專利名稱：基于重組蛋白的抗鏈球菌感染疫苗的制作方法
技術領域：
本發明涉及亞單位免疫原性或疫苗組合物及其在用于免疫易受鏈球菌感染的哺乳動物中的用途。本發明還涉及制備、配制和施用該組合物的方法。
背景技術：
馬中的鏈球菌感染主要由各種馬鏈球菌(Streptococcus equi)引起，馬鏈球菌包括三個亞種，分別命名為馬(equi)亞種、獸疫(zooepidemicus)亞種和反會動物(ruminatorium)亞種，下文僅簡稱為馬鏈球菌馬亞種(S. equi)、馬鏈球菌獸疫亞種(S. zooepidemicus)和馬鏈球菌反會動物亞種(S. ruminatorium)(參考文獻15、24、40)。實際上局限于馬的馬鏈球菌馬亞種為腺疫(strangle)的病原體，腺疫為世界上廣泛分布且高度感染性的馬科上呼吸道的嚴重疾病。腺疫為世界范圍內最經常報告的馬科疾病之一，其特征在于發熱、流涕以及在咽后和下頜淋巴結形成膿腫。在一些病例中所述疾病表現為體內新陳代謝病程，即通常所說的“假腺疫(bastard strangle)”。所述疾病具有世界范圍內的分布并引起巨大的經濟損失(參考文獻39)。馬鏈球菌獸疫亞種被認為是在健康馬上呼吸道中經常發生的機會性共生體。然而，在應激或病毒感染后，其可引起產生腺疫樣癥狀的繼發感染。另外，馬鏈球菌獸疫亞種不僅感染馬，而且還感染許多其他動物，諸如豬、山羊、狗、貓和牛。甚至已報道了由獸疫亞種引起的人類感染病例(參考文獻5)。該亞種已被懷疑為病癥例如子宮內膜炎、宮頸炎、流產、乳腺炎、肺炎、膿腫和關節感染中的原發性病原體。已從患有乳腺炎的綿羊和山羊的乳分離了馬鏈球菌反芻動物亞種(參考文獻10)。釀膿鏈球菌(Stre ptococcus pyogenes)為引起各種疾病例如膿皰病、咽炎、壞死性筋膜炎和中毒性休克綜合癥的重要人類病原體。雖然可以用抗生素例如青霉素、四環素或慶大霉素(gentamicin)來治療和治愈這些鏈球菌感染，但將期望能夠預防該感染的爆發以及消除或降低與抗生素治療相關的抗性株發展風險的有效預防劑。相關技術說明然而，雖然已進行了許多努力以開發預防劑例如抗馬鏈球菌的疫苗，但對于馬亞種、獸疫亞種和反芻動物亞種或釀膿鏈球菌(S. pyogenes)，目前市場上仍沒有可獲得的有效和安全的疫苗。現存抗腺疫疫苗基于馬鏈球菌馬亞種的失活，例如馬鏈球菌馬亞種的熱殺死株或減毒株或者為富含由馬鏈球菌馬亞種產生的M-蛋白(即免疫原性蛋白質)的酸提取物/變溶菌素。基于M樣蛋白的抗馬鏈球菌獸疫亞種的疫苗公開于US-A-5，583，014。在WO87/00436、參考文獻17和WO 2009/093014A2中公開了將馬鏈球菌馬亞種的減毒株用作抵抗由馬鏈球菌馬亞種引起的感染的疫苗。商業抗腺疫疫苗，Equilis StrepE(來自Intervet, UK)發售于2004年。然而，該疫苗基于馬鏈球菌馬亞種的減毒(活、缺失突變的)菌株，該疫苗的安全性和效力受到懷疑(參考文獻23、35)。由于以前開發的基于活或失活細菌的疫苗或免疫制品受到副作用的影響，并且可能提供的保護不夠，因此存在對于保護以抵抗馬鏈球菌馬亞種感染和/或預防其傳播而不引起不期望的副作用的、有效和安全的預防劑，例如疫苗的需求。近年來，已鑒定和表征了與宿主細胞的細胞外基質(ECM)或血漿蛋白的不同成分相互作用和/或結合的鏈球菌表面蛋白。已表征的馬鏈球菌馬亞種和馬鏈球菌獸疫亞種的胞外表面蛋白的實例為FNZ(參考文獻29)、EAG(參考文獻27)、膠原樣蛋白(SclC、SclD,SclE、SclF、SclG、SclH和Sell)(參考文獻21、22)、CNE(還稱為 See)(參考文獻25)、ZAG(參考文獻18和W095/07296)。