專利名稱：一種hiv重組亞型dna疫苗的制備方法
技術領域：
本發明屬生物技術領域，涉及一種HIV重組亞型DNA疫苗的制備方法。
背景技術：
HIV/AIDS是目前全人類共同面對的最嚴重的公共衛生問題之一。目前全球現存的HIV病毒攜帶者約為3060萬 3610萬人；另據我國衛生部統計數據顯示截止2007年底，中國現存艾滋病病毒感染者和病人約70萬(55萬 85萬人)，其中艾滋病病人8. 5萬 (8萬 9萬人)。在經過了近25年的研究之后，人類對艾滋病病毒的認識已經取得了長足的進步， 例如在致病機理方面，人類免疫缺陷病毒(HIV)的基因結構和編碼蛋白相繼被闡明，病毒的受體和輔助受體相繼被發現；在藥物治療方面，核苷類逆轉錄酶抑制劑(NRTI)、非核苷類逆轉錄酶抑制劑(NNRTI)、蛋白酶抑制劑(PI)相繼研制成功，并應用于臨床，取得了良好效果，等等。盡管如此，我們離真正克服艾滋病還有很長一段距離，而造成這一局面的重要原因之一就是HIV病毒的迅速變異。HIV病毒的迅速變異導致了多種不同亞型和重組流行株出現，并且這些亞型和重組株在全球呈現不均勻分布，這在客觀上給HIV疫苗的研究帶來了極大的困難。在研制出具有廣泛交叉保護能力的“理想"HIV疫苗之前，根據特定地區的HIV-I優勢流行亞型，有針對性的設計疫苗不失為一個合理的選擇。此外，以往的HIV疫苗研究經驗提示我們特異性免疫反應的廣度對HIV疫苗的保護效果十分重要，而提高疫苗免疫反應廣度的重要手段之一便是增加疫苗所包含的抗原種類。就HIV-I而言，理想的疫苗不僅要包括feg、P0l、Env 三個結構蛋白，還應包括Tat、Nef、Rev等調節蛋白。近年來，特別是在Merck疫苗三期臨床試驗失敗后，由多個病毒抗原基因聯合構成免疫原的疫苗設計策略在國際上逐漸興起，國內這方面研究開展較少，尤其是針對HIV-I AE重組亞型病毒的疫苗研究尚處于空白階段。在HIV-I疫苗研制上，針對HIV-I胞膜蛋白Env的疫苗已有較多研究，但是已有的針對HIV -1胞膜蛋白Env疫苗尚不能十分有效的誘導中和抗體。最近，許多研究轉向了研制針對HIV-I病毒相對比較保守結構蛋白gag和調節蛋白tat的疫苗上，Gag蛋白表面富含CTL表位和T輔助細胞表位，以其為靶蛋白開發的DNA疫苗能誘發有效的中和抗體和CTL 反應，且可能對不同亞型病毒產生交叉保護，因而成為目前HIV疫苗研究的熱點之一。HIV Tat蛋白亦是HIV較為保守的蛋白，在病毒感染早期表達，并對病毒生活周期是必需的，Tat 蛋白增加HIV病毒在體內傳播的速度，對Tat蛋白高水平的體液和細胞免疫與良好的預后呈正相關，Tat疫苗所誘導的抗體能中和胞外Tat對機體各系統的損害，控制AIDS相關疾病的發生。最近Rezza等通過對252只感染HIV-I猴子的動物試驗觀察，發現高水平的 anti-Tat抗體伴隨HIV長期非進展性感染(long-term nonprogression)，而anti-Tat抗體陰性的動物則很快進展為免疫缺陷。針對Nef、Rev、Pol等蛋白的單價疫苗亦有大量研究， 但效果均欠佳。于是有許多研究將重點放在了 HIV-I多基因融合DNA疫苗研制上，因為疫苗誘發的免疫反應的廣度對HIV-I疫苗的保護效果有著深遠的影響機體免疫系統所能識別的關鍵表位越多，病毒就越不容易逃逸。而現有的候選疫苗在抗原構成上多以HIV-I的結構蛋白為主，主要包含feg、Pol和Env;在調節蛋白中，通常僅包含Nef蛋白。從提高疫苗免疫反應廣度的角度來看，這樣的抗原構成是遠遠不夠的，為了改善這一狀況，很有必要構建HIV-I結構蛋白feig、Pol、Env與Tat、Nef、Rev調節蛋白基因的融合DNA疫苗并評價其免疫原性。我國是一個HIV-I多亞型平行流行的國家，流行病學調查顯示，在我國HIV流行株中，AE重組亞型HIV-I是我國主要的HIV-I流行亞型之一，本研究擬以該亞型病毒研究對象，構建包括e/^、/7o入識仏iai、/^/和rer基因在內的DNA疫苗，并初步驗證其免疫原性。

