一種融合細胞及其制備方法和其作為腫瘤疫苗的應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種融合細胞及其制備方法和該融合細胞作為腫瘤疫苗的應用，尤其 是涉及一種采用新型抗原遞呈細胞ysT-APC和新城雞瘟病毒株NDV-Ulser修飾的腫瘤細 胞融合制備融合細胞的方法，還涉及所得融合細胞作為腫瘤疫苗的應用。
【背景技術】
[0002] 樹突狀細胞（以下稱為DendriticCell,DC)作為專職抗原遞呈細胞在誘導抗病 原微生物和抗腫瘤的免疫應答中起至關重要的作用。以DC為基礎的抗癌疫苗在臨床試驗 中也日益受到廣泛的關注。為了獲得腫瘤特異性疫苗，研究者們采用了多種策略來研制基 于DC細胞的腫瘤疫苗，以激發抗腫瘤特異性免疫應答。臨床試驗中應用的DC疫苗主要包 括抗原負載的DC細胞疫苗、基因修飾的DC細胞疫苗等。但令人失望的是，在這些DC疫苗 的臨床試驗中，僅有很少的患者接受上述DC細胞疫苗治療后出現客觀應答反應。其原因主 要在于：一是對于各種腫瘤已經確定的特異性腫瘤抗原極少，腫瘤細胞也容易通過抗原變 異逃避針對單一抗原表位的免疫作用；二是由于提取的腫瘤蛋白抗原在體內容易被蛋白質 水解酶降解，誘導的免疫效應不能持久，難以獲得理想的治療效果；三是基因修飾法制備的 DC細胞腫瘤疫苗，受基因導入效率和基因轉移的靶向性等技術難題的影響；四是DC的的細 胞疫苗還受到DC細胞的數量少、純度低以及DC和腫瘤細胞的免疫源性差等的影響。對于 DC融合細胞來說，理論上所有的腫瘤細胞抗原都能夠有效地進入抗原遞呈途徑，免疫源性 TAA或TSA肽在共刺激分子存在下由MHCI和MHCII遞呈到細胞表面。而且融合細胞能夠迀 移到腫瘤引流淋巴結，在那里它們能直接與⑶4+T和⑶8+T細胞直接進行相互作用，誘導強 烈的抗腫瘤免疫應答。另外，宿主DC細胞也可以攝取死亡的融合細胞釋放的TAAs并依靠 其表面MHCI和MHCII分子遞呈同時活化CD4+和CD8+T細胞。DC的融合細胞疫苗雖然可以 涵蓋所有已知和未知的腫瘤特異性抗原及腫瘤相關抗原庫，但DC融合細胞疫苗也受DC細 胞數量和純度及腫瘤細胞的免疫源性等的影響，因此，上述DC腫瘤疫苗在臨床上的效果往 往并不理想。
[0003] 近年來，DC和腫瘤細胞的融合細胞疫苗的出現成為了腫瘤免疫治療的研究熱點， 因為融合細胞既表達腫瘤的所有抗原成分，又具有DC細胞的抗原提呈能力，即融合細胞能 遞呈腫瘤細胞所有的抗原。腫瘤細胞特異性抗原仍未得到明確鑒定，因此用DC-腫瘤融合 細胞遞呈全腫瘤抗原被認為是一種簡單而有效的抗腫瘤方法。DC-腫瘤融合細胞可通過化 學方法如聚乙二醇（PEG)或是使用電融合儀獲得。腫瘤細胞在融合前一般都要經過射線照 射或是絲裂霉素C處理，所得到的DC-腫瘤融合細胞疫苗是沒有增殖危險的。Zhou(Zhou J,ffengD,ZhouFetal.Patientderivedrenalcellcarcinomacellsfusedwith allogeneicdendriticcellselicitanti-tumoractivity：invitroresultsand clinicalresponses.CancerImmunolImmunother[J]，2009, 58(10):1587-1597)報 道10個進展的腎癌患者接受疫苗治療后，其中6個人的病情穩定（SD)持續了 1.5年。 Avigan(AviganD,VasirB，GongJetal.Fusioncellvaccinationofpatients withmetastaticbreastandrenalcanerinducesimmunologicalandclinical responses.ClinCancerRes[J], 2004, 10 (14):4699-4708)的研究結果表明，在轉移性 乳腺癌病人中，一位患者胸壁8cmX6cm的腫塊幾乎完全消退。另一位患者腎上腺腫塊 縮小了 50%，肺上的包塊縮小了 44%。Trefzer(TrefzerU，HerberthG，WohlanK，et al.Vaccinationwithhybridsoftumoranddendriticcellsinducestumor-specific TcellandclinicalresponsesinmelanomastageIIIandIVpatients.IntJ Cancer[J]，2004, 110(5) :730-740)研究報道，17例III和IV期黑色素瘤患者接受了融合 細胞疫苗治療后，8例患者有臨床療效，1例達到完全緩解，1例達到部分緩解，6例疾病穩 定，平均存活28個月；另外9例患者存活5-22個月，平均存活時間為12. 5個月，較IV期黑 色素瘤患者平均存活時間（8個月）明顯延長。
