一種用于制備Aβ表位疫苗的融合蛋白及其制備方法和用圖
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物工程領域，涉及一種用于制備Αβ多價表位疫苗的重組融合蛋白 及其制備方法。更具體地說，本發明提供了一種利用基因工程技術提高Αβ功能Β細胞表 位免疫原性、優化Αβ疫苗免疫特性的技術方法和應用。
【背景技術】
[0002] 阿爾茨海默病（Alzheimer'sdisease,AD)是一種致死性神經退行性疾病，是老年 期癡呆的主要類型。其臨床特點是隱襲起病，逐漸出現記憶力衰退、認知功能障礙、行為異 常和社交障礙。隨病情的進行性加重，患者逐漸喪失獨立生活能力，在發病10~20年后因 并發癥而死亡。罹患AD不但嚴重影響患者自身的生活質量，而且還給家庭和社會帶來沉重 負擔。隨著社會老齡化的加速，AD患病率增加的可能性將達到近流行病的程度，已成為當 今公認的醫學和社會難題。
[0003] 由于AD病因復雜、仍未闡明，迄今為止仍然沒有成功預防和治愈AD的策略。目前 臨床應用的藥物主要有：膽堿酯酶抑制劑（多奈呱齊、卡巴拉汀、加蘭他敏等）、改善腦血流 循環和腦細胞代謝的藥物（如尼角麥林、吡拉西坦等）、神經保護劑（鹽酸美金剛）、非甾體 抗炎藥、自由基清除劑和抗氧化劑（維生素E、維生素C、司來吉蘭、褪黑素、姜黃素、輔酶Q) 等。這些藥物療效不高，僅能在一定程度上緩解和改善AD患者的認知、精神行為和功能方 面的癥狀。研究和開發AD防治藥物已迫在眉睫。
[0004] 近年來，β-淀粉樣蛋白（AmyloidP-peptide,Αβ)沉積學說被公認為AD的主 要致病機制。Αβ是由39-43個氨基酸殘基組成的內源性多肽，由淀粉樣跨膜前體蛋白 (Amyloidprescursorprotein,ΑΡΡ)依次經蛋白水解酶β和γ裂解得到。Αβ整體疏水， 不同分子之間容易以β-折疊的構象相互聚集，形成不溶性纖維，并以此為核心沉積形成 致病老年斑（Senileplaques,SP)。在大小不同的Αβ中，C-端包含有多個疏水性氨基酸 殘基的42肽Αβ(即Αβ42)最易沉積，并通過多種途徑損傷神經細胞及神經膠質細胞。減 少Αβ42產生、抑制Αβ42聚集、清除腦內Αβ42沉積已成為當前AD防治藥物研發的重要策略 和發展方向。
[0005] 1999年Schenk用人工合成的人Α042作為免疫原接種轉基因AD模型小鼠，在體 內成功誘導了針對六042的特異性免疫應答反應，并緩解和改善了模型小鼠的病理狀況，開 創了AD免疫防治的先河。此后，Elan公司用人Αβ42混合QS21佐劑開發了第一個AD疫苗 (ΑΝ-1792)。該疫苗的I期臨床研究證實：作為自身抗原，人Αβ42亦能誘導人體產生特異的 抗Αβ42體液免疫應答，能有效減輕患者腦內的淀粉樣沉積，并在一定程度上促進認知的改 善和記憶的恢復。然而，其Ila期臨床試驗的失敗則揭示：Αβ42誘導的細胞免疫反應能在 部分患者腦內產生具有中樞神經毒性的致敏Τ細胞。鑒于此，以Αβ為靶標的免疫策略被 廣泛認為是有效預防和治療AD的手段；去除Αβ42的Τ細胞表位，以Αβ42的Β細胞表位為 基礎研究和開發Αβ表位疫苗是AD防治藥物發展的重要趨勢。
[0006] 免疫學研究表明，N-端1-15氨基酸殘基組成的多肽片段（Αβi15)是Αβ42的功能 Β細胞表位，能與具有AD防治功能的抗Αβ42抗體發生特異性結合。然而，由于Αβi15是缺 乏輔助性T細胞（HelperTcell，Th)表位的小分子內源肽，因此強化其免疫原性并誘導免 疫反應向利于體液免疫的Th2方向發展已成為當前Αβ表位疫苗制備和開發的關鍵技術問 題，也是決定Αβ疫苗防治AD有效性和安全性的基礎。

【發明內容】

[0007] 有鑒于此，為了解決現有技術的不足，本發明提供了一種用于制備Αβ表位疫苗 的融合蛋白，基于此融合蛋白制備構建的Αβ多價表位疫苗可以誘導很強的針對Αβ的體 液免疫應答反應和細胞免疫應答反應，并且能誘導免疫反應向Th2方向偏移，體現出比傳 統抗原蛋白更好的有效性和安全性，為基于Αβ的阿爾茨海默病預防與治療奠定基礎。
[0008] 本發明具體技術方案如下： 一種用于制備Αβ多價表位疫苗的融合蛋白，所述融合蛋白具有三個功能片段：Ν-端 的功能片段選自天門冬酰胺酶II(EcA)片段，中部的功能片段以及C-端的功能片段分別選 自輔助性T細胞表位（ThE)多肽片段和人Αβ的B細胞表位片段中的一種，且中部的功能 片段和C-端的功能片段不相同，即該融合蛋白可以是Ν-端為天門冬酰胺酶II(EcA)片段， 中部為輔助性T細胞表位（ThE)多肽片段，C-端的為人Αβ的B細胞表位片段的蛋白，也 可以是Ν-端為天門冬酰胺酶II(EcA)片段，中部為人Αβ的Β細胞表位片段，C-端為輔助 性Τ細胞表位（ThE)多肽片段的蛋白。
