一種c群腦膜炎球菌莢膜多糖結合疫苗的制備方法
【專利摘要】本發明涉及一種新式的C群腦膜炎球菌莢膜多糖結合疫苗的制備方法。將純化的C群腦膜炎球菌莢膜多糖使用EDAC催化其與連接臂ADH共價結合，制備多糖衍生物，隨后將多糖衍生物與載體蛋白白喉毒素無毒突變體CRM197在EDAC催化下共價結合，形成多糖?蛋白結合物；經純化、過濾后得到C群腦膜炎球菌莢膜多糖結合疫苗原液。這種疫苗可以預防嬰幼兒中由C群腦膜炎球菌引起的流行性腦脊髓膜炎及其并發癥。
【專利說明】
-種c群腦膜炎球菌芙膜多糖結合疫苗的制備方法
技術領域
[0001] 本發明屬于生物制藥技術領域，具體為一種C群腦膜炎球菌芙膜多糖結合疫苗的 制備方法。
【背景技術】
[0002] 腦膜炎球菌是世界范圍內侵襲性腦膜炎的主要致病菌，也是唯一能引起大流行的 細菌病原體。在撒哈拉W南的非洲地區，每5-10年會爆發一次大流行，在歐美發達國家每年 也會有超過1萬例病例報道。據估計，全球每年爆發超過1，200，000起感染病例，造成135， 000例死亡。即使在得到適當治療的條件下，腦膜炎球菌感染引起的死亡率也可超過10%， 并在感染的幸存者中會有約10%~20%留有永久性的神經系統后遺癥。
[0003] 腦膜炎球菌已被發現有13種血清群，其中4、8、(：、胖135、￥群為主要的致病血清群。 我國自1984年在全國各地進行兒童A群腦膜炎球菌多糖疫苗免疫W來，A群流腦得到了有效 控制，全國的發病率低于1/10萬。但近年來，C群流腦病例在我國開始增加，2003~2005年， 國內十多個省市相繼報道C群流腦的流行發病，2009~2010年全國檢出的流腦病例中，C群 病例比例約為70%，要高于A群病例，C群流腦菌株的比例呈上升趨勢，流腦流行菌群正在發 生從A群到C群的變化。疫苗是腦膜炎球菌感染的主要預防手段。目前已上市的腦膜炎球菌 疫苗主要有兩種，分別是多糖疫苗與結合疫苗。多糖疫苗W純化的腦膜炎球菌芙膜多糖為 主要成分，能在成人及年長兒童中誘導產生血清抗體反應，但是該種疫苗對嬰幼兒的免疫 原性極差，且不能誘導產生長期的免疫記憶;結合疫苗則是將純化的腦膜炎球菌芙膜多糖 與載體蛋白共價結合后制成的疫苗，可誘導產生高滴度的血清殺菌抗體，并產生長期的免 疫記憶，對嬰幼兒也有足夠的免疫原性，是2歲W下幼兒接種腦膜炎球菌疫苗的首選。
[0004] 在結合疫苗的制備過程中，往往要對芙膜多糖進行活化，并添加連接臂使多糖與 載體蛋白共價結合。目前國內最常用的活化劑為漠化氯(CNBr)，在堿性條件下與多糖混合 后可在多糖的結構添加一個活性的氯基基團，隨后將活化多糖與己二酷阱(ADH)反應，從而 在多糖結構中添加連接臂;活化后的多糖與載體蛋白混合，在催化劑碳二亞胺化DAC)的作 用下連接臂與載體蛋白的游離簇基共價結合，經超濾，純化即得到多糖-蛋白結合物。上述 傳統方法有一定的缺陷，首先是活化劑漠化氯為劇毒物質，在制備過程中有對操作人員造 成嚴重傷害的風險，并在制備完成后需嚴格檢測殘留量;其次活化過程需要在堿性條件下 進行，多糖在堿性條件下易水解，而多糖結構中的0-乙酷基在堿性條件下易自多糖結構中 解離，上述兩種情況都可能影響最終結合物的免疫原性;最后，利用漠化氯活化多糖的效率 并不高，導致最終產物的得率不高，提高了制造成本。近年來，CNBr的取代物質1-氯基-4-二 甲基氨基化晚翁四氣棚酸鹽(CDAP)也逐漸普及開來，CDAP同CNBr相比，具有一定的優勢，毒 性很低，對人員潛在傷害很小，活化條件也相對溫和，活化效率較CN化也有了 一定的提升， 是一種較為理想的多糖活化劑。但是其高昂的價格（>l〇〇〇$/g)顯著提高了疫苗的制造成 本，制約了其廣泛應用。