此外，被認為釋放到周圍培養基的馬鏈球菌馬亞種胞外蛋白的實例為SFS (參考文獻28)、IdeE和IdeZ (參考文獻26)、IdeE2和IdeZ2 (參考文獻16)。這些類型的蛋白為用作免疫目的的活性成分的潛在候選者。該類型蛋白作為保護馬抵抗腺疫的潛在疫苗的成分的用途被公開于WO2004/032957AUW0 00/37496、W02007/115059A2、WO 98/01561 和 WO 2009/075646A1。Flock, M.等人(2004)(參考文獻11)報道了在馬腺疫的小鼠模型中，使用分別命名為FNZ、SFS和EAG的蛋白的部分來免疫小鼠。FNZ和EAG被認為是用于開發安全并有效的抗腺疫疫苗的期望候選者。Timoney等人(2007)(參考文獻42)報道了重組DNA產生的馬亞種的胞外蛋白作為疫苗成分是無效的。推測在早期報道的結果中，對于通過重組DNA技術產生的、在小鼠實驗中顯示保護的一些馬鏈球菌馬亞種蛋白不適用于馬。因此，重組體形式的胞外定位的馬鏈球菌馬亞種蛋白作為疫苗成分必然有功能并不是顯而易見的。參考文獻45中，報道了使用來自馬鏈球菌馬亞種的重組抗原EAG、CNE和SclC接種馬以抵抗腺疫。在該研究中，接種的馬在用馬鏈球菌馬亞種激發(challenge)后顯示細菌收率顯著減少和流涕水平顯著降低。雖然為開發有效的疫苗已進行了許多努力，并且在參考文獻14和15、WO2004/032957A1、WO 2009/075646A1中提供的一些免疫成分是用于保護以抵抗馬鏈球菌馬亞種感染的疫苗的期望候選者，但仍期望開發安全的、具有高度免疫原性和顯示有限副作用或沒有副作用的疫苗。人類病原體釀膿鏈球菌還表達與ECM和/或宿主血液成分相互作用的許多胞外蛋白(參考文獻6、7、9、33)。其中之一為稱作EndoS的內切糖苷酶，其能夠水解人免疫球蛋白G(IgG)上天冬酰胺-連接的聚糖的殼二糖核心(參考文獻8)。EndoS在一系列文章中被進一步表征，描述了例如酶性質、特異性等(參考文獻1、2、3、4、34)。EndoS在治療或預防由IgG抗體介導的疾病例如自身免疫病中的用途公開于W0/2008/071418A2，和EndoS在分離和分析IgG中的活體外的用途公開于WO 2009/033670A2。馬鏈球菌馬亞種的EndoSe和馬鏈球菌獸疫亞種的EndoSz或其片段作為抗細菌感染或引起免疫原應答(immunogenicresponse)或保護性免疫應答的疫苗的用途公開于WO 2011/059385A1 (將其全部公開內容引入本文以作參考)。 發明內容
本發明基于抗原性的、適合的免疫原性的、包含含有源自在馬鏈球菌馬亞種和馬鏈球菌獸疫亞種之一或兩者中存在的蛋白的至少一種抗原表位或抗原決定簇的多種抗原、適合的免疫原的組合物及其在免疫非人類哺乳動物抵抗馬鏈球菌馬亞種和/或馬鏈球菌獸疫亞種中的用途。根據本發明，組合物的至少一種成分為包含兩個或多個抗原或其片段的融合蛋白或多肽。本發明還涉及亞單位免疫原或疫苗組合物,其包含上述抗原組合物作為免疫成分；涉及制備所述抗原性的、適合的免疫原性組合物或疫苗組合物的方法；涉及在非人類哺乳動物中誘導抗馬鏈球菌馬亞種和/或馬鏈球菌獸疫亞種的免疫應答的方法；以及涉及在非人類哺乳動物中預防性或治療性處理馬鏈球菌馬亞種和/或馬鏈球菌獸疫亞種感染的方法。本發明還涉及特異性抗原融合多肽本身。根據適合的實施方案，本發明涉及保護馬科例如馬抵抗由馬鏈球菌馬亞種引起的疾病，例如腺疫、上呼吸道感染、創傷感染和子宮內膜炎的疫苗。詞語“保護”是包括完全保護和降低感染嚴重性之間的任何情況的泛稱。可用各種方式測量保護程度，關于例如馬鏈球菌馬亞種在馬中的感染，疫苗的效果可以是降低臨診癥狀和降低臨床疾病，其中可觀察到溫度升高幅度的降低、淋巴結(Iympnodes)腫脹的降低和細菌從被感染動物的傳播降低等。