一種基因工程亞單位混合疫苗及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于獸用疫苗研究領域，設及一種豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌基因工程亞 單位混合疫苗及其制備方法和應用，本發明尤其設及一種豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌ApxI A、Apx n A和OMTO基因工程亞單位混合疫苗及其制備方法和應用。
【背景技術】
[0002] 豬傳染性胸膜肺炎（Porcine contagious pleuropneumonia,PCP)是由豬傳染性 胸膜肺炎放線桿菌(ActinobaciIlus pieuropneumoniae，APP)導致的W肺出血、壞死和纖 維素性滲出為主要特征的高度接觸性傳染病。APP血清型具有15個血清型，每個國家流行的 血清型亦不相同。在我國，1987年，哈爾濱獸醫研究所首次發現臨床病例，通過分離病原并 對分離的病原進行血清型、血清學實驗等證明了PCP在我國的存在和流行。我國W血清型1、 3和7最多。自2000年W來，PCP在我國很多地方出現了流行。上海、浙江、廣東、湖北、湖南、河 南等地尤為嚴重，據報道，僅杭州郊區某豬場因該病就造成近3萬頭豬只死亡。
[0003] PCP給各國養豬業造成重大的經濟損失，由PCP引起的豬只死亡、生長速度的緩慢、 料肉比的降低及投入治療資金的增加，給養殖業帶來了嚴重的經濟損失。各種年齡、性別的 豬對APP均易感，6~10月齡的豬最易感，當PCP急性流行時感染發病率和死亡率在20% W 上，最急性流行時死亡率則達80% W上。臨床典型癥狀為:體溫41.5°C W上；病豬呼吸困難 呈犬坐姿勢，口鼻流出血樣滲出物;主要病理變化為氣管血色粘液;彌漫性出血性肺炎，纖 維素性胸膜炎。
[0004] APP能夠引起動物感染發病是由毒力因子決定所決定的。APP有很多毒力因子，研 究表明，APP分泌的外毒素(ApxI、ApxII、ApxIII)和外膜蛋白（OmpD)等不僅是APP重要的毒 力因子，同時也是重要的免疫原性因子。apxIA基因 、apx HA基因又是編碼毒素蛋白的前體。 D15/0mpD已被證實在外膜蛋白的合成和組裝過程中有重要作用。
[0005] 目前，疫苗接種是預防和治療PCP的一個非常重要的措施。本病的病原菌具有15個 血清型，毒力因子眾多，不同血清型間沒有或僅有微弱的交叉保護，因而研制高效具有交叉 保護力的疫苗是預防控制此病的難點和關鍵，一直受到人們的重視。各國研究的疫苗有很 多種:全菌滅活疫苗、基因缺失疫苗、菌影苗和亞單位疫苗等。目前，各國在臨床上防控PCP 使用的是傳統的APP全菌體滅活疫苗。由于滅活疫苗具有型特異性，缺少APP菌體培養過程 中向細胞外分泌的外毒素;滅活的過程中有些抗原成分可能被破壞或丟失。弱毒缺失疫苗 及曲OStS疫苗等可產生型交叉免疫性，可對不同血清型APP的攻擊提供一定的免疫保護力。 弱毒疫苗隨著毒力降低的同時，其免疫原性亦有所下降，有時會出現毒力返強的現象，很難 預測和掌控。曲OSts疫苗有時會出現裂解不完全的狀況。相對而言，沒有上述缺點的基因工 程亞單位疫苗則成為了研究的熱點。

【發明內容】

[0006] 為了克服現有技術的缺點與不足，本發明的目的在于提供一種豬傳染性胸膜肺炎 放線桿菌ApxIA、ApxnA和OMTO基因工程亞單位混合疫苗。本發明運用基因工程的方法大量 表達了巧巾重組蛋白rApxIAjApxIIA和rOMPD，重組表達APP的溶血外毒素外膜蛋白（OmpD) 作為組份的重組亞單位疫苗對PCP的預防和治療有較好的效果。
[0007] 本發明的另一目的在于提供上述豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌ApxIA、ApxnA和 OMro基因工程亞單位混合疫苗的制備方法。
[0008] 本發明的再一目的在于提供上述豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌ApxIA、Apx EA和 OMro基因工程亞單位混合疫苗的應用。
[0009] 本發明的目的通過下述技術方案實現：
[0010] -種豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌ApxIA、Apx EA和OMTO基因工程亞單位混合疫苗， 包括重組蛋白rApxIA、rApxIIA和rOMPD;
[0011] 所述的重組蛋白rApxIA、rApxIIA和rOMPD的質量比為（1~3): 1: (1~3);
[0012] 所述的重組蛋白rA陽IA、rApxIIA和rOMPD的質量比優選為1:1:1;
[0013] 所述的重組蛋白rApxIA的氨基酸序列如SEQ ID N0:4所示。
