一種抗牙周病抗體的制備方法及其應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于醫學技術領域，具體是一種牙周病抗體的制備方法。
【背景技術】
[0002]對于口腔疾病，人們想到最多的就是齲齒。然而最新的一項調查顯示，目前在發展中國家，牙周病的發病率已經超過齲齒的發病率，高達75%以上。而牙周病主要的致病菌，被公認為是牙銀卟啉單胞菌。目前對牙銀卟啉單胞菌進行被動免疫的措施是，將單一的或混合的牙齦卟啉單胞菌菌體蛋白作抗原，免疫馬牛羊兔等哺乳類動物，從動物血清中提取抗體，進行被動免疫防治。

【發明內容】

[0003]本發明的目的是提供一種抗牙周病菌抗體IgG的制備方法，使抗體的生產成本降低，抗體效價提高。本發明的另一目的，是抗牙齦卟啉單胞菌抗體IgG的應用。提供以本發明制備的抗牙齦卟啉單胞菌抗體IgG和抗菌劑作為被動免疫有效成份用于預防牙周病的發生。
[0004]采用的技術方案是:
1、一種抗牙周病菌抗體的制備方法，其特征在于包括下述步驟:
(1)取牙齦卟啉單胞菌，在BHI培養基中厭氧培養5-7天;將培養好的牙齦卟啉單胞菌進行離心處理，收集菌體，用PH6-7、濃度為0.05-0.2M的磷酸緩沖生理鹽水洗滌菌體4-6次，50-65°C的溫度下，加熱25-35分鐘，進行滅活處理，得到牙齦卟啉單胞菌液；
將牙齦卟啉單胞菌液和等量的福氏佐劑混合，用高速勻漿器處理，制得菌體佐劑抗原；
(2)、根據脯乳類動物種類，每次取牙齦卟啉單胞菌抗原1-5ml，對動物進行淋巴結和背部皮下多點注射，共注射三次，每次間隔三周；末次免疫后20天，經檢測效價合格后采集血清，取免疫血清攪拌下加入適量鹽水稀釋，調節pH值至7.5-8.5，加入等量飽和硫酸銨溶液，在2-8°C溫度下靜置20-30小時，高速離心20-30分鐘，取其沉淀，經復融超濾濃縮除鹽、除菌后冷凍干燥，即得抗牙齦卟啉單胞菌抗體IgG粗提物；
(3)、將抗牙銀卟啉單胞菌抗體IgG粗提物離心純化后，再經DEAE-SephadexA50層析柱純化;用含NaCl的磷酸緩沖液進行連續或分段梯度洗脫，收集各蛋白洗脫峰，并以ELISA檢測各蛋白的抗體活性;收集有抗體活性的蛋白洗脫液，調節蛋白含量為20mg/ml;
將前一步驟所得的蛋白洗脫液再經Sephadex G200凝膠柱層析純化，用含NaCl的磷酸緩沖液進行洗脫，收集各蛋白洗脫峰，并以ELISA檢測各蛋白的抗體活性;收集有抗體活性的蛋白洗脫液，經0.22μ膜過濾除菌，冷凍干燥，即得抗牙齦卟啉單胞菌抗體IgG純品。
[0005]上述離心純化的速度為5000-12500rpm，離心次數2-5次，DEAE陰離子交換層析法中，洗脫液磷酸緩沖液的濃度為0.003-0.02M，所含NaCl的濃度為0.03-0.1M，凝膠過濾柱層析洗脫液磷酸緩沖液濃度為0.01-0.2M，所含NaCl的濃度為0.1-0.5M;親和層析洗脫液濃度為0.1-0.5M。
[0006]上述牙齦卟啉單細胞，用BHI培養基，在37°C溫度厭氧條件下，靜置培養牙齦卟啉單胞菌5-7天，將培養后的牙齦卟啉單胞菌用4000rpm離心10分鐘，收集菌體;用pH值為6.0、濃度為0.2M的磷酸緩沖生理鹽水洗菌體5次，50°C、25分鐘加熱滅活處理，制得牙齦卟啉單胞菌液。取菌液(20億/ml)，與等量的福氏佐劑混合，用高速勻漿器處理，制得牙齦卟啉單胞囷佐劑抗原。
