專利名稱：一種甘露聚糖修飾的攜帶hTRT基因腺相關病毒誘導的靶向樹突狀細胞DC疫苗及其制備方法
技術領域：
本發明屬于醫學生物工程技術領域，它涉及一種新型樹突狀細胞(DC)疫苗制備技術。該方法將hTRT基因插入腺相關病毒(AAV)，并對其進行甘露聚糖表面修飾，使其能體外靶向感染DC細胞。隨著hTRT基因在DC細胞內的穩定表達，可使DC細胞獲得持續、大量的hTRT抗原肽刺激。由于hTRT抗原為廣譜腫瘤相關抗原，在幾乎所有的腫瘤細胞均有表達，而正常細胞幾乎不表達hTRT，因此該DC疫苗刺激的淋巴細胞幾乎對所有腫瘤細胞均產生強大殺傷作用，避免了治療的毒副作用。
背景技術：
近年來，隨著對腫瘤免疫逃逸機理的認識以及腫瘤相關抗原的發現及鑒定，以樹突狀細胞(DC)抗腫瘤疫苗為代表的主動免疫治療成為腫瘤防治研究的熱點。DC是人體內抗原遞呈能力最強、唯一能在體內活化靜息T淋巴細胞的抗原遞呈細胞，是機體免疫應答的始動者。DC細胞是以主要組織相容性復合物MHC I、II類肽復合物的形式遞呈抗原，具有促進T、B淋巴細胞增殖的能力，在天然免疫和獲得性免疫中發揮著極其重要的作用。因此被廣泛應用于腫瘤疾病疫苗研究。研究表明，腫瘤的發生、發展與患者體內的T淋巴細胞功能缺陷有關，特別是晚期腫瘤患者，其體內往往存在體液免疫和細胞免疫功能的普遍低下，導致免疫功能低下的原因之一是人體內DC細胞功能的下降。實驗證實，從外周血分離出的淋巴細胞仍對多種抗原刺激保持很好的反應能力。因此，通過體外制備DC瘤苗有望成為治療腫瘤的理想療法。如何選擇腫瘤抗原并有效地將其導入DC細胞成為問題的焦點。目前腫瘤抗原包括腫瘤特異性抗原(TSA)和腫瘤相關抗原(TAA)，TSA只存在于某種腫瘤細胞，缺乏廣譜表達，而TAA在腫瘤組織中廣泛表達，能夠誘導針對多種腫瘤CTL殺傷效應，故成為腫瘤DC疫苗研究熱點。研究發現，人體90 %的腫瘤存在端粒酶的活化，被激活的端粒酶在腫瘤的發生發展過程中起著非常重要的作用，而端粒酶催化亞基(hTRT)是端粒酶的蛋白亞單位，與細胞端粒酶的活性密切相關，也是迄今報道表達最廣泛的腫瘤相關抗原之一，因此選擇hTRT 作為癌癥治療DC疫苗的抗原具有重要價值。如何能有效地將腫瘤抗原成功加載并導入DC細胞是獲得良好活性DC的關鍵。目前抗原加載常用兩種方法一是抗原肽直接導入DC細胞，二是病毒載體攜帶抗原基因感染 DC細胞。抗原肽直接沖擊存在以下不足(1)抗原肽半衰期短，易降解；(2)目前使用的抗原肽大多來源于細菌表達的基因工程產品，遞呈的抗原信息缺乏特異性。而采用病毒攜帶抗原基因感染DC制備瘤苗可以克服上述不足(1)抗原基因通過特定的載體轉染DC細胞后，可整合于DC染色體內，從而實現抗原基因長期穩定表達；(2)將抗原基因感染DC細胞后，可以在蛋白翻譯后做進一步的修飾，保證抗原信息的完整及特異。目前攜帶抗原基因感染DC細胞常用的病毒載體有逆轉錄病毒、腺病毒和腺相關病毒(AAV)。這三種病毒載體中，AAV用于感染DC細胞更具有優勢=(I)AAV全長僅為51Λ左右，自身免疫原性低，避免了腺病毒較高免疫原性的缺點；( 可將攜帶基因定向整合于人類的第19號染色體上，保證基因長期穩定表達，不存在逆轉錄病毒載體隨機整合易誘發癌變的危險，具有很高的安全性；(3) AAV感染譜廣，既可感染分裂細胞，又可感染非分裂細胞，且能上調DC細胞表面標志⑶80、⑶83、⑶86等的表達，從而上調DC細胞的功能。研究表明，甘露糖受體(MR)屬于C2型凝集素家族成員，是DC細胞和巨噬細胞所特有的膜受體，能有效捕獲甘露聚糖糖基化的分子。未成熟的DC細胞表面高水平MR，能識別甘露聚糖修飾的病毒表面上的多種糖分子，介導高效的抗原識別與攝取作用，因此AAV 甘露聚糖修飾后對DC細胞具有很強的靶向性，從而大大提高了對DC細胞的感染效率。