如何測量免疫組合物在激發后的效力的方法和步驟可從例如參考文獻14和WO2009/075646A1 中獲得。出于各種原因，在馬中進行接種和激發實驗之前，在小型動物模型中研究疫苗中待使用的新抗原的評價。關于由馬亞種引起的上呼吸道感染，已描述了優選和良好建立的接種和實驗感染模型(參考文獻11、12、13、14、16、43、WO 2004/032957A1、WO2009/075646A1)。該模型以高度的可靠性被用于篩選和評價在馬中具有引發保護性免疫原應答潛能的馬鏈球菌馬亞種抗原(參考文獻13、14)。在由馬鏈球菌馬亞種引起的感染的情形中，“非人類哺乳動物”的表述主要指屬于馬科的由馬、驢和斑馬及其雜 種如馬驟和驢驟組成的動物。駱騎和單峰騎(dromedarie)也包含于其中。關于由馬鏈球菌獸疫亞種引起的感染，“非人類哺乳動物”的表述另外還指其它哺乳動物例如牛、豬、狗和貓。本發明的上述各方面及其優選實施方案定義于所附權利要求書中。在特定實施方案中，本發明使用選自氨基酸序列SEQ IDN0S:22、24、26、28、30、32、
34、38、42的一種或多種多肽和選自核苷酸序列SEQ ID NO S: 21、23、25、27、29、31、33、37、41的一種或多種核苷酸序列。除非另有陳述，否則本發明的實施將采用本領域技術范圍內的微生物學、重組DNA技術和分子生物學及免疫學的常規技術。該技術說明于文獻例如Samtoook等人(2001)MolecularCloning:A laboratory manual,第三版，Cold Spring HarbourPress0 除非另有定義，否則本文所使用的所有科技術語與由本發明所屬領域的普通技術人員所通常理解的含義相同。分子例如蛋白質或核酸的“片段”意思是指氨基酸或核苷酸序列的部分。術語“類似物”指與參考序列具有80%以上、尤其是90%以上序列同源性(“同一性”)的核酸或氨基酸序列的變體。通常，“同一性”指兩個多核苷酸或多肽序列各自準確的核苷酸與核苷酸或氨基酸與氨基酸的對應性。確定核酸序列同一性的技術在本領域中是熟知的，并且用于計算序列之間同一性的軟件程序是可獲得的。許多馬鏈球菌馬亞種蛋白在各種報道中具有不同的命名。為了便于閱讀，將本申請及以前報道/專利申請文獻和選擇性命名示于下表I中。表I
權利要求
1.一種抗原組合物，其包含源自馬鏈球菌馬亞種或獸疫亞種抗原的多個抗原成分，所述抗原成分包含 (i)第一融合多肽，其包含命名為EAG的蛋白的至少一部分和命名為CNE的蛋白的至少一部分； 和(ii)至少一種另外的多肽，其選自 (a)第二融合多肽，其包含命名為Eq5的蛋白的至少一部分和命名為Eq8的蛋白的至少一部分， (b)第三融合多肽，其包含命名為IdeE的蛋白的至少一部分和命名為Eq5的蛋白的至少一部分， (C)命名為EndoSe的蛋白或命名為EndoSz的蛋白的至少一部分， (d)命名為IdeE的蛋白的至少一部分， (e)命名為IdeE2的蛋白的至少一部分， (f)命名為Eq27的蛋白的至少一部分， (g)命名為Eq54的蛋白的至少一部分， (h)命名為Scl的蛋白家族的蛋白的至少一部分，其中各所述蛋白的所述至少一部分包含至少一種抗原表位。
2.根據權利要求1所述的抗原組合物，其中所述第一融合多肽進一步包含命名為Scl的蛋白家族的至少一種蛋白的至少一部分。
3.根據權利要求1或2所述的抗原組合物，其中所述第一融合多肽進一步包含命名為Eq54的蛋白的至少一部分。
4.根據權利要求1至3任一項所述的抗原組合物，其中所述命名為EAG的蛋白的至少一部分包含所述蛋白的N端部分。
5.根據權利要求1至4任一項所述的抗原組合物，其中所述命名為CNE的蛋白的至少一部分包含所述蛋白的N端部分。