發明內容
本發明的目的是提供一種HIV重組亞型DNA疫苗的制備方法，通過以下步驟實現
(1)設計與合成密碼子優化后的融合基因序列，
(2)DNA疫苗的構建和體外表達能力測定
A 重組質粒的酶切鑒定與測序將構建的重組質粒AE-Gpl45TRN用BamHI和)(baI進行雙酶切，酶切產物進行W)瓊脂糖凝膠電泳。其中，Gpl45TRN融合基因的片段長度為3423bp， 載體片段長度為5071 bp。電泳結果顯示酶切結果與預期結果完全一致，結果見圖1。DNA 雙向序列測定結果顯示插入序列與設計的序列完全一致；
B TRIVN融合蛋白真核表達用LipofectamineTM 2000將空載體質粒與重組質粒AE-Gpl45TRN分別轉染四31~細胞，培養48 h后收集細胞，并制備蛋白樣品進行 Western-Blot驗證。在各泳道上樣量基本相當的情況下，Western-Blot結果顯示，重組質粒轉染產物中出現約190KDa的特異性條帶，與預期大小一致。本發明用LipofectamineTM 2000將空載體質粒與重組質粒AE_Gpl45TRN分別轉染四31~細胞，培養48 h后收集細胞，并制備蛋白樣品進行Western-Blot驗證。在各泳道上樣量基本相當的情況下，Western-Blot結果顯示，重組質粒轉染產物中出現約190KDa的特異性條帶，與預期大小一致。本發明Gpl45-Tat-Rev_Nef編碼基因的密碼子優化和基因合成是通過Los Alamos HIV Database調取HIV_lAE2f株的全基因信息，使用J Cat在線軟件，按照哺乳動物的密碼子偏好進行密碼子優化，在抗原基因密碼子優化合成過程中，按照文獻報道對2個基因分別進行了定點突變Tat :C27S/K51T/R55L/G79A, Nef :K144R/D174K，合成基因簡稱為 AE-Gp145TRN。本發明按常規分子克隆方法將Ml I和EcoR V雙酶切的tat-rev-integrase(c-h alf) -vif-nef基因連接入表達載體，通過限制性酶切和DNA測序的方法對所構建的質粒進行鑒定后，采用德國QIAGEN公司EndoFree Plasmid Giga Kit試劑盒進行大量制備，制備好的無內毒素的質粒溶于無菌的PBS溶液中，pH7. 2，調整濃度為lmg/ml。本發明采用覆蓋HIV-lAE2f亞型Env，Tat，Rev，htegrase，Vif和Nef全長蛋白的肽庫來進行特異性T細胞反應檢測。本發明以AE重組亞型HIV-I病毒為研究對象，構建包括env、pol、gag、tat、nef 和基因在內的DNA疫苗，與AE-TRIVN相比，AE_Gpl45TRN能夠使特異性T細胞反應在Tat、Rev、Nef三個蛋白間更均勻的分布，提高了疫苗所活化的免疫反應廣度。


圖1是DNA疫苗AE-Gp 145TRN的酶切鑒定結果，1泳道為AE-Gp 145TRN的BamHI/ XbaI雙酶切產物。圖2重組質粒AE_Gpl45TRN的體外表達驗證，1泳道為空載體對照，3泳道為 AE-Gpl45TRN的轉染后產物，1泳道與3泳道的蛋白上樣量基本一致。圖3各組間總T細胞反應強度的比較。圖4特異性T細胞反應在不同病毒蛋白間分布的比較。