【發明內容】

[0005] 本發明根據傳統結合方法中的種種不足，在C群流腦結合疫苗的制備過程中，放棄 了傳統的漠化氯或CDAP活化多糖的方法，而是從C群多糖的結構出發，利用其分子結構中所 含有的簇基，在不活化多糖的情況下使用結合反應中所用到的催化劑抓AC將連接臂ADH共 價結合到多糖分子上，隨后將此種方法所得到的多糖衍生物與載體蛋白進行結合。該方法 采用低毒的抓AC作為催化劑衍生多糖，對環境及人員危害很小;整個制備過程均在弱酸條 件下進行，最大程度的減少了多糖與蛋白的水解變性狀況，所得結合物收率較高，穩定性 好，并具有良好的免疫原性。本發明亦可應用于其他含簇基結構的芙膜多糖結合疫苗的制 備中。
[0006] 該發明設及到的C群腦膜炎球菌多糖蛋白結合物的制備方法具體步驟如下:溶解C 群腦膜炎球菌多糖，過濾除菌;在多糖溶液中加入ADH，調節溶液抑5.5~6.3;加入抓AC催 化多糖衍生;反應完成后將多糖衍生溶液超濾得到多糖衍生物;將多糖衍生物與載體蛋白 溶液混合，調節溶液pH 5.5~6.3，冰浴;加入抓AC冰浴條件下催化結合反應;反應完成后將 結合物純化過濾即得到結合物原液。
【附圖說明】
[0007] 圖1分子篩的方法分離純化C群流腦多糖結合物(CPS_edacAH-CRM197)的層析圖譜， 層析介質為S邱harose 4FFD206nm和280皿波長同時在線監測，峰1為Vq處收集的目的結合 峰。
【具體實施方式】 [000引實施例1
[0009]下面結合反應實例描述本發明
[0010] C群芙膜多糖溶解至5~lOmg/ml，將1~3倍于多糖質量的AD助日入到多糖溶液中， 攬拌混勻，用稀鹽酸將溶液pH調節至抑5.5~6.3;加入與多糖質量比為0.2~0.6mg/mg的 EDAC，室溫攬拌反應;反應期間用稀鹽酸保持溶液抑5.5~6.3。
[0011]反應1~2小時后，將多糖衍生溶液用30KD超濾膜包超濾去除小分子物質。0.45μπι 濾膜過濾后2~8°C保存。
[001 ^ 稱取CRM197蛋白溶解至10~20mg/ml，取多糖衍生物溶液與CRM197蛋白溶液混合， 使多糖與蛋白質量比為1~2mg/mg，冰浴；用稀鹽酸將混合溶液抑調節至pH 5.5~6.3;隨后 向混合溶液中加入終濃度為10~30mmo 1 /L的抓AC，冰浴攬拌反應，用稀鹽酸保持溶液pH 5.5~6.3。反應1~3小時。
[0013] 反應完成后用化0聞尋溶液pH調至中性終止反應，用100KD超濾膜包超濾反應溶液 去除小分子物質，用S邱harose 4FF純化結合物，收集Vo處洗脫峰，0.22皿濾膜過濾后即為C 群流腦多糖-蛋白結合物原液，純化圖譜見圖1，將結合物記為CPS_edacAH-CRM197。
[0014] 實施例2
[0015] 本研究所采用的多糖衍生方法與傳統的使用CN化或CDAP的活化方法相比，條件比 較溫和，操作相對簡單。但該方法制備的C群多糖結合物在糖蛋白比、得率、游離多糖水平等 方面能否達到乃至超過傳統方法制備的結合物也值得關注，因此，本實例對本研究與其他 方法制備所得結合物開展了主要指標的檢測，并將檢測結果進行對比。
