針對黃曲霉毒素的納米抗體的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及單域重鏈抗體技術（又稱納米抗體技術），以及基因工程抗體技術，特 別是針對黃曲霉毒素的單域重鏈抗體或多肽。 技術背景
[0002] 黃曲霉毒素（Aflatoxin)是由黃曲霉（Aspergillusflavus)、寄生曲霉 (Aspergillusparasiticus)、集蜂曲霉（Aspergillusnomius)和溜曲霉（Aspergillus tamarii)等真菌產生的次級代謝產物，具有強致癌性和強免疫抑制性。黃曲霉毒素是一類 化學結構類似的二呋喃香豆素衍生物，主要包括黃曲霉毒素隊(AFBJ、B2(AFB2)、Gi(AFGJ、 GJAFGJ等。在已發現的黃曲霉毒素中，黃曲霉毒素隊的毒性最強，被世界衛生 組織的癌癥研究機構劃定為I類致癌物。產毒真菌菌株廣泛存在于自然界中，糧食油料等 農產品在生產、加工以及儲藏等過程中均可能受到污染，導致黃曲霉毒素超標。我國是黃曲 霉毒素污染情況較為嚴重的地區。因此，開發穩定、快速、高靈敏、高通量的黃曲霉毒素檢測 方法，對于保障我國食品安全、減少由此帶來的損失具有重要意義。
[0003] 現有的黃曲霉毒素檢測方法主要有免疫分析法、儀器分析法以及薄層層析法。其 中免疫分析法可避免其它兩類方法存在的一些缺陷，具有靈敏度高、成本低以及可現場檢 測等優點。免疫分析法的原理是基于抗原抗體的特異性識別，抗體的性能是免疫分析方法 靈敏度、準確度等指標的決定性因素。因此獲得針對黃曲霉毒素的抗體是建立相關免疫學 檢測技術的前提和關鍵。
[0004] 單域重鏈抗體（又稱納米抗體）是由羊駝重鏈抗體的可變區組成，又稱為納米抗 體，具有耐酸堿、耐高溫以及易于生產等特性。這些特性對于黃曲霉毒素的低成本、可重復 使用的免疫學檢測方法有重要的實用價值。

【發明內容】

[0005] 本發明的目的是提供針對黃曲霉毒素的單域重鏈抗體，可以被用于制備檢測黃曲 霉毒素的試劑和工具。
[0006] 本發明提供一個針對黃曲霉毒素的單域重鏈抗體（即本發明針對黃曲霉毒素的 納米抗體，下同），具有SEQIDNO. :1、SEQIDNO. :3、SEQIDNO. :5、SEQIDNO. :7、SEQID NO. :9、SEQIDNO. : 11、SEQIDNO. :13 所示的氨基酸序列。
[0007] 其氨基酸序列的頂GT編號和結構域的劃分包括四個框架區（Framework region,FR)和三個互補決定區（Complementarity-determiningregion,CDR) 〇
[0008] 本發明提供一個核酸分子，其特征是編碼SEQIDNO. :1，通過遺傳密碼子可以隨 時獲得該核酸分子的具體序列。
[0009] 本發明還提供一個核酸分子，其特征是編碼SEQIDNO. :1、SEQIDNO. :3、SEQID NO. :5、SEQIDNO. :7、SEQIDNO. :9、SEQIDNO. : 11、SEQIDNO. :13 部分結構域，通過 遺傳密碼子可以隨時獲得該核酸分子的具體序列。對應的，可以為SEQIDNO. :2、SEQID NO. :4、SEQIDNO. :6、SEQIDNO. :8、SEQIDNO. :10、SEQIDNO. :12、SEQIDNO. :14 核 酸分子。
[0010] 本發明所提供的核苷酸序列或者至少部分序列可以通過合適的表達系統進行表 達以得到相應的蛋白質或多肽。這些表達系統包括細菌，酵母菌，絲狀真菌，動物細胞，昆蟲 細胞，植物細胞，或無細胞表達系統。
[0011] 本發明還提供一種載體，包含所述核酸序列。由于遺傳密碼子具有簡并性，該核酸 序列可以根據不同的應用目的而不同。
[0012] 本發明還提供一種宿主細胞，包括所述蛋白質或表達載體。
[0013] 本發明還提供一種檢測黃曲霉毒素的方法，含有本發明所述針對黃曲霉毒素 的單域重鏈抗體。基于本發明提供的針對黃曲霉毒素的單域重鏈抗體與黃曲霉毒素特 異性結合的能力，建立黃曲霉毒素的檢測方法。其中，優選的方法包括酶連免疫吸附法 (Enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA)，焚光免疫法（Fluoroimmunoassay，FIA)， 免疫芯片法，親和層析法和免疫層析法等。
[0014] 本發明所提供的氨基酸序列可以作為前體，通過隨機或定點突變技術進行改造， 能夠獲得性質（水溶性、穩定性、親和力以及特異性等）更好的突變體。
