一種抗內氏放線菌卵黃抗體及其制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物制品制備技術領域，具體涉及一種抗內氏放線菌卵黃抗體及其制 備方法。
【背景技術】
[0002] 內氏放線菌（是口腔中定植的一種主要的放線菌，它通 過產生6-去氧太洛糖（6-deoxytalose)，將口腔中更多的放線菌和其他細菌黏附在牙釉質 上形成菌斑，菌斑中的細菌分解食物中的糖類產酸，酸化和腐蝕牙釉質形成齲齒，并可和其 他細菌進一步引起牙齦炎和牙周炎。
[0003] 卵黃抗體（immunoglobulinyolk，IgY)是鳥類血液中的免疫球蛋白傳遞至卵 黃，并在卵孵育過程中和孵育后對幼鳥和幼禽起保護作用的免疫球蛋白，IgY的優勢在于： 可與抗原特異性結合，發揮抗菌、抗病毒等多種生物學效應；制備經濟簡單，產量高；對實 驗動物無傷害，滿足動物權益保護的要求；穩定性好，具有耐熱、耐酸、耐蛋白酶等諸多優 點。隨著細菌耐藥性的不斷出現，應用卵黃抗體技術來發揮抗菌作用正逐漸成為研究熱點。

【發明內容】

[0004] 本發明主要目的在于提供一種抗內氏放線菌卵黃抗體，所提供的抗體用于漱口 液、牙膏、含片、奶制品、糕點、飲料、保健品等日常洗護用品或食品飲料時，可以對內氏放線 菌所引起的齲齒、牙齦炎、牙周炎等口腔疾病起到一定的預防和治療作用。
[0005] 本發明所采取的詳細技術方案如下所述。
[0006] -種抗內氏放線菌卵黃抗體，通過以下步驟制備而成： (一） 制備滅活的內氏放線菌作為抗原，具體過程為，取內氏放線菌進行培養，獲得菌 體，對菌體進行滅活處理，用生理鹽水重懸菌體，調整菌液濃度為1X1〇7~1X10 ^CFU/mL 備用； 所述內氏放線菌采用血瓊脂平板或用腦心浸液（brainheartinfusion，BHI)瓊脂培 養基進行培養，培養條件為37°C、厭氧培養； 所述內氏放線菌具體采用例如美國模式培養物集存庫（AmericanTypeCulture Collection)的保藏號為ATCC12104 的內氏放線菌（A.naeslundii); 所述內氏放線菌菌體滅活采用例如質量分數為〇. 2~0. 5%的甲醛進行滅活； (二） 免疫接種蛋雞，具體過程為：取步驟(一）中所制備的滅活后的細菌懸液與佐劑按 1 :1體積比充分混合后，皮下和肌肉多位點免疫接種蛋雞，每只雞每次接種劑量為2~3 mL； 免疫接種完成后2周開始收集雞蛋，所搜集雞蛋均于4°C保存；可持續收集雞蛋60天； 所用蛋雞具體采用例如22周齡健康產蛋來杭母雞（1600±230g); 所述免疫接種可具體接種4次，具體過程為：第一次免疫接種后兩周進行第2次免疫接 種，以后每隔9~14天免疫接種一次；第一次免疫接種時使用弗氏完全佐劑，第二次、第三 次、第四次免疫接種所用佐劑為弗氏不完全佐劑； (三）分離純化卵黃抗體，具體過程為： 首先取步驟（2)中所收集的雞蛋，對雞蛋外殼采用75%乙醇消毒清理后，打蛋分離蛋清 與卵黃，收集卵黃；對所收集的卵黃，按卵黃：雙蒸水=1 :9的質量比加入無菌雙蒸水，攪拌 充分混勻后，調節pH值至5. 0~5. 3,4°C靜置過夜；然后4°C、10000~12000rpm離心20min， 收集上清液； 對所收集的上清液采用滴加（NH4) 2 304溶液方法獲得卵黃抗體，具體過程為： 對所收集的上清液滴加飽和（NH4) 2S04溶液，使混合液中（NH4) 2 §04飽和度為50%， 4°C靜置過夜；4 °C、10000rpm離心20~30min，棄上清，對沉淀物用蒸餾水溶解后，滴加 飽和（NH4) 2 304溶液使飽和度達33%，4°C靜置過夜； 過夜后，4 °C、10000rpm離心20~30min，棄上清；對沉淀物（即采用滴加（NH4) 2 304溶液方法獲得卵黃抗體）用蒸餾水溶解后，經100KD超濾膜超濾純化，收集濃縮液，冷凍 干燥后即得到純化的抗內氏放線菌卵黃抗體，所得抗體_80°C保存。
[0007] 所述抗內氏放線菌卵黃抗體在口腔疾病預防與治療中的應用，可對內氏放線菌、 黏性放線菌或其所形成的生物膜具有一定的預防和治療作用，能夠抑制生物膜的產酸；具 體而言， 抗內氏放線菌卵黃抗體對內氏放線菌的MIC為25Pg/mL，對黏性放線菌的MIC為20〇M<g/mL ; 抗內氏放線菌卵黃抗體對內氏放線菌的MBEC為50mg/mL，對黏性放線菌MBEC為80〇M<g/mL ; 為抑制生物膜內細菌產酸，針對內氏放線菌生物膜，抗內氏放線菌卵黃抗體濃度不小 于12. 5Pg/mL，針對黏性放線菌生物膜，抗內氏放線菌卵黃抗體濃度不小于200Pg/mL。
[0008] 經過實際檢驗，本發明所制備的抗內氏放線菌卵黃抗體能顯著抑制內氏放線菌的 生長，并能有效清除內氏放線菌單菌生物膜的形成，并對其生物膜產酸有明顯抑制作用，制 備的抗內氏放線菌卵黃抗體對黏性放線菌具有一定的交叉免疫性。