綜上所述將hTRT基因插入腺相關病毒(AAV)，然后對其進行甘露聚糖表面修飾， 使其能體外靶向感染DC細胞。隨著hTRT基因在DC細胞內的穩定表達，可使DC細胞獲得持續、大量的hTRT抗原肽刺激。經致敏后DC細胞刺激的CTL幾乎對所有腫瘤可產生強大殺傷作用，而對正常組織無損傷，該發明制備的以甘露聚糖修飾攜帶hTRT基因的AAV病毒轉染的DC疫苗，具有誘導作用強、安全性高、價格低廉、易于大規模生產、臨床應用廣等特點。

發明內容
本發明要解決的問題是克服現有方法制備的DC疫苗存在體外抗原肽轉染DC半衰期較短、轉導效率低、靶向性差、活化免疫效應細胞能力弱的缺點。提供一種甘露聚糖修飾的攜帶hTRT基因腺相關病毒誘導的靶向樹突狀細胞DC疫苗及其制備方法。本發明通過甘露聚糖修飾攜帶hTRT基因的重組腺相關病毒體外靶向感染DC細胞，隨著hTRT基因的在DC細胞內的穩定表達，可使DC細胞獲得大量、持續hTRT抗原肽刺激，經致敏后DC細胞活化淋巴細胞，產生的CTL幾乎對所有腫瘤可產生強大殺傷作用果，具有更好的抗腫瘤效果。本發明技術方案如下包括甘露聚糖修飾的攜帶hTRT基因的重組腺相關病毒 AAV/hTRT的制備；采集并分離患者外周血單個核細胞，培養于6孔板，貼壁3h，輕輕洗去懸浮T細胞并凍存備用；取貼壁細胞每孔加入AAV/hTRT病毒液0. 5ml (1.0X108eg)，感染 5h后更換為新鮮含有重組粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)SO萬U/L、白細胞介素 4(IL-4)100RU/LAIM V培養基即獲得未成熟的腫瘤相關抗原DC疫苗；第6天，取原先凍存的T細胞與培養所得的DC細胞按DC T= 1 20比例混合，以AIM V為培養基，同時加 Λ GM-CSF (80 萬 U/L)，IL-4 (100 萬 U/L)、IL-2 (1 萬 U/L)及 TNF- α (20 μ g/L)，共育 7 天， 誘導獲得細胞毒性T淋巴細胞(CTL)。本發明所述的培養基為AIM V培養基且添加10%自身血漿。患者外周血單個核細胞是采用Ficoll密度梯度離心法收集。所述的DC細胞是采用細胞因子GM-CSF、IL-4、 TNF- α誘導分化所得。所述的GM-CSF終濃度為80萬U/L，IL-4終濃度為100萬U/L及 TNF- α終濃度為20 μ g/L。DC細胞經重組腺相關病毒感染致敏后與原先凍存的T細胞按比例混合，共育7天后誘導獲得細胞毒性T淋巴細胞(CTL)。綜上所述甘露聚糖表面修飾的腺相關病毒(AAV)，能體外靶向感染DC細胞。該發明制備的以甘露聚糖修飾攜帶hTRT基因的AAV病毒轉染的DC疫苗，具有誘導作用強、安全性高、價格低廉、易于大規模生產、臨床應用廣等特點。
具體實施例方式下面用實施例來具體說明本發明，但本發明并不受實施例的限制。下面實施例中未注明具體條件的實驗方法，為遵照常規方法和廠家提供的操作說明執行。實施例1 甘露聚糖修飾的重組腺相關病毒AAV/hTRT的制備1、通過RT-PCR技術獲取一段人源性的TRT基因(hTRT，全長3. 5kb)；2、將hTRT基因克隆入腺相關病毒載體AAV(dl6-95)，構建重組質粒AA(dl6_95) (簡寫為AAV/hTRT)，pSH3包裝系統制備AAV/hTRT病毒；3、AAV/hTRT擴增和純化AAV/hTRT病毒反復感染裂解293細胞擴增病毒。超速離心法，收集獲得純化病毒帶。PBS液透析脫鹽后置于-80°C保存備用。