基因裝到畢赤酵母 分泌表達載體pPIC9k上，再重組入畢赤酵母菌株GS115中，優化誘導 表達條件，并通過SDS-PAGE 、 WESTERN Blotting檢測 SDFl-rhGM-CSFl重組蛋白的表達。
體外生物學實驗顯示SG融合蛋白能促進骨髓集落細胞形成，能有 效趨化未成熟的樹突狀細胞，其作用強于GM-CSF。
SEQUENCE LISTING
〈110〉中國人民解放軍第二軍醫大學
<120> SG融合蛋白
〈130>說明書，權利要求書
<160> 4
<170〉 Patentln version 3.1
<210> 1 〈211〉 279 〈212〉 DNA <213>人工序列 〈400〉 1
atgaacgcca aggtcgtggt cgtgctggtc ctcgtgctga ccgcgctctg cctcagcgac 60 gggaagcccg tcagcctgag ctacagatgc ccatgccgat tcttcgaaag ccatgttgcc 120 agagccaacg tcaagcatct caaaattctc aacactccaa actgtgccct tcagattgta 180 gcccggctga agaacaacaa cagacaagtg tgcattgacc cgaagctaaa gtggattcag 240 gagtacctgg agaaagcttt aaacaagagg ttcaagatg 279
〈210〉 2 〈211〉 505 〈212〉 DNA 〈213〉人工序列 〈400〉 2
aaagttctct ggaggatgtg gctgcagagc ctgctgctct tgggcactgt ggcctgcagc 60 atctctgcac ccgcccgctc gcccagcccc agcacacagc cctgggagca tgtgaatgcc 120 atccaggagg cccggcgtct cctgaacctg agtagagaca ctgctgctga gatgaatgaa 180 acagtagaag tcatctcaga aatgtttgac ctccaggagc cgacctgcct acagacccgc 240
ctggagctgt acaagcaggg cctgcggggc agcctcacca agctcaaggg ccccttgacc 300
atgatggcca gccactacaa acagcactgc cctccaaccc cggaaacttc ctgtgcaacc 360
cagattatca cctttgaaag tttcaaagag aacctgaagg actttctgct tgtcatcccc 420
tttgactgct gggagccagt ccaggagtga gaccggccag atgaggctgg ccaagccggg 480
gagctgctct ctcatgaaac aagag 505
〈210〉 3 〈211〉 45 〈212〉 DNA 〈213〉人工序列 〈400> 3
ggtggcggtg gttctggtgg cggtggttct ggtggcggtg gttct 站
〈210〉 4 〈211〉 850 〈212〉 ■ <213〉人工序列 〈400〉 4
ctcgagaaaa gaatgaacgc caaggtcgtg gtcgtgctgg tcctcgtgct gaccgcgctc 60
tgcctcagcg acgggaagcc cgtcagcctg agctacagat gcccatgccg attcttcgaa 120
agccatgttg ccagagccaa cgtcaagcat ctcaaaattc tcaacactcc aaactgtgcc 180
cttcagattg tagcccggct gaagaacaac aacagacaag tgtgcattga cccgaagcta 240
aagtggattc aggagtacct ggagaaagct ttaaacaaga ggttcaagat gggtggcggt 300
ggttctggtg gcggtggttc tggtggcggt ggttct,g ttctctggag gatgtggctg 360
cagagcctgc tgctcttggg cactgtggcc tgcagcatct ctgcacccgc ccgctcgccc 420
agccccagca cacagccctg ggagcatgtg aatgccatcc aggaggcccg gcgtctcctg 480
aacctgagta gagacactgc tgctgagatg aatgaaacag tagaagtcat ctcagaaatg 540
tttgacctcc aggagccgac ctgcctacag acccgcctgg agctgtacaa gcagggcctg 600
cggggcagcc tcaccaagct caagggcccc ttgaccatga tggccagcca ctacaaacag 660
cactgccctc caaccccgga aacttcctgt gcaacccaga ttatcacctt tgaaagtttc 720
aaagagaacc tgaaggactt tctgcttgtc atcccctttg actgctggga gccagtccag 780
gagtgagacc ggccagatga ggctggccaa gccggggagc tgctctctca tgaaacaaga 840
gtgagaattc 850
權利要求
1.一種SG融合蛋白，編碼該蛋白的基因具有如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。
2、 如權利要求1所述的SG融合蛋白在制備用于預防和治療放療或化 療所弓i起的造血損傷藥物中的應用。
3、 如權利要求1所述的SG融合蛋白在制備用于增強免疫功能藥物中 的應用。
全文摘要
本發明涉及醫學生物學技術領域，目前臨床常用于造血損傷修復的藥物是GM-CSF、G-CSF，GM-CSF主要作用于粒單系祖細胞，促進其增殖分化，它對造血干細胞、髓系多能祖細胞以及紅系、巨核系造血均有作用。但是它促進造血增殖的作用為暫時性，維持時間短暫，停藥后效果即消失。本發明提供一種可用于預防和治療放、化療所引起的造血損傷和具有增強免疫功能的融合蛋白。編碼本發明SG融合蛋白的基因具有如SEQ ID NO4所示的核苷酸序列，全長為850bp。體外生物學實驗顯示本發明的SG融合蛋白能促進骨髓集落細胞形成，能有效趨化未成熟的樹突狀細胞，其作用強于GM-CSF。
文檔編號A61P7/00GK101372513SQ20081020139
公開日2009年2月25日 申請日期2008年10月20日 優先權日2008年10月20日
發明者劉永明, 居小萍, 張曉青, 斌 徐, 櫻 陳 申請人:中國人民解放軍第二軍醫大學