[0007]根據哺乳動物種類，每次取菌體佐劑抗原1-5ml，對動物進行淋巴結和皮下多點注射，共注射三次，每次間隔三周；
第三次免疫動物后20天，檢測效價合格后，收集抗血清用鹽水稀釋，調節pH值至8.0，攪拌下加入等量飽和硫酸銨溶液置2_8°C靜置24小時，8000rpm離心20分鐘，取沉淀，經超濾除鹽、濃縮、除菌后冷凍干燥，制得抗牙周病菌抗體IgG粗提物；
將抗牙周病菌抗體IgG粗提物經DEAE-Sephadex A50層析柱層析;柱床2.5 X 35cm，加入10mg/ml的樣3.0ml，用含0.07M NaCl的0.01M、pH7.0磷酸緩沖液進行洗脫，流速20ml/h，洗脫液按每管5.0ml;收集各蛋白洗脫峰，并以ELISA檢測各蛋白的抗體活性;收集有抗體活性的蛋白洗脫液，調節蛋白含量為20mg/ml ；繼而將該液進一步經Sephadex G200凝膠柱層析；柱床2.0 X 65cm，加樣1.5ml，用含0.1M NaCl的0.01M、pH7.0磷酸緩沖液進行洗脫，流速
8.0ml/h，洗脫液按每管5.0ml，收集各蛋白洗脫峰，并以ELISA檢測各蛋白的抗體活性;收集有抗體活性的蛋白洗脫液，經0.22μ膜過濾除菌，冷凍干燥，即得抗牙齦卟啉單胞菌抗體IgG純品。
[0008]用本發明方法制得的抗牙周病抗體的應用:
本發明制備的抗牙齦卟啉單胞菌抗體IgG用于抗牙周病菌產品的添加劑，使用量為5-20g/Kg。其產品為以抗牙周病菌抗體IgG為有效成份的防牙周病的組合物。
[0009]牙齦卟啉單胞菌是引起牙周病的主要菌種，且對其它菌種有一定的交叉免疫反應。選擇牙齦卟啉單胞菌作為主要抗原菌體，避免了混合菌作抗原時，主要菌效降低的問題，也避免了單一菌種作抗原時，范圍偏窄的問題。保證了抗體具有較大范圍的交叉反應。
[0010]經檢測表明本發明抗體IgG達到了 PAGE純度，經分子量測定，抗體IgG分子量為160,000道爾頓。
[0011]抗體IgG理化實驗結果表明，本發明抗體IgG在65°C條件下，90分鐘內仍保持有活性;在pH4-l 1的環境中，37°C、8小時其抗體活性無明顯變化，但在pH2和pH12時抗體活性迅速下降，并且很快失活;本發明抗體IgG具有較大的抗滲透壓性質，可耐受40%的蔗糖滲透壓。
[0012]抗體IgG間接血凝抑制實驗表明，本發明抗體IgG能有效地抑制牙銀卟啉單胞菌凝聚，其效價高達1:512;抗體IgG抑制牙齦卟啉單胞菌粘附實驗觀察表明，本發明的抗體IgG稀釋到1:8，仍具有明顯的抑制牙齦卟啉單胞菌在牙體表面的粘附作用；動物實驗表明，用本發明抗體IgG喂養感染牙齦卟啉單胞菌的大白鼠，能有效地防止牙周病的發生，檢測表明菌斑中牙齦卟啉單胞菌數下降了 70-80%。
[0013]本發明的防牙周病組合物為液體狀態時，可將其裝入小型攜帶式噴霧罐中噴霧使用。
[0014]本發明抗體IgG還可與牙齒著色除去劑、預防口臭劑等蛀牙預防劑配合，制成各種防治產品。也可以加入到各種口腔清新劑中，增加口腔清新劑的防牙周病功能。
[0015]進一步的具體應用包括:
1、用本發明方法制備的抗牙齦卟啉單胞菌抗體IgG，加入山梨酸鉀、苯甲酸鈉兩種抗菌劑中至少一種作為有效成份的防牙周病組合物，包括牙膏、口含液、漱口水和噴霧劑型的口腔用產品，或是口香糖、巧克力、雪糕、冰激凌食物，本發明抗體IgG的加入量為0.05-0.2%，山梨酸鉀、苯甲酸鈉的加入量為0.01-0.02%。
