基于dc的hcv病毒表位疫苗及其制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物工程和生物醫藥領域，特別涉及利用臍帶間充質干細胞誘導轉化 為胰島細胞的方法。
【背景技術】
[0002] 丙型肝炎病毒（HCV)是引起慢性肝病的主要病原體之一，全世界約有HCV感染者 1. 7億-2. 0億，我國人群HCV感染率約3. 2 %，估計全國感染者在4000萬以上。HCV感染后， 約50 % -85 %轉為慢性肝炎，其中20 % -30 %發展為肝硬化，部分轉為肝細胞肝癌（HCC)，嚴 重危害人類健康，已成為全球性的、嚴峻的公共衛生問題。迄今為止，尚缺乏理想的抗病毒 治療措施，干擾素治療也不令人滿意。由于HCV病毒變異率高，以保護性抗體為主的預防性 HCV疫苗的研究步履維艱。因此，尋求抗HCV疫苗和有效抗病毒藥物一直是研究的熱點。
[0003] 現有技術中，HCV病毒疫苗的制備方法為：對HCVNS3區和HCVNS5區抗原蛋白的氨 基酸序列進行了分析，倆個多肽鏈的鏈的氨基酸序列分別為：HCVNS3:pvsylkgssg(10個氨 基酸殘基）HCVNS5: nmvyattsrs (10個氨基酸殘基），多肽純度為95 % -99. 99 %，采用Fmoc 固相法結合成線性多肽疫苗，經脫鹽及HPLC純化后得到抗原肽，溶于醫學蒸餾水制成疫苗 溶液。通過該方法制備的HCV病毒疫苗由于是多肽溶于水溶液制備而成的，因此，性狀不夠 穩定，免疫原性較弱，特異性不強，不能很好引起機體的免疫反應，殺傷HCV病毒；另外，由 于缺乏一些免疫輔助因子的表達，不能夠很好的調節HCV病毒的機體免疫機制，不能改善 HCV病毒引起的肝臟免疫耐受的現象。

【發明內容】

[0004] 本發明所要解決的技術問題是，針對現有技術中HCV病毒疫苗性狀不穩定、免疫 原性較弱、特異性不強等缺陷，提供一種性狀穩定，免疫原性及特異性強的基于DC的HCV病 毒表位疫苗。
[0005] 本發明解決其技術問題所采用的技術方案是：提供一種基于DC的HCV病毒表位疫 苗的制備方法，所述制備方法包括以下步驟：
[0006] 獲取未成熟DC ;
[0007] 加入HCV病毒抗原多肽與未成熟DC共培養；
[0008] 再加入腫瘤壞死因子-a和白介素或脂多糖繼續培養，至DC成熟且負載上HCV病 毒抗原多肽。
[0009] 在本發明提供的基于DC的HCV病毒表位疫苗的制備方法中，所述白介素為白介 素-1。
[0010] 在本發明提供的基于DC的HCV病毒表位疫苗的制備方法中，所述腫瘤壞死因 子-a的濃度為l-10ng/ml、白介素-1的濃度為5-15ng/ml、脂多糖的濃度為l-10ng/ml。 [0011] 在本發明提供的基于DC的HCV病毒表位疫苗的制備方法中，所述腫瘤壞死因 子-a的濃度為濃度為5ng/ml、白介素-1的濃度為8ng/ml。
[0012] 在本發明提供的基于DC的HCV病毒表位疫苗的制備方法中，所述腫瘤壞死因 子-a的濃度為濃度為lOng/ml、白介素-1的濃度為5ng/ml。
[0013] 在本發明提供的基于DC的HCV病毒表位疫苗的制備方法中，所述腫瘤壞死因 子- a的濃度為濃度為lng/ml、白介素-1的濃度為15ng/ml。
[0014] 在本發明提供的基于DC的HCV病毒表位疫苗的制備方法中，加入腫瘤壞死因 子-a和白介素或脂多糖后繼續培養未成熟DC和HCV病毒抗原多肽7-13天。
[0015] 在本發明提供的基于DC的HCV病毒表位疫苗的制備方法中，所述HCV病毒抗原多 肽由多肽鏈HCVNS3和HCVNS5合成。
[0016] 在本發明提供的基于DC的HCV病毒表位疫苗的制備方法中，所述HCV病毒抗原多 肽與未成熟DC在含有粒-巨噬細胞因子和白介素-4的培養基上進行共培養。
[0017] 在本發明提供的基于DC的HCV病毒表位疫苗的制備方法中，加入腫瘤壞死因 子-a和白介素或脂多糖后繼續培養未成熟DC和HCV病毒抗原多肽7-13天。
[0018] 本發明還提供一種基于DC的HCV病毒表位疫苗，由上述基于DC的HCV病毒表位 疫苗制備方法所獲得。
[0019] 實施本發明提供的基于DC的HCV病毒表位疫苗及其制備方法，可以達到以下有益 效果：通過本發明獲得的基于DC的HCV病毒表位疫苗不僅性狀較穩定，而且免疫原性及特 異性較強，能夠很好的調節HCV病毒的機體免疫機制，改善HCV病毒引起的肝臟免疫耐受的 現象。
【附圖說明】
[0020] 下面將結合附圖及實施例對本發明作進一步說明，附圖中：