[0014] 所述的重組蛋白rApxIIA的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。
[001引所述的重組蛋白rOMPD的氨基酸序列如沈Q ID N0:6所示。
[0016] 所述的豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌49^4、49^114和011^基因工程亞單位混合疫 苗的制備方法，包括如下步驟：
[0017] (1)擴增豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌apxIA、apxIIA和OmpD基因，具有W下（a)、（b) 和(C)所示的核巧酸序列：
[001引 （a)SEQ ID N0:1所示的核巧酸序列(apxIA基因）；和 [0019] (b)SEQ ID N0:2所示的核巧酸序列（apxIIA基因）；和
[0020] (C)SEQ ID N0:3所示的核巧酸序列(OmpD基因）；
[0021] (2)構建含有步驟(1)所述的基因的表達載體，并分別轉入大腸桿菌；
[0022] (3)誘導表達得到目的蛋白；
[0023] (4)重組蛋白的純化和檢測；
[0024] (5)將重組蛋白進行混合，得到豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌ApxIA、Apx n A和OMPD 基因工程亞單位混合疫苗。
[0025] 擴增序列基因所需的引物序列為如下所示的核巧酸序列：
[0026] apxIA引物序列：
[0027] Fl上游引物 [002引 F2下游引物 [0029] apxIIA 引物序列：
[0030] F化游引物
[0031] F4上游引物
[0032] OmpD引物序列：
[0033] F5上游引物：
[0034] F6上游引物：
[0035] 上述引物序列中CGC或CCG為保護堿基,GGATCC為femHI酶切位點，CTCGAG為趾〇 I酶 切位點。
[0036] 得到的目的片段與載體pET-3^和PGEX-4T-1經雙酶切后連接，轉入大腸桿菌 (E.coli)BL21(DE3)，提取質粒經鑒定;挑取陽性菌落，經IPTG誘導表達得到目的蛋白；收集 誘導的菌體經超聲破碎后、純化并將沉淀(包涵體)儲存在8mol/L的尿素PBS緩沖液中。
[0037] 所述的純化后的重組蛋白rApxIAjApxIIA和rOMro的濃度分別為376、321和11化 g/mLo
[0038] 所述的豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌49^4、49^114和011^基因工程亞單位混合疫 苗在預防豬傳染性胸膜肺炎中的應用。
[0039] 本研究選取了 apxIA的包含了預測出來的不連續抗原優勢表位的756bp片段、apx EA的843bp和OmpD的2382bp進行研究，本發明所獲抗原免疫原性良好。
[0040] 本發明相對于現有技術，具有如下的優點及效果：
[0041] (1)利用本發明提供的基因和方法，可W得到較高的表達產物收獲率，并且重組蛋 白具有較好的抗原性。因此，利用W上重組蛋白作為抗原，可W建立APP免疫診斷方法和制 備有效的亞單位疫苗。
[0042] (2)本發明的混合疫苗較S種蛋白單獨免疫，rOMPD JApxIA的抗體水平均高于單 獨免疫時的抗體水平，rApxEA的抗體水平和混合疫苗抗體水平顯著高于對照組，說明重組 亞單位混合疫苗誘導的體液免疫反應，rApxIA和rOMro抗體在小鼠的交叉免疫保護中發揮 極其重要作用。W包涵體免疫小鼠時，rApxIAjApxIIA和rOMPDS種蛋白聯合免疫時較S種 蛋白單獨免疫時誘導更高的抗體水平。ApxIA對APP 1、5、9、10和11型都有保護作用，ApxE A 對除APP血清10型外的其他血清型均有保護作用，OMPD是外膜蛋白，對每種菌都有保護作 用。所W，本發明亞單位混合疫苗可W為攻克由于APP血清型較多而為養豬業帶來重大損失 運個難題指明了一個方向。
【附圖說明】
[0043] 圖1是目的基因PCR擴增產物的電泳圖；其中，圖IA是apxIA和apxIIA基因的擴增， 泳道M:DL 2000DNA Marker;泳道1~4:apxIA基因的擴增；泳道5~12:apxIIA基因的擴增； 泳道13:apxIA基因的陰性對照;泳道14:apxIIA基因的陰性對照；圖1B:OmpD基因的擴增，泳 道M:DL 10000DNA Marker;泳道1~8:0mpD基因的擴增;泳道9:陰性對照。
[0044] 圖2是目的基因和質粒的雙酶切鑒定圖；其中，圖2A:apxIA和apxEA基因的酶切回 收產物，泳道M: DL 1000DNA Marker;泳道1: apxIA基因的雙酶切回收產物;泳道2: apx n A基 因的雙酶切回收產物；圖2B: OmpD基因的雙酶切回收產物，泳道M:化10000DNA Marker;泳 道1: OmpD基因的雙酶切回收產物；圖2C:質粒酶切回收產物，泳道M: DL 100