[0004] 然而DC-腫瘤融合疫苗也有其很大的局限性，雖然DC細胞可由外周血中的單核細 胞來誘導，但單核細胞來源的DC(Mo-DC)受體外增殖能力和不同DC誘導條件的限制，使得 單核來源DC(Mo-DC)數量很有限，一般100ml外周血分離PBMCs并經貼壁誘導后最多可獲 得1X107個DC，而且這些Mo-DC細胞均一性很差，往往是成熟與未成熟DC交織在一起，未 成熟DC細胞純度一般只能達到40-50 %左右，未經修飾的DC-腫瘤的融合效率大概在30 % 左右，按照DC細胞：腫瘤細胞=1:10的比例進行融合，融合率僅為20-30 %，融合細胞相關 抗原的表達一般也只能達到30-50%左右，因此臨床試驗中制備的DC-腫瘤融合細胞疫苗 要達到理想的治療效果必須得滿足以下條件：一是用于制備融合細胞的無論是抗原遞呈細 胞還是腫瘤細胞必須要有很強的免疫源性；二是必須得提高抗原遞呈細胞和腫瘤細胞的 融合效率，只有足夠數量的融合細胞才能更好的發揮有效的免疫應答作用；三是要獲得足 夠數量的融合細胞，首先要有足夠數量且表型均一的抗原遞呈細胞。

【發明內容】

[0005] 為了克服現有技術的缺陷，本發明提供了一種融合細胞及其制備方法和所得融合 細胞作為腫瘤疫苗的應用。本發明中采用新型抗原遞呈細胞YST-APC和新城雞瘟病毒株 NDV-Ulser修飾的腫瘤細胞進行融合，其中新型抗原遞呈細胞y5T-APC是通過采用磷酸 化抗原或雙膦酸鹽類藥物刺激活化臍帶血來源的單個核細胞細胞獲得的，將所得融合細胞 進行分離純化和擴大培養并將其制備成疫苗。其中，本發明所涉及的yST-APC、NDV-Ulser 修飾的腫瘤細胞、二者的融合細胞都可以進行大量制備；與采用DC細胞和未經修飾的腫瘤 細胞進行融合相比，本發明方法能得到更多的新型抗原遞呈細胞TST-APC，yST-APC和 經過修飾的腫瘤細胞的融合率高，本發明所得融合細胞腫瘤抗原效價更完整、免疫源性更 強、腫瘤抗原負載率高。
[0006] -種融合細胞的制備方法，包括以下步驟：
[0007] (1)制備NDV-Ulster病毒株修飾的腫瘤細胞
[0008] 將腫瘤細胞滅活，在滅活的腫瘤細胞中按照每（1-2)X107個滅活的腫瘤細胞中加 入NDV-Ulster病毒株32個血凝單位的比例加入NDV-Ulster病毒株，得混合物，將混合物 移入培養瓶中，在培養瓶中加入無血清細胞培養基并于37°C、5%C02的條件下培養0. 5-2 小時，離心收集NDV-Ulster病毒株修飾后的腫瘤細胞，洗滌并進行無菌檢驗，無菌檢驗陰 性為合格；
[0009] (2)制備采用磷酸抗原或雙膦酸鹽類藥物刺激活化的新型抗原遞呈細胞 y 8 T-APC
[0010] 從臍帶血血庫購買的或患者自己在商業機構保存的臍帶血中分離單個核細胞后， 用含2-10%所述臍帶血血漿的無血清細胞培養基將單個核細胞稀釋到1-2X106個/ml， 置于培養瓶中，并向培養瓶中加入磷酸化抗原或雙膦酸鹽類藥物，優選1-羥基-2_(咪 唑-i-yl)-亞乙基卜二磷酸-水化物刺激活化單個核細胞，使磷酸化抗原或雙膦酸鹽 類藥物濃度為1-10yM，將培養瓶置于37°C、5%C02的條件下培養18-24h后，再在培養瓶 中加入重組人白細胞介素-II(即rhIL-2)，使其濃度為100-1000U/ml，優選1000U/ml，每 隔2-3天繼續補充所述含2-10%所述臍帶血血漿的無血清細胞培養基并補充重組人白細 胞介素-II，使重組人白細胞介素-II濃度保持為l〇〇-l〇〇〇U/ml，優選1000U/ml，如此總共 培養7-14天，優選14天，即可獲得活化的yST-APC，離心將yST-APC收集起來，對活化 的yST-APC細胞進行微生物、細胞活率及免疫表型的檢測，微生物檢測陰性，細胞活率> 85%，目標免疫表型的陽性率均> 80%才能用于融合細胞的制備；
[0011] (3)制備yST-APC和NDV-Ulser修飾的腫瘤細胞的融合細胞
[0012] 使用不同熒光染料標記的抗體對步驟（1)所得NDV-Ulser修飾的腫瘤細胞以及步 驟⑵培養的yST-APC進行染色，每2X105個yST-APC加入UXloefNDV-Ulster 修飾的腫瘤細胞（即細胞比例1:5-10)進行融合，獲得融合產物；優選使用FITC標記的 抗MUC1 (HMPV,BDPharminggen)單克隆抗體和 / 或FITC標記的抗Her-2/neu(TA-l,BD Pharminggen)單克隆抗體對步驟（1)所得NDV-Ulser修飾的腫瘤細胞進行染色，優選使用 PE標記的抗HLA-DR(