具體實施例方式本發明結合附圖和實施例作進一步的說明。實施例1
菌株、細胞和質粒感受態大腸桿菌DH5 α和轉染用細胞為本實驗室保存。表達 HIV-lAE2f tat~rev~integrase (c-hafl)-vif-nef1 融合基因的 DNA 疫苗由復旦大學生物醫學研究院提供。工具酶和主要試劑各種限制性內切酶、T4連接酶和其他工具酶均購自大連寶生物公司。真核細胞轉染試劑盒Lipofectamine 2000購自美國hvitrogen公司。質粒大量提取盒 EndoFree Plasmid Giga Kit 購自德國 QIAGEN 公司。Mouse IFN-y ELISP0T 試劑盒購自美國BD公司。本研究中采用覆蓋HIV_lAE2f亞型Env，Tat，Rev，htegrase (C-half 144 aas)，Vif和Nef全長蛋白的肽庫來進行特異性T細胞反應檢測。編碼基因的密碼子優化和基因合成通過Los Alamos HIV Database調取 HIV_lAE2f株的全基因信息，使用J Cat在線軟件(//www. jcat. de/)，按照哺乳動物的密碼子偏好進行密碼子優化。為了消除野生型的tat、基因潛在安全隱患，在抗原基因密碼子優化合成過程中，我們按照文獻報道對上述2個基因分別進行了定點突變 Tat (C27S/K51T/R55L/G79A)，Nef (K144R/D174K)，合成基因簡稱為 AE_Gpl45TRN。疫苗構建、鑒定和大量制備按常規分子克隆方法將Ml I和EcoR V雙酶切的t at-rev-integrase (c-half) -vif-nef基因連接入表達載體，通過限制性酶切和DNA測序的方法對所構建的質粒進行鑒定后，采用德國QIAGEN公司EndoFree Plasmid Giga Kit試劑盒進行大量制備，具體操作按說明書進行。將制備好的無內毒素的質粒溶于無菌的PBS溶液中(ρΗ7· 2)，調整濃度為lmg/ml。體外轉染與表達鑒定在6孔板中接種5X IO6個/ml 293T細胞2 ml，培養過夜， 至細胞鋪滿各孔的90%-95%，換用無血清無抗生素的DMEM，每孔2 ml。隨后，按試劑盒說明進行轉染操作。4 后收取細胞，制備蛋白樣品進行10%的SDS-PAGE。電泳所得的凝膠進行濕轉OOO mA電流，120 min)，轉至PVDF膜上。放入5%脫脂奶里封閉1 h，按1 :100 加入稀釋的HIV-I陽性血清，室溫反應2 h，PBST洗滌3次，再加入1 :2000稀釋的HRP標記的山羊抗人IgG抗體，室溫反應1 h，PBST洗滌3次，加入DAB底物進行膜上顯色。動物免疫將體重為18 22 g的SPF級雌性BALB/c小鼠隨機分為3組空載體對照組、AE-TRIVN免疫組和AE-Gpl45TRN免疫組。分別于0、2、4、7周在小鼠右側脛前肌注射100 μ g DNA。于第9周分離脾細胞進行免疫檢測。細胞免疫反應的檢測ELISP0T平板每孔加入100 μ 1包被抗體，4°C包被過夜后用1640完全培養基洗滌3次，加入封閉液200 μ 1/孔，室溫封閉2 h，棄去封閉液，將分離的小鼠脾細胞按2 X IO5每孔加入ELISP0T板，實驗孔加入多肽(終濃度4 μ g/ml)，陽性孔加入PMA (終濃度20 ng/ml)和ionomycine (終濃度500 ng/ml)，空白對照只加入脾細胞， 補充1640完全培養基至100 μ 1,37°C,5%C02孵育20 h，棄去細胞懸液，每孔加入200 μ 1 去離子水洗2次后換用PBST溶液洗滌3次，甩去洗液，拍干，用含10%血清的PBS按1 :250 稀釋檢測抗體，每孔加入100 μ 1，室溫孵育2 h。