[0021] 圖1為采用ELISA法檢測經疫苗刺激小鼠后小鼠機體血清中的白細胞介 素-12(IL-12)水平；
[0022] 圖2中從左至右分別為本發明實驗四中，腫瘤初始示意圖以及接種現有HCV病毒 疫苗后，每間隔2d所得到的腫瘤示意圖；
[0023] 圖3中從左至右分別為本發明實驗四中，腫瘤初始示意圖以及接種實施例1提供 的基于DC的HCV病毒表位疫苗后，每間隔2d所得到的腫瘤示意圖。
【具體實施方式】
[0024] 為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合附圖及實施例，對 本發明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅用以解釋本發明，并不 用于限定本發明。
[0025] 本發明提供的一種基于DC的HCV病毒表位疫苗，其制備方法包括以下步驟：
[0026] 1)將CD34+和/或CD14 +單核細胞誘導培養為未成熟DC ;
[0027] 2)待未成熟DC濃度小于或等于5 X IO5個/ml時，加入HCV病毒抗原多肽與未成 熟DC共培養；
[0028] 3)再加入腫瘤壞死因子-a和白介素或脂多糖繼續培養7-13天，至DC成熟且DC 負載上HCV病毒抗原多肽。
[0029] 在步驟1)中，本發明提供的將CD34+和/或CD14 +單核細胞誘導培養為未成熟DC 的方法為：將CD34+和/或CD14 +單核細胞接種到含粒-巨噬細胞和白介素-4的培養基中 并在37°C，CO2濃度為5%的條件下誘導6-9天后，即可獲得未成熟DC，未成熟DC的表型和 功能均不完善，不能誘導有效的免疫反應。當然可以理解的是，本發明獲得未成熟DC的途 徑也并不局限于此，通過現有技術中的誘導方法誘導單核細胞獲得的未成熟DC同樣適用 于本發明。
[0030] 其中，⑶34+單核細胞可以從骨髓、臍帶血或脾臟等分離得到；⑶14 +細胞從人外 周血分離得到的。由于從臍帶血中純化出CD34+單核細胞費用昂貴；骨髓采集不易，而且 容易污染，患者比較痛苦，擴增費用昂貴；而脾臟來源受限等使得CD34+單核細胞獲取較困 難；因此，在本發明中，優選采用從人外周新鮮血液中分離篩選出CD14 +單核細胞，從新鮮 血液中獲取，相比經過冷庫儲存或者培養傳代之后的CD14+單核細胞，從新鮮血液中提取的 CD14 +單核細胞離體時間不長，其細胞活性和狀態的減弱或者形態改變程度都較少，更加利 于獲取DC。
[0031]由于DC有簇狀生長的習慣，濃度太高，集結成團，位于中心的DC不易成熟，影響 HCV病毒抗原的負載，從而影響疫苗的免疫效果，因此，DC濃度不易過高，在該步驟中，未成 熟DC在培養基中的濃度小于或等于5 X IO5個/ml ;
[0032] 步驟2)中，HCV病毒抗原多肽由多肽鏈HCVNS3和HCVNS5通過Fmoc固相法結合而 成，具體合成步驟為現有技術，在此不再贅述。由于多肽純度與DC負載的抗原量成正比，因 此，多肽純度越高，DC負載的抗原量越高，在本發明中，優選地，多肽純度為95% -99. 99%; 多肽鏈的氨基酸序列為HCVNS3 :pvsylkgssg(10個氨基酸殘基）和HCVNS5 :nmvyattsrs(10 個氨基酸殘基）。
[0033] 由于未成熟DC表達能介導DC攝取抗原的一些膜受體如Fc受體等，因而相比成 熟DC擁有更強的抗原攝取、加工和處理能力，因此，步驟2)中利用未成熟DC與HCV病毒抗 原多肽共培養實現HCV病毒抗原多肽的預負載，促進提高HCV病毒抗原多肽負載量，同時， 未成熟DC經抗原致敏可至成熟。
[0034] 在步驟3)中，由于白介素和脂多糖功能均具有促進DC細胞成熟的功能，因此在該 步驟中采用其中一種即可。由于DC細胞成熟后會分泌白介素-1，因此，在該步驟中，優先 采用白介素-1來促進DC細胞的成熟，起到反饋誘導的作用。白介素-1由活化的巨噬細胞 所產生，機體免疫細胞受抗原刺激后產生；而腫瘤壞死因子-a由體內免疫細胞（如T淋 巴細胞、T細胞雜交瘤、T淋巴樣細胞系以NK細胞等）分泌的一種單核因子，由于白介素-1 和腫瘤壞死因子-a由不同細胞產生，因此，同時添加白介素-1和腫瘤壞死因子-a對未 成熟DC的刺激作用較強，能夠促進DC成熟的同時提高HCV病毒抗原多肽的負載率，并且能 夠穩定DC的抗原提呈性；優選地，腫瘤壞死因子-a的濃度為l-l〇ng/ml、白介素的濃度為 5-15ng/ml、脂多糖的濃度為l-10ng/ml。
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