[0009] 所述天門冬酰胺酶II片段包括但不限于大腸桿菌來源的天門冬酰胺酶II(EcA); 所述輔助性T細胞表位（ThE)為人工設計的通用型HLA-DR結合（PanHLA-DRbinding epitope，PADRE)多肽，該表位多肽包含但不限于PADRE多肽；所述人Αβ的B細胞表位片 段為來源于淀粉樣蛋白肽（Αβ)Ν-端1-15氨基酸殘基組成的多肽片段（Αβ115)。
[0010] 優選的，所述天門冬酰胺酶II片段的氨基酸序列如SEQIDNO: 1所示，輔助性Τ 細胞表位多肽片段的氨基酸序列如SEQIDN0:2所示，所述人Αβ的B細胞表位片段的氨 基酸序列如SEQIDΝ0:3所示。
[0011] 本發明所述融合蛋白的N-端的功能片段、中部的功能片段以及C-端的功能片段 可以直接相連或者通過連接肽相連。優選的，N-端的功能片段與中部的功能片段通過限制 性內切酶直接相連，中部的功能片段與C-端的功能片段通過連接肽相連，優選連接肽的氨 基酸序列如SEQIDN0:7所示。
[0012] 本發明提供的一種優選的融合蛋白氨基酸序列如SEQIDNO: 10所示。
[0013] 本發明還進一步公開了編碼本發明所述融合蛋白的基因，具有編碼三個功能片段 的基因：編碼融合蛋白N-端的功能片段的基因選自天門冬酰胺酶II片段的基因，編碼中 部的功能片段以及C-端的功能片段的基因分別選自編碼輔助性T細胞表位多肽片段的基 因和編碼人Αβ的B細胞表位片段的基因中的一種，且編碼中部的功能片段和C-端的功能 片段的基因不相同，編碼融合蛋白Ν-端的功能片段的基因、編碼中部的功能片段基因以及 C-端點功能片段的基因可以直接相連，也可以通過連接肽基因相連。
[0014] 優選的，所述編碼天門冬酰胺酶II片段的基因序列如SEQIDΝ0:4所示，編碼輔 助性Τ細胞表位多肽片段的基因序列如SEQIDΝ0:5所示，編碼人Αβ的Β細胞表位片段 的基因如SEQIDNO:6所示。
[0015] 優選的，所述編碼融合蛋白N-端的功能片段基因與編碼中部的功能片段基因直 接相連，編碼中部的功能片段基因與編碼C-端的功能片段的基因通過連接肽基因相連，所 述連接肽基因序列如SEQIDN0:8所示。
[0016] 優選的，編碼本發明所述融合蛋白的基因，核苷酸序列如SEQIDN0:9所示。
[0017] 本發明還公開了一種表達載體，含有本發明所述融合蛋白的編碼基因，優選核苷 酸序列如SEQIDN0:9所示，表達如SEQIDN0:10所示的氨基酸序列的融合蛋白。
[0018] 本發明還公開了制備本發明所述的融合蛋白的方法，包括如下步驟： (1) 設計得到本發明所述的核苷酸序列，SEQIDN0:4-6,SEQIDN0:8-9 ; (2) 構建含上述的核苷酸序列表達載體并將表達載體轉化入宿主細胞，形成可表達本 發明所述的融合蛋白的重組細胞； (3) 培養步驟（2)重組細胞；優選采用IPTG在25°C條件下低溫誘導所述融合蛋白的高 效可溶性表達； (4) 分離純化得到本發明所述的融合蛋白，優選的，包括將誘導表達后的重組細胞懸 浮于非變性融合蛋白提取液中，經裂解后離心分離得到包含可溶性融合蛋白的上清溶液； 對上清溶液進行鎳離子親和柱層析分離純化，以咪唑濃度梯度溶液洗脫層析得到包含融合 蛋白的洗脫峰；對上述洗脫峰經分子篩凝膠柱層析進一步純化四聚體蛋白并除去其中多余 鹽，凍干保存用于制備Αβ多價表位疫苗的融合蛋白。
[0019] 本發明的目的還在于提供本發明所述的融合蛋白在制備預防或治療β-淀粉樣 蛋白沉積引起的疾病藥物中的應用。所述淀粉樣蛋白沉積引起的疾病包括但不限于阿 爾茨海默病、淀粉樣血管病等。
[0020] 本發明的目的還在于提供一種藥物組合物，含有本發明所述的融合蛋白以及藥學 上可接受的載體或賦形劑。
[0021] 本發明通過長期而廣泛的研究發現，將大腸桿菌天門冬酰胺酶（EcA)與輔助性Τ 細胞表位（ThE)多肽和人Αβ42功能B細胞表位（Αβι15)多肽融合，可通過表位呈現方式、 抗原聚集方式和免疫細胞活化方式的改變，從而可從根本上克服Αβ42功能Β細胞表位的免 疫耐受，極大提高Αβ疫苗的體液免疫效果，顯著誘導免疫反應向利于AD安全、有效防治的 Th2方向發展。
[0022] Αβi15表位是由人Αβ42分子N-端1~15號氨基酸殘基組成的多肽片段，該表位 所激