[0016]2、采用本發明方法制備的抗牙齦卟啉單胞菌抗體IgG，制備口含液的方法，是取本發明抗體IgG2.0g，山梨酸鉀0.15g，苯甲酸鈉0.15g，阿斯巴甜0.8g，薄荷腦0.15g，蘋果香精
0.4ml；將薄荷腦加入100ml的蒸餾水中，60°C溶化;其它固體成份各溶解于450ml的蒸餾水中，然后將各種溶解的液體均勻混合，用蒸餾水定容到1000ml，即得。
[0017]3、用本發明方法制備的抗牙齦卟啉單胞菌抗體I gG，制備口香糖的方法，是取本發明抗體IgG2.0g，山梨酸鉀0.15g，阿斯巴甜0.8g，薄荷腦0.15g，微囊化蘋果香精0.4g，膠基10.0g，羥甲基纖維素5.0g，按總量1千克，即得。
[0018]4、用本發明方法制備的抗牙齦卟啉單胞菌抗體IgG，制牙膏的方法，是取本發明抗體IgG0.lg，山梨酸鉀0.015g，苯甲酸鈉0.015g，甘油10.0g，山梨糖醇8.0g，羥甲基纖維素
2.(^，龍須菜1.38，月桂基硫酸鈉1.88薄荷腦0.0158，阿斯巴甜0.0158，草莓香精0.051111，磷酸鈣二水物47.8g，將羥甲基纖維素、龍須菜加入約60ml的蒸餾水中，泡脹溶解，再先后加入其它成份，充分攪拌，使混合均勻，最后加入蒸餾水定容至100ml，攪拌均勻成膏狀，即得。
[0019]5、用本發明方法制備的抗牙齦卟啉單胞菌抗體I gG，制備護齒膏的方法，是取本發明抗體IgG0.lg，苯甲酸鈉0.0lg，蜂蠟8.0g，硬脂酸10.0g甘油單硬脂酸酯2.0g，甘油10.0g，羥甲基纖維素l.0g，薄荷腦0.0lg，阿斯巴甜0.05g，蒸餾水68.80!111，草莓香精0.028，將蜂蠟、硬脂酸、甘油單硬脂酸酯、甘油混合，加熱至70°C，混合溶解之液體稱之為A液;將羥甲基纖維素溶解于50ml的蒸餾水中，泡脹溶解，再先后加入抗體IgG、薄荷腦、阿斯巴甜、山梨酸鉀、草莓香精，充分攪拌，混合均勾，繼而加入冷卻后的A液，最后加入蒸饋水定容至100ml，攪拌均勻成膏狀，即得。
[0020]本發明抗體IgG制備技術生產成本低，抗體效價高，抗滲透壓強，對牙銀卟啉單胞菌具有較強的免疫活性，且對牙齦卟啉單胞菌以外的致病菌具有很大范圍的交叉反應。本發明的防牙周病組合物，具有抗體IgG用量小，使用安全，能有效地防止牙周病的發生。
【具體實施方式】
[0021 ] 實施例一
用BHI培養基，37°C厭氧條件下，靜置培養牙齦卟啉單胞菌5-7天，將培養后的牙齦卟啉單胞菌用4000rpm離心10分鐘，收集菌體用pH 6.濃度為0.2M的磷酸鹽緩沖液洗滌菌體5次，經25分鐘加熱(50°C)滅活處理，得到牙齦卟啉單胞菌液。取菌液(20億/ml)加入等量的福氏佐劑，用高速勻漿器處理，制得油包水狀菌體佐劑抗原。
[0022]根據脯乳類動物的不同種類，每次取菌體佐劑抗原1-5ml，對動物進行淋巴結和皮下多點免疫，共免疫三次，每次間隔三周。
[0023]第三次免疫動物后20天采血測定抗體效價，達到標準后開始收集抗血清，用鹽水稀釋，調節pH值至8.0，攪拌下加入等量飽和硫酸銨溶液，置2-8°C靜置24小時，8000rpm離心20分鐘，取沉淀，經超濾除鹽、濃縮、除菌后