[0016] 不同方法制備的結合物的生化特性對比
[0017] 為與傳統方法進行比較，本研究采用CDAP活化多糖的方法為對照方法制備結合 物。
[0018] 主要操作步驟如下：
[0019] CDAP活化多糖與蛋白間接結合制備C群多糖蛋白結合物
[0020] C群芙膜多糖溶解至5~lOmg/ml，向其中加入lOOmg/ml的CDAP溶液，使CDAP與多糖 質量比為0.5~1. Omg/mg，攬拌均勻后加入與CDAP等體積的TEA溶液，使用化0H溶液將溶液 調節至P冊.5~9.5，室溫反應1~5111；[]1。
[0021] 向多糖活化溶液加入1~3倍于多糖質量的ADH，用肥1調節溶液至抑8.5~8.9,室 溫攬拌反應兩小時后置于2~8°C反應過夜。
[0022] 將反應過夜的多糖衍生溶液用30KD超濾膜包超濾去除小分子物質。0.45皿濾膜過 濾后2~8°C保存。
[0023] 稱取CRM197蛋白溶解至10~20mg/ml，取多糖衍生物溶液與CRM197蛋白溶液混合， 使多糖與蛋白質量比為1~2mg/mg，冰浴；用稀鹽酸將混合溶液抑調節至pH 5.5~6.3;隨后 向混合溶液中加入終濃度為10~30mmo 1 /L的抓AC，冰浴攬拌反應，用稀鹽酸保持溶液pH 5.5~6.3。反應1~3小時。
[0024] 反應完成后用化0聞尋溶液pH調至中性終止反應，用100KD超濾膜包超濾反應溶液 去除小分子物質，用S邱harose 4FF純化結合物，收集Vo處洗脫峰，0.22皿濾膜過濾后即為C 群流腦多糖-蛋白結合物原液，記為CPS_cdapAH-CRM197。
[0025] 所得結合物原液檢測結果與本研究結合方法的結果進行比較
[00%]參照2015版藥典通則3102及通則0731第二法(福林酪法)對實施例1中原液及上述 兩種方法制備的原液取樣測定其多糖、蛋白、游離多糖含量，并計算其收率，檢測結果如表1 所示。
[0027]表1.不同方法制備的C群流腦多糖結合物原液檢測結果 [002引
[0029] 如表1所示，本研究制備的結合物各項主要生化指標與實例2中采取的方法制備的 結合物相差不大，但在游離多糖方面前者明顯優于后者，兩種方法游離多糖差別大的原因 在于在多糖衍生的過程中CPS_cdapAH-CRM197容易產生交聯導致最終的結合產物分子量較 大，游離多糖比較高；本方法制備的結合物的產物收率接近CDAP法的一倍，具有明顯的優 勢，顯示出該方法良好的適用性與優越性。
[0030] 實施例3
[0031 ] C群流腦多糖結合物穩定性考察
[0032] 針對在未來的生產條件下制品可能暴露的溫度為2~8°C和短暫的室溫，我們考察 了上述實例中兩批原液在2~8°C保存3、6、8個月和20~25°C保存4周、6周后的質量穩定性， W及在極端環境下37°C3天、7天、14天的穩定性，并將兩者進行比較。
[0033] 兩批結合疫苗原液樣品于2~8°C保存3個月、6個月和8個月W及37°C3天、7天、14 天后分別進行各項指標的檢測，檢測方法同上，檢測結果見表2和表3。
