表達信號肽替換的h5亞型禽流感ha蛋白的重組新城疫耐熱疫苗株及制備方法
【專利摘要】本發明公開了一種表達信號肽替換的H5亞型禽流感HA蛋白的重組新城疫耐熱疫苗株及制備方法，所述的耐熱疫苗株分類命名為rTS?tHA/H5，于2016年4月19日保藏于武漢大學中國典型培養物保藏中心，保藏號為CCTCC NO:V201628。該疫苗株在感染動物或細胞后，可高效表達H5亞型禽流感病毒截短HA蛋白，自帶的tPAs可增強截短HA蛋白的分泌表達及免疫原性。該毒株可用于制備雞新城疫、H5亞型禽流感二聯耐熱活疫苗。CCTCC NO: V209
【專利說明】
表達信號肽替換的H5亞型禽流感HA蛋白的重組新城疫耐熱疫 苗株及制備方法
技術領域
[0001] 本發明屬于分子生物學領域，具體涉及一種表達信號肽替換的H5亞型禽流感HA蛋 白的重組新城疫耐熱疫苗株及制備方法。
【背景技術】
[0002] H5亞型禽流感病毒可引發禽類的急性致死性傳染病一高致病性禽流感，其臨床表 現為高死亡率、產蛋下降，嚴重的呼吸道癥狀等。H5亞型禽流感還可感染人類，并引起發病。 預防接種滅活疫苗是我國當前防控H5亞型禽流感的主要手段。傳統的滅活疫苗制備比較簡 單，儲存運輸方便，免疫效果持久，在禽流感防控中發揮了重要作用。但滅活疫苗也有一些 不足之處，如需肌肉注射，費工費時，免疫成本高。滅活疫苗的使用在一定程度上增加了臨 床上區分野毒感染與疫苗免疫的難度，且存在散毒風險。因此，研發廉價、安全、高效的H5亞 型禽流感疫苗具有重要的現實意義。
[0003]
[0004] 隨著分子生物學技術的不斷進步，新型基因工程疫苗的研發不斷取得突破，其中 基于新城疫病毒載體的新型多聯活疫苗是研發熱點之一，許多病原的免疫原性基因已經在 新城疫載體內成功表達，并取得了較好的免疫保護效果，如傳染性法氏囊病毒的VP2蛋白、 H5亞型禽流感病毒的HA蛋白、狂犬病毒的G糖蛋白、嚴重急性呼吸綜合征病毒的CoV蛋白、人 類免疫缺陷病毒的Gag蛋白等。此類疫苗具有可誘導全身性免疫(體液免疫、細胞免疫和粘 膜免疫）、高雞胚生長特性、生產成本低廉、免疫方式簡便(飲水、氣霧、點眼/滴鼻等方式）、 安全(毒株間發生重組及毒力返強可能性極小)等優點。但現有的新城疫病毒載體疫苗均是 以非耐熱型新城疫病毒為骨架構建的。
[0005] 疫苗的免疫原性主要依靠抗原數量和抗原遞呈效率。理論上來說，定位于細胞質 的抗原能更有效地誘導免疫反應。組織型纖溶酶原激活因子信號序列(tPAs)是一個特異的 蛋白分選信號，它直接把表達的抗原分選至內質網。與tPAs融合后，日本乙型腦炎病毒和 牛病毒性腹瀉病病毒的包膜蛋白在轉染后的細胞中的表達水平顯著高于野生型蛋白，且主 要定位于細胞質和細胞膜上，可引發更強的體液免疫和細胞免疫。
[0006] 現有已經上市的H5禽流感、新城疫二聯疫苗均是將H5亞型禽流感病毒株和新城疫 病毒株滅活后制備而成的，其主要原因是由于H5亞型禽流感病毒具有一定的致病性，不能 用于制備活疫苗。此類疫苗的缺點是需肌肉注射，費工費時，免疫成本高。滅活疫苗的使用 在一定程度上增加了臨床上區分野毒感染與疫苗免疫的難度，且存在散毒風險。
[0007] 專利申請號為"CN200680000024.0"的文獻公開了表達禽流感病毒H5亞型HA蛋白 的重組新城疫病毒LaSota弱毒疫苗株。該