PBST洗滌3次后，用含10%血清的PBS按 1 100稀釋HRP標記抗體，每孔加入100 μ 1于ELISP0T板中，室溫孵育1 h。棄掉液體，拍干。每孔加入100 μ 1底物，閉光放置5-30 min后用去離子水終止顯色。晾干，用北京賽智ChampSpot III酶聯斑點分析儀計數分析。統計學方法數據均以均值士標準差表示，兩組間均值的統計比較使用非配對t 檢驗，以p<0. 05作為差異有顯著性的標準。實施例2
A 重組質粒的酶切鑒定與測序將構建的重組質粒AE-Gpl45TRN用BamHI和)(baI進行雙酶切，酶切產物進行W)瓊脂糖凝膠電泳。其中，Gpl45TRN融合基因的片段長度為3423bp， 載體片段長度為5071 bp。電泳結果顯示酶切結果與預期結果完全一致，結果參見圖1。 DNA雙向序列測定結果顯示插入序列與設計的序列完全一致；
B TRIVN融合蛋白真核表達用LipofectamineTM 2000將空載體質粒與重組質粒AE-Gpl45TRN分別轉染四31~細胞，培養48 h后收集細胞，并制備蛋白樣品進行 Wiestern-Blot驗證。在各泳道上樣量基本相當的情況下，Western-Blot結果顯示，重組質粒轉染產物中出現約190KDa的特異性條帶，與預期大小一致(圖2)，其核苷酸序列如SEQ ID 1所示。HIV-lae2f gpl45/tat/rev/nef 3417bp，序列中 1 2109 :gpl45，2122 2415 :tat 突變設計(C27S/K51T/R55L/G79A) ,2428^2793 :rev, 2806^2417 :nef 突變設計(K144R/ D174K)，粗體顯示的是由四個甘氨酸組成的連接子，克隆位點5、端)(ba 端BamH I。免疫原性評價
在DNA疫苗的設計上，主要解決了以下兩方面的問題 (1) DNA疫苗的安全性，包括Tat蛋白的突變失活、整合酶的去除野生型的HIV-I Tat蛋白有潛在毒性，它不僅能夠激活處于靜息狀態的HIV-I前病毒，還能夠對宿主細胞造成負面影響。為了消除野生型Tat的負面影響，我們將在序列設計過程中按照文獻報道對Tat蛋白進行突變失活，共涉及四個氨基酸位點的突變，分別為 C27S，K51T，R55L和G79A。上述四個位點的聯合突變既能夠很好的消除Tat蛋白對病毒基因和細胞基因調節作用，同時又不會削弱Tat的免疫原性。此外，為了避免整合酶可能帶來的潛在危險，我們亦將其從Pol蛋白去除。疫苗的免疫原性
構建env-tat-nef-rev融合基因DNA疫苗，提高疫苗免疫反應廣度。a.免疫結束后3周無菌分離小鼠脾細胞，采用HIV-lAE2f肽庫刺激后，用Elispot 方法進行特異性細胞免疫反應檢測。顯示的結果為扣掉本底(未加肽刺激孔的斑點數)后的每10萬個脾淋巴細胞的Elispot斑點數；每只小鼠的總反應強度是將Tat，Rev和Nef共三個肽池的斑點數疊加后的結果。從總T細胞反應強度來看AE-TRIVN(148士91 SFCs/ΙΟ6脾細胞)顯著高于Gpl45-TRN(55 ±28 SFCs/106脾細胞)，p=0. 017(圖3)。將總T細胞反應按肽庫分解后，我們發現AE-TRIVN所激發的特異性T細胞反應主要集中于Rev ；Gpl45_TRN 所激發的總T細胞反應強度雖然相對較弱，但卻能使特異性T細胞反應在Tat、Rev和Nef 三個抗原間的更加均勻的分布(圖4)。 b.技術方案分三步進行第一步，從Los Alamos HIV Database中調取HIV_1AE2F 的Env、Gag, Pol、Tat、Rev、Nef蛋白的氨基酸序列，經過必要的突變修飾之后，將其按人體細胞的密碼子偏好逆向翻譯成DNA序列，并送公司合成。第二步，利用合成基因構建DNA疫苗，體外驗證基因表達情況。第三步，DNA疫苗接種Balb/C小鼠，檢測小鼠體內的特異性免疫反應。