[0009]總體而言，本發明所提供的抗內氏放線菌卵黃抗體具有容易制備、成本低廉等優 點，將其添加到漱口液、牙膏、含片、奶制品、糕點、飲料、保健品等日常洗護用品或食品飲料 時，對于內氏放線菌所引起的齲齒、牙齦炎、牙周炎的預防和治療具有較好地應用效果。
【具體實施方式】
[0010] 下面結合實施例對本發明做進一步的解釋說明。
[0011] 實施例1 本發明所提供的抗內氏放線菌卵黃抗體，其制備方法包括抗原制備、免疫注射產蛋母 雞、收集雞蛋分離純化抗體等步驟，詳細介紹如下。
[0012] (-）制備滅活的內氏放線菌作為抗原 具體過程如下： 取內氏放線菌進行培養，本實施例具體采用購買于美國模式培養物集存庫（American TypeCultureCollection)的保藏號為ATCC12104 的內氏放線菌（A.naeslundii); 培養時采用血瓊脂平板(也可采用腦心浸液（brainheartinfusion，BHI)瓊脂培養 基）； 培養條件為：37 °C、厭氧培養4~6天； 培養結束后，在平板上加入適量無菌生理鹽水，用涂布器刮下菌苔和菌落，然后吸入離 心管中，混勻； 將離心管5000~6000rpm、4°C，離心15~20min，棄上清，用0. 2~0. 5%甲酸(質量分 數）滅活18~24h，然后5000~6000rpm，4°C，離心15~20min，棄上清； 用生理鹽水洗滌，具體過程為：在上述去除甲醛的離心管中加入生理鹽水，混勻后， 5000~6000rpm、4°C、離心15~20min，棄上清；重復此過程不少于3次以確保完全將甲醛 洗去； 在上述生理鹽水洗滌后的離心管中再次加入適量生理鹽水，用麥氏比濁法測定并調整 細菌懸液濃度為1X1〇7~1X10tFU/mL備用。
[0013](二）免疫接種蛋雞 取步驟(一）中所制備的滅活后的細菌懸液與佐劑按1 :1體積比充分混合后，皮下和肌 肉多位點免疫接種蛋雞，每只雞每次接種劑量為2~3mL; 本實施例中所用佐劑均為美國Sigma公司產品，所用蛋雞為22周齡健康產蛋來杭母雞 (1600±230g)，購自吉林農業大學養雞場。
[0014] 本實施例中免疫接種時共接種4次，具體過程為：第一次免疫接種后兩周進行第2 次免疫接種，以后每隔9~14天免疫接種一次； 第一次免疫接種時使用弗氏完全佐劑，第二次、第三次、第四次免疫接種所用佐劑為弗 氏不完全佐劑。
[0015] 本實施例中共免疫接種10只蛋雞。4次免疫接種元成后2周開始收集雞蛋，所搜 集雞蛋均于4 °C保存；持續收集雞蛋60天。本實施例中共收集雞蛋436枚。
[0016] 上述免疫接種過程中，采用相同方法、相同步驟對相同數量的蛋雞接種生理鹽水， 按照相同程序收集雞蛋并保存作為陰性對照。
[0017](三）分離純化卵黃抗體 具體包括以下步驟： 首先取步驟（2)中所收集的雞蛋，對雞蛋外殼采用75%乙醇消毒清理后，打蛋分離蛋清 與卵黃，本實施例中所采用了 10枚雞蛋； 其次，將所收集的卵黃打散后，按卵黃：雙蒸水=1 :9的質量比加入無菌雙蒸水，攪拌充 分混勻后，用0.1mol.L-1HCL調節pH值至5.0~5.3,4°C靜置過夜； 第三，將上述過夜后卵黃-雙蒸水混合液4°C、10000~12000rpm離心20min，收集上清 液，本實施例中共收集到上清液1200mL; 第四，對第三步中所收集的含有卵黃抗水溶性成分（watersolublefraction，WSF)體 的上清液滴加飽和（NH4) 2S04溶液，滴加量于上清液體積相同（S卩1200mL)，滴加后混合液 中（NH4) 2 §04飽和度為50%，然后4°C靜置過夜； 第五，對第四步中靜置過夜后混合液離心，4 °C、10000rpm離心20~30min，棄上清； 對沉淀物用等體積（1200mL)的蒸餾水溶解后，滴加飽和（NH4) 2 304溶液使飽和度達33%， 4 °C靜置過夜； 第六，對第五步中靜置過夜后混合液離心，4 °C、10000rpm離心20~30min，棄上清； 對沉淀物用適量蒸餾水溶解(本次使用1500mL)，然后使用截留分子量為100KD超濾膜的默 克密理博Labscale小型切向流超濾儀(德國Merck公司）進行超濾純化，收集濃縮液，冷凍 干燥后即得到純化的抗內氏放線菌卵黃抗體，所得抗體_20°C保存。本實施例中共制得抗內 氏放線菌卵黃抗體653. 8mg。
[0018] 實施例2 對于實施例1所制備的抗內氏放線菌卵黃抗體，發明人對其抗抗菌活性進行了進一步 測定，相關過程簡要介紹如下。
[0019] 對于實施例1中所制備的抗內氏放線菌卵黃抗體，為檢測及使用方便，需制備成 一定濃度的水溶液，具體為：取實施例1中所制備的抗內氏放線菌卵黃抗體l〇mg，溶于10mL 無菌生理鹽水中，制成lmg/mL的母液，經0.22μπι無菌濾器過濾，備用；母液根據需要添加 生理鹽水后稀釋成相應濃度后再具體使用。
[0020] 最低抑菌濃度（minimumi