6.根據權利要求1至5任一項所述的抗原組合物，其中所述至少一種另外的多肽包含權利要求1中所述的第二融合多肽，和所述命名為IdeE的蛋白的至少一部分。
7.根據權利要求6所述的抗原組合物，其進一步包含所述命名為IdeE2的蛋白的至少一部分。
8.根據權利要求1至5任一項所述的抗原組合物，其中所述至少一種另外的多肽包含權利要求1中所述的第三融合多肽。
9.根據權利要求8所述的抗原組合物,其進一步包含所述命名為EndoSe或EndoSz的蛋白的至少一部分。
10.根據權利要求1至9任一項所述的抗原組合物，其中所述第一融合多肽包含SEQIDNO 24中所示的，從第12個氨基酸開始的氨基酸序列。
11.根據權利要求1至9任一項所述的抗原組合物，其中所述第一融合多肽包含SEQIDNO 28中所示的，從第12個氨基酸開始的氨基酸序列。
12.根據權利要求1至9任一項所述的抗原組合物，其中所述第一融合多肽包含SEQIDNO 34中所示的，從第12個氨基酸開始的氨基酸序列。
13.根據權利要求1至12任一項所述的抗原組合物，其中所述第二融合多肽包含SEQID NO 22中所示的，從第12個氨基酸開始的氨基酸序列。
14.根據權利要求1至13任一項所述的抗原組合物，其中所述第三融合多肽包含SEQID NO 30中所示的，從第12個氨基酸開始的氨基酸序列。
15.根據權利要求6所述的抗原組合物，其包含(i)含有如SEQID NO:22所示(從第12個氨基酸開始)的氨基酸序列的融合多肽，(ii)含有如SEQ ID N0:24所示(從第12個氨基酸開始)的氨基酸序列的融合多肽，和(iii)含有如SEQ ID N0:26所示(從第12個氨基酸開始)的氨基酸序列的多肽。
16.根據權利要求8所述的抗原組合物，其包含(i)含有如SEQID NO:28所示(從第12個氨基酸開始)的氨基酸序列的融合多肽，(ii)含有如SEQ ID N0:30所示(從第12個氨基酸開始)的氨基酸序列的融合多肽，和(iii)含有如SEQ ID N0:32所示(從第12個氨基酸開始)的氨基酸序列的多肽。
17.根據權利要求8所述的抗原組合物，其包含(i)含有如SEQID NO: 34所示(從第12個氨基酸開始)的氨基酸序列的融合多肽，(ii)含有如SEQ ID N0:30所示(從第12個氨基酸開始)的氨基酸序列的融合多肽，和(iii)含有如SEQ ID N0:32所示(從第12個氨基酸開始)的氨基酸序列的多肽。
18.根據權利要求8所述的抗原組合物，其包含(i)含有如SEQID NO: 34所示(從第12個氨基酸開始)的氨基酸序列的融合多肽，和(ii)含有如SEQ ID N0:30所示(從第12個氨基酸開始)的氨基酸序列的融合多肽。
19.一種抗原融合多肽，其包含SEQ ID N0:22中所示的，從第12個氨基酸開始的氨基酸序列。
20.一種抗原融合多肽，其包含SEQ ID NO:24中所示的，從第12個氨基酸開始的氨基酸序列。
21.一種抗原融合多肽，其包含SEQ ID NO:28中所示的，從第12個氨基酸開始的氨基酸序列。
22.—種抗原融合多肽，其包含SEQ ID N0:30中所示的，從第12個氨基酸開始的氨基酸序列。
23.一種抗原融合多肽，其包含SEQ ID NO:34中所示的，從第12個氨基酸開始的氨基酸序列。
24.一種抗原組合物，其包含權利要求19至23所述的至少一種融合多肽，或其類似物。
25.一種用于保護非人類哺乳動物抵抗馬鏈球菌感染的疫苗組合物，其包含作為免疫成分的權利要求1至18和24任一項所述的抗原組合物，和藥物學可接受載體。
26.根據權利要求25所述的疫苗組合物，其進一步包含佐劑。