[0015] 本發明還涉及前述針對黃曲霉毒素的單域重鏈抗體在免疫檢測、黃曲霉毒素富集 以及純化中的應用。這些免疫檢測指的是非疾病診斷治療目的的免疫檢測。
[0016] 本發明所敘述的一些術語具有如下含義：
[0017] 結構域：蛋白質三級結構的基本結構單位，通常具有一定的功能。
[0018]IMGT編號：IMGT數據庫（TheInternationalImMunoGeneTicsDatbase)中的一 種已經標準化的抗體氨基酸序列編號方法。具體編號方法可以參考文獻（Ehrenman，F.，Q. Kaas,et.al. (2010).IMGT/3Dstructure-DBandIMGT/DomainGapAlign：adatabaseand atoolforimmunoglobulinsorantibodies,Tcellreceptors,MHC,IgSFand MhcSF.NucleicAcidsRes38(Databaseissue):D301-307.Lefranc,Μ.P. ,C.Pommie,et al. (2003).IMGTuniquenumberingforimmunoglobulinandTcellreceptorvariable domainsandIgsuperfamilyV-likedomainsDevcompImmunol27 (1) : 55-77.)中的描 述。
[0019]密碼子（codon):又稱為三連體密碼子（tripletcode)，指對應于某種氨基酸的 核苷酸三聯體。在轉譯過程中決定該種氨基酸插入生長中多肽鏈的位置。
【具體實施方式】
[0020] 下面通過單域重鏈抗體（多肽）的制備、分析及應用，對本發明做進一步說明，這 些具體實施例不應以任何方式被解釋為限制本發明的應用范圍。
[0021] 實施例1 :
[0022] 抗黃曲霉毒素單域重鏈抗體（即針對黃曲霉毒素的單域重鏈抗體）免疫文庫的構 建
[0023]將黃曲霉毒素隊與匙孔血藍蛋白（keyholelimpethemocyanin，KLH)共價偶聯， 得到黃曲霉毒素人工抗原AFBfKLH，取300μgAFBfKLH與弗氏完全佐劑乳化后，對羊駝 (Lamapacos)進行皮下多點注射免疫。加強免疫采用150μgAFBfKLH與弗氏不完全佐劑 乳化，間隔2周進行，每次免疫7天后靜脈取血，采用間接ELISA法測定血清效價，選擇血清 效價最高的樣品分離淋巴細胞，提取RNA。
[0024] RNA的提取參照TAKARA公司RNAiso試劑說明書進行。以RNA為模板，oligodT 為引物，參照TAKARA公司反轉錄酶說明書合成cDNA第一鏈。
[0025] 采用PrimeSTAR高保真DNA聚合酶，經巢式PCR獲得重鏈抗體的可變區編碼基因 (采用的引物見表1)。第一輪PCR分別以引物AlpVh-LD和CH2-R擴增cDNA，反應條件為， 98Γ，10s，55Γ，20s，72Γ，lmin，20 個循環，98Γ，10s，68Γ，lmin，72Γ延伸lOmin。
[0026] 將第一輪PCR產物用1. 2%的瓊脂糖凝膠電泳，回收600bp~750bp的DNA片 段，作為第二輪PCR的模板，分別用引物AlpVh-Sfil和AlpVHHRl-Notl，AlpVh-Sfil和 八1口￥冊1?2-如《，進行擴增，反應條件為，98°(：，1〇8,50°(：，2〇8,72°(：，4〇8,5個循環，98°(：， 108,68°(：，408,30個循環，72°(：延伸101^11。經0嫩片段回收試劑盒回收、定量，于-20°(：保 存備用。將噬菌粒PHEN1和PCR擴增產物分別用SfiI、NotI雙酶切，經瓊脂糖凝膠回收、 定量后，以1 : 3摩爾比，在16°C，過夜連接。
[0027] 表1文庫構建及鑒定所用的引物
[0028]
[0029] 注：下劃線表示限制性內切酶識別序列
[0030] 連接產物經乙醇沉淀后，溶于10μL無菌水，分十次進行電穿孔轉化大腸桿菌 TG1。取10μL電擊、培養后的菌液倍比稀釋，涂布氨芐青霉素2ΧΥΤ培養板，37°C，倒置 培養12~16h，采用引物M13-R和pHEN-R進行菌落PCR，計算庫容；其余部分全部涂布于 24cmX24cm氨芐青霉素2XYT培養板，37°C，倒置培養12~16h。用10mL，2XYT培養基將 培養板上的菌苔刮洗后，加入終濃度15~30%甘油，分裝，-80°C保存備用。
[0031] 根據計算的庫容量結果，接種10倍庫容量的活細胞于20mL的2XYT(含2%葡萄 糖，l〇〇yg/mL氨芐青霉素），30°C，220r/min培養至0D600達0. 5,按感染復數20 : 1加入 輔助噬