[0034] 如表2所示，兩批C群結合物原液于2~8°C保存8個月后多糖含量、蛋白含量和糖蛋 白比等指標均無明顯變化，隨著樣品放置時間的的延長，兩批結合物游離多糖都有所增加， CPS_cdapAH-CRM197結合物的游離多糖增幅明顯大于CPS_edacAH-CRM197,在2~8°C穩定性方 面后者要優于前者。
[0035] 表3所示兩批C群結合物原液于20~25°C保存6周后多糖含量、蛋白含量和糖蛋白 比等指標也無明顯變化，游離多糖的變化也與2~8Γ保存8個月的變化基本一致。在常溫條 件下C群多糖結合物均顯示一定的熱穩定性。
[0036] 表4所示兩批C群結合物原液于37°C保存3天、7天和10天后多糖含量、蛋白含量和 糖蛋白比等指標無明顯變化，但在游離多糖檢項上CPS_cdapAH-CRM197結合物在3天后游離 多糖就明顯增加，7天后超過40 %，而CPS_edagAH-CRM197結合物在14天后游離多糖仍未超過 10%，說明在高溫環境下本方法制備的結合物的穩定性要遠高于CDAP活化法制備的結合 物。
[0037] 根據實例1、實例2和實例3的研究結果顯示本方法相較于CDAP法，除成本較低，操 作方便等優點外，在產物的理化特性、產物收率、穩定性方面也具有明顯的優勢。從方法原 理上分析，CDAP法在活化多糖的過程中，主要利用多糖結構中的徑基基團，但C群多糖中比 徑基更活潑的簇基結構對該活化過程可能會有負面影響，而且ADH與多糖活化后產生的氯 基的共價結合反應是一種自發的反應過程，沒有催化劑的促進作用，反應較為緩慢，往往需 要過夜，而且效率很低，所產生的連接臂由于數量過少很容易就被多糖自身交聯而被屏蔽 掉，從而影響結合效率。相比之下，EDAC催化多糖直接利用了多糖結構中最活潑的簇基基 團，并且邸AC作為一種催化劑，可有目的性促進ADH與多糖簇基的共價結合反應，反應迅速， 效率較高，最終產物的衍生率很高，即使多糖自身交聯對最終結合反應的影響也有限，從而 提高了最終結合物的收率。另外，CDAP法活化多糖后多糖W C = N基團與ADH上N此相連，穩定 性與抓AC法催化形成的酷胺鍵相比較差，運可能是抓AC法制備的結合物穩定性優于CDAP法 結合物的原因。
[0038] 表2.兩種C群腦膜炎球菌多糖結合物原液于2~8°C存放不同時間的各項質量指標 檢定結果
[0039]
[0040] 表3.兩種C群腦膜炎球菌多糖結合物原液于20~25°C存放不同時間的各項質量指 標檢定結果
[0041]
[0042] 表4.兩種C群腦膜炎球菌多糖結合物原液于37°C存放不同時間的各項質量指標檢 定結果
[0043]
[0044] 實施例4
[0045] 不同方法制備的C群流腦多糖-蛋白結合物的免疫原性測定。
[0046] 選取的試驗動物為4~6周齡的SPF級BALB/C小鼠，小鼠體重12~14g，雌性。后腿皮 下注射，按〇，14天分別注射1針，共2針次。樣品組注射各含2.化g的C群多糖的結合物；陽性 組為市售的A+C流腦多糖結合疫苗，劑量同上；多糖對照組注射各含5.化g的A、C群多糖；陰 性對照組注射相同劑量的生理鹽水。每組10只小鼠。第2針注射后7天眼眶采血，分離收集血 清，-2(TCW下保存待用。