27.一種用于保護非人類哺乳動物抵抗馬鏈球菌感染的疫苗組合物，其包含至少一種重組載體和多核苷酸，所述多核苷酸插入所述至少一種重組載體中并編碼權利要求1至18和24任一項所述的組合物的抗原成分，所述一種載體或多種載體能夠在易受馬鏈球菌感染的哺乳動物中活體內表達所述成分。
28.根據權利要求27所述的疫苗組合物，其中所述載體為質粒或病毒載體形式的表達載體。
29.根據權利要求25至28任一項所述的疫苗組合物，其以生理學可施用形式，優選可通過肌內、皮內、皮下或鼻內接種的施用形式來提供。
30.根據權利要求25至28任一項所述的疫苗組合物，其中所述疫苗能夠保護易感哺乳動物抵抗馬鏈球菌感染，尤其是保護馬抵抗由馬鏈球菌馬亞種引起的腺疫。
31.根據權利要求30所述的疫苗組合物，其能夠在對馬鏈球菌易感的哺乳動物，尤其是馬中刺激定向抵抗馬鏈球菌抗原的血清、粘膜和/或支氣管的抗體應答。
32.—種生產根據權利要求1至18和24任一項所述的抗原組合物的抗原的方法，所述方法包括 (a)提供編碼所述抗原的DNA片段并將所述片段導入至少一種表達載體； (b)將包含所述DNA片段的所述至少一種載體導入至少一種相容性宿主細胞； (c)在表達由所述DNA片段編碼的產物所需的條件下培養在步驟(b)中提供的所述至少一種宿主細胞；和 (d)從各培養的宿主細胞中分離表達產物，和任選地， (e)純化來自步驟(d)的分離產物，優選通過色譜法來純化。
33.一種根據權利要求25至28任一項所述的疫苗組合物的制備方法，所述疫苗組合物包含權利要求1至18和24任一項所述的抗原組合物作為免疫成分，其中所述方法包括將抗原組合物與藥物學可接受載體混合。
34.根據權利要求1至18和24任一項所述的抗原組合物在制備保護抵抗馬鏈球菌感染，尤其是在馬中抵抗由馬鏈球菌馬亞種感染引起的腺疫的疫苗中的用途。
35.根據權利要求1至18和24任一項所述的抗原組合物，其用于預防性或治療性處理由馬鏈球菌引起的感染。
36.一種生產抗血清的方法，所述方法包括將根據權利要求1至18和24任一項所述的抗原組合物施用到非人類哺乳動物宿主從而在所述宿主中產生抗體和回收包含所述宿主中所產生的所述抗體的抗血清。
37.一種在哺乳動物，尤其是馬中預防性或治療性處理馬鏈球菌感染的方法，其包括向所述哺乳動物施用免疫有效量的權利要求25至28任一項所述的疫苗組合物，或根據權利要求36所述生產的抗血清。
38.一種保護馬抵抗馬鏈球菌感染的方法，其包括用權利要求25至28任一項所述的疫苗組合物來皮下、皮內、肌內或鼻內接種馬，從而在所述馬中誘導抵抗馬鏈球菌的免疫應答。
39.根據權利要求38所述的方法，其中在所述馬中誘導在血清和/或鼻咽粘液中的IgG和/或IgA和/或IgM抗體形式的免疫應答。
40.一種抗體制品，其包含對根據權利要求1至18和24任一項所述的抗原組合物的抗原特異的至少一種，和優選至少兩種單克隆或多克隆抗體，或抗體片段。
41.根據權利要求40所述的抗體制品，當施用到易被馬鏈球菌感染的哺乳動物時，其用于預防性或治療性提供被動免疫。
42.一種被動免疫的方法，其包括向哺乳動物施用權利要求40或41所述的抗體制品。
全文摘要
抗原組合物包含源自馬鏈球菌馬亞種或獸疫亞種抗原的多種抗原成分，其中至少一種成分為包含兩個或更多個該抗原或其片段的融合蛋白或多肽。抗原組合物可用于免疫哺乳動物來抵抗馬鏈球菌馬亞種和/或獸疫亞種。還公開了包含抗原組合物作為免疫成分的疫苗組合物。
文檔編號C07K16/12GK103068838SQ201180026088
公開日2013年4月24日 申請日期2011年5月25日 優先權日2010年5月26日
發明者B·古斯, J-I·弗洛克, L·弗里克伯格, M·弗洛克 申請人:英特瓦克公司