病毒滴度測定采用半數組織培養感染量(TCID 50)方法；4、AAV/hTRT的甘露聚糖修飾0. lmol/L PBS液(pH6. 0)溶解甘露聚糖至終濃度為 Hmg/mL，加入0. 01mol/L的高碘酸鈉于4°C氧化60min，形成氧化型甘露聚糖。加入10 μ L 乙二醇于4°C再孵育30min。反應物加入至kphadex-G25層析柱，收集洗脫出的氧化型甘露聚糖。將純化后的腺相關病毒與氧化型甘露聚糖溶液混合，室溫孵育過夜。產物保存于-80"C。實施例2 未成熟DC細胞制備血細胞分離機無菌條件下采集患者抗凝血，1500rpm/min離心10分鐘吸取上層血漿，56°C滅活30分鐘后離心備用，用生理鹽水對倍稀釋血細胞沉淀，比重為1. 077的人淋巴細胞分離液與稀釋血按1 1. 5的比例加入離心管中，2000rpm/min離心12分鐘，小心抽取白細胞層，用生理鹽水清洗兩次，低速離心后得到PBMC。培養池，洗去懸浮T細胞，取貼壁細胞置于含有新鮮含有GM-CSF (80萬U/L)，IL-4 (100萬U/L) AIM V的培養液中，37°C、5% CO2的培養箱中孵育后，可得到未成熟的DC細胞。實施例3 甘露聚糖修飾的AAV/hTRT感染DC細胞并誘導獲得CTL甘露聚糖修飾的AAV/hTRT感染貼壁細胞，5h后更換為AIM V培養基(含GM-CSF、 IL-4)，誘導DC細胞，即獲得腫瘤相關抗原DC疫苗；第6天，取原先凍存的T細胞與培養所得的DC細胞按DC T = 1 20比例混合，以AIMV為培養基，同時加入GM_CSF(80萬U/ L)，IL-2 (1萬U/L)及TNF- α (20 μ g/L)，共育7天，誘導獲得細胞毒性T淋巴細胞(CTL)。實施例4 1. AAV/hTRT基因表達、整合及DC細胞表面標志檢測培養第6天顯微鏡觀察成熟DC細胞形態；探針檢測hTRT基因表達情況；PCR分析 AAV染色體整合情況；流式細胞儀分析DC細胞表面標志⑶80、⑶86、⑶40的表達情況。AAV/ hTRT感染DC前體細胞后，hTRT陽性細胞率為91. 4%，說明hTRT在DC前體細胞內表達良好。流式細胞儀分析結果顯示，病毒感染組DC細胞共刺激因子⑶80 (B7-1)、⑶86 (B7-2)、 ⑶40的表達比例分別為78%、83%、79%，均明顯高于對照組DC細胞的15%、64%、53%。2. DC激活的hTRT抗原特異CTL抗腫瘤活性檢測2. 1激活的CTL細胞表面標志分析培養第13天，流式細胞儀檢測CTL群體中⑶8/⑶4和⑶8/⑶56的比值，感染組的 ⑶8/⑶4和⑶8/⑶56分別為3. 15和5. 45，均明顯高于對照組DC細胞激活的CTL細胞的 1. 30 和 0. 75。
2. 2激活的CTL細胞因子表達分析培養第14天，收集CTL，流式細胞儀檢測細胞內因子IFN-Y和IL_4的表達情況， 與對照組IFN-Y表達(18. 5% )、IL-4表達(13. 6% )相比，病毒感染組的IFN-γ明顯高表達(XL 5% ), IL-4明顯低表達(1. 5% )。2. 3CFSE/P I雙標法檢測CTL殺傷靶細胞的MHC I類限制性將靶細胞株(腎癌細胞、結腸癌細胞、肺癌細胞、肝癌細胞、乳腺癌細胞、腎小管上皮細胞、人肺成纖維細胞)與1/1000 anti-HLA I類抗體共育7天，封閉靶細胞的MHC I類抗原后，CFSE (終濃度為1.25ym0l/L)標記靶細胞，經孵育、離心、洗滌、懸浮后，按效應細胞與靶細胞比為20 1混合，處理后置于上樣管中，分析前加PI至終濃度為1.5mg/L，流式細胞儀檢測CTL對各類靶細胞的殺傷效率。病毒感染組CTL對腫瘤細胞株均有明顯的殺傷，而對人正常的腎小管上皮細胞以及人肺成纖維細胞細胞沒有殺傷，當靶細胞封閉MHC I 類抗原后，其殺傷明顯下降，這說明CTL對腫瘤細胞的殺傷具有明顯的MHC限制性，對照組 CTL對各類靶細胞均無明顯殺傷。