[0047] 采用多糖直接包被的間接化ISA法測定各組小鼠單個血清中IgG抗體滴度。將C群 多糖用碳酸鹽緩沖液包被酶標板，于37°C放置4小時，然后于4 °C放置過夜。次日37°C封閉1 小時。血清樣品第1針起始稀釋倍數20倍，第2針免疫血清起始稀釋倍數100倍，之后依次進 行2倍系列稀釋，37°C解育2小時;洗板后加入適宜稀釋度的堿性憐酸酶標記的羊抗鼠 IgG抗 體，37°C解育1小時后用酶底物對硝基苯酪憐酸鹽顯色（Img/ml)室溫顯色后用終止液終止 反應，在酶標儀上測定，于405nm波長下讀數，W生理鹽水陰性對照組血清0D405值計算 Cutoff值，其它血清0D值超過Cutoff值的血清最高稀釋度即為該份血清的抗體滴度。抗體 滴度進行對數轉換后計算各組動物血清抗體幾何平均滴度。然后用統計軟件SPSS13.0進行 方差分析計算各組間差異性，結果見表5。
[004引表4的結果顯示，制備的樣品可誘導小鼠產生針對C群多糖的IgG抗體應答。第1針 免疫后結合物與對照疫苗之間抗體水平沒有差異，但均比多糖組高;2針次免疫后兩批結合 物W及對照疫苗誘導的抗體水平也相當，雖然巧巾結合物制備工藝不同，糖蛋白比相差較 大，游離多糖含量相差也很大，但抗體水平之間沒有明顯差異(P>1.000)且均比第1針和多 糖對照組抗體滴度有顯著提高(P = 0.000)，顯示結合疫苗的加強效應。
[0049]表4.免疫小鼠誘導的針對C群多糖抗體GMT
[(K)加 ]
【主權項】
1. 一種C群腦膜炎球菌多糖蛋白結合疫苗。其特征在于:充分利用C群腦膜炎球菌莢膜 多糖的結構特點在不活化的情況下，在碳二亞胺(EDAC)存在下催化連接臂己二酰肼ADH與 多糖共價偶聯形成多糖衍生物，將多糖衍生物超濾后與載體蛋白使用HMC催化結合形成多 糖-蛋白結合物，經超濾、純化、過濾得到C群腦膜炎球菌結合疫苗原液。2. 根據權利要求1所述要求，其特征在于:所衍生的多糖為結構中含有羧基的莢膜多糖 包括但不限于C/Y/W135群腦膜炎球菌多糖、傷寒Vi多糖、1/3/4/5/8/9/12F型肺炎鏈球菌莢 膜多糖。3. 根據權利要求1所述要求，其特征在于：多糖衍生時EDAC與多糖質量比為0.2~ 0·6mg/mg〇4. 根據權利要求1所述要求，其特征在于:多糖衍生時ADH與多糖質量比為1~3mg/mg。5. 根據權利要求1所述要求，其特征在于:多糖衍生時的反應pH為pH 5.5~6.3。6. 根據權利要求1所述要求，其特征在于:多糖衍生物超濾時所用超濾膜包類型為10~ 30KD〇7. 根據權利要求1所述要求，其特征在于：結合時所用載體蛋白為白喉類毒素、破傷風 類毒素、白喉毒素無毒突變體CRM197及B型腦膜炎球菌外膜蛋白。8. 根據權利要求1所述要求，其特征在于：結合反應溶液中多糖與蛋白質量比為1~ 2mg/mg〇9. 根據權利要求1所述要求，其特征在于:結合反應溶液中EDAC終濃度為10~30mmol/ L010. 根據權利要求1所述要求，其特征在于:結合反應溶液的pH應為pH 5.5~6.3。11. 根據權利要求1所述要求，其特征在于:結合物超濾時超濾膜包類型為100KD。
【文檔編號】A61K39/095GK105879020SQ201610187232
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2016年3月30日
【發明人】張曉華, 孫述學, 周荔葆, 張景春, 馬宏初, 劉曉磊, 王振業
【申請人】北京成大天和生物科技有限公司