權利要求
1.一種HIV重組亞型DNA疫苗的制備方法，其特征在于，通過以下步驟實現(1)設計與合成密碼子優化后的融合基因序列，(2)DNA疫苗的構建和體外表達能力測定，A 重組質粒的酶切鑒定與測序將構建的重組質粒AE-Gpl45TRN用BamHI和)(baI進行雙酶切，酶切產物進行W)瓊脂糖凝膠電泳，其中，Gpl45TRN融合基因的片段長度為3423bp， 載體片段長度為5071 bp,電泳結果顯示酶切結果與預期結果完全一致，DNA雙向序列測定結果顯示插入序列與設計的序列完全一致；B TRIVN融合蛋白真核表達用LipofectamineTM 2000將空載體質粒與重組質粒AE-Gpl45TRN分別轉染四31~細胞，培養48 h后收集細胞，并制備蛋白樣品進行 Western-Blot驗證，在各泳道上樣量基本相當的情況下，Western-Blot結果顯示，重組質粒轉染產物中出現約190KDa的特異性條帶，與預期大小一致。
2.根據權利要求1所述的一種HIV重組亞型DNA疫苗的制備方法，其特征在于， Gpl45-Tat-Rev_Nef編碼基因的密碼子優化和基因合成是通過Los Alamos HIV Database 調取HIV-lAE2f株的全基因信息，使用J Cat在線軟件，按照哺乳動物的密碼子偏好進行密碼子優化，在抗原基因密碼子優化合成過程中，按照文獻報道對2個基因分別進行了定點突變:Tat :C27S/K51T/R55L/G79A, Nef :K144R/D174K，合成基因簡稱為 AE_Gpl45TRN。
3.根據權利要求1所述的一種HIV重組亞型DNA疫苗的制備方法，其特征在于，按常規分子克隆方法將Sal I和EcoR V雙酶切的tat-rev-integrase (c-half)-vif-nef基因連接入表達載體，通過限制性酶切和DNA測序的方法對所構建的質粒進行鑒定后，采用德國 QIAGEN公司EndoFree Plasmid Giga Kit試劑盒進行大量制備，制備好的無內毒素的質粒溶于無菌的PBS溶液中，pH7. 2，調整濃度為lmg/ml。
4.根據權利要求1所述的一種HIV重組亞型DNA疫苗的制備方法，其特征在于，采用覆蓋HIV_lAE2f亞型Env，Tat, Rev, Integrase, Vif和Nef全長蛋白的肽庫來進行特異性 T細胞反應檢測。
全文摘要
本發明提供一種HIV重組亞型DNA疫苗的制備方法，通過以下步驟實現設計與合成密碼子優化后的融合基因序列，DNA疫苗的構建和體外表達能力測定。本發明以AE重組亞型HIV-1病毒為研究對象，構建包括env、pol、gag、tat、nef和rev基因在內的DNA疫苗，與AE-TRIVN相比，AE-Gp145TRN能夠使特異性T細胞反應在Tat、Rev、Nef三個蛋白間更均勻的分布，提高了疫苗所活化的免疫反應廣度。
文檔編號A61P31/18GK102210874SQ20111012761
公開日2011年10月12日 申請日期2011年5月17日 優先權日2011年5月17日
發明者盧微, 呂國才, 楊益大, 楊萍, 王曉燕, 謝玨, 鄭臨 申請人:浙江大學