權利要求
1.一種甘露聚糖修飾的攜帶hTRT基因腺相關病毒誘導的靶向樹突狀細胞DC疫苗，其特征在于甘露聚糖修飾的攜帶腫瘤相關抗原hTRT基因重組腺相關病毒rAAV能夠靶向感染DC細胞，并能獲得廣譜的抗腫瘤DC疫苗。
2.—種權利要求1所述的靶向樹突狀細胞DC疫苗的制備方法，其具體步驟如下(1)獲取全長約3.5kb的人源性hTRT基因，構建重組質粒，利用pSH3包裝系統制備 AAV/hTRT 病毒；(2)病毒AAV/hTRT的甘露聚糖修飾將純化后的AAV/hTRT與氧化型甘露聚糖溶液混合，室溫孵育過夜；產物保存于-80°C ；(3)Ficoll密度梯度法分離患者外周血單個核細胞(PBMC)；培養池后保留貼壁細胞， 洗去懸浮T細胞并凍存備用；(4)AAV/hTRT感染貼壁細胞，感染證后更換為含有GM-CSF (80萬U/L)、IL-4 (100萬U/ L)的AIM V培養基誘導DC細胞分化，即獲得未成熟的腫瘤相關抗原DC疫苗；(5)第6天，取凍存的T細胞與培養所得的DC細胞按比例混合，加入GM-CSF(80萬U/ L)，IL-2 (1萬U/L)及TNF- α (20 μ g/L)，共育7天，誘導獲得細胞毒性T淋巴細胞(CTL)。
3.如權利要求1所述的腫瘤相關抗原疫苗，其特征在于DC疫苗由甘露聚糖修飾的攜帶hTRT基因的重組腺相關病毒(rAAV)靶向致敏。
4.如權利要求2所述的靶向樹突狀細胞DC疫苗的制備方法，其特征在于AAV可定向整合宿主細胞且沒有誘發癌變的危險，能使攜帶的基因長期穩定表達，具有高安全性。
5.如權利要求2所述的靶向樹突狀細胞DC疫苗的制備方法，其特征在于rAAV攜帶的 hTRT基因翻譯的hTRT蛋白，是一種廣譜腫瘤相關抗原，是端粒酶的蛋白亞單位，其表達與端粒酶激活密切相關，在不同類型的腫瘤組織中廣泛表達。因此以其制備的瘤苗幾乎對所有的腫瘤細胞均產生強大殺傷作用。
6.如權利要求2所述的靶向樹突狀細胞DC疫苗的制備方法，其特征在于使用甘露聚糖修飾rAAV，使其能靶向感染DC細胞；甘露聚糖即甲氨酸甲基化甘露聚糖 (chol-AECM-marman)，是一種被膽固醇部分修飾的多聚糖化合物，易與病毒形成多聚甘露糖復合體，未成熟的DC細胞和巨噬細胞表面高表達甘露聚糖受體，因此可以增加病毒靶向性，提高感染DC細胞效率。
7.權利要求1所述的DC疫苗能刺激產生有效殺傷腫瘤細胞的細胞毒性T淋巴細胞 CTL，所產生的CTL具有抗腫瘤廣譜性，幾乎對所有腫瘤細胞具有殺傷作用。
全文摘要
本發明屬于醫學生物工程技術領域，它涉及一種新型樹突狀細胞(DC)疫苗制備技術。該技術將人端粒酶催化亞基(hTRT)基因插入腺相關病毒(AAV)，然后對其進行甘露聚糖表面修飾，使其能體外靶向感染DC細胞。隨著hTRT基因在DC細胞內的穩定表達，可使DC細胞獲得持續、大量的hTRT抗原肽刺激。由于hTRT抗原為腫瘤相關抗原，因此該DC疫苗刺激的淋巴細胞幾乎對所有腫瘤細胞均產生強大殺傷作用。該發明制備的疫苗具有誘導作用強、安全性高、價格低廉、易于大規模生產、臨床應用廣等特點。解決了現有體外抗原肽轉染DC細胞存在的半衰期短、轉導效率低、活化免疫效應細胞能力弱的問題。
文檔編號A61K39/00GK102552892SQ201110459368
公開日2012年7月11日 申請日期2011年12月27日 優先權日2011年12月27日
發明者劉俊杰, 張寶福, 張青, 李慧忠, 李連濤, 楊潔, 章龍珍, 裴冬生, 鄭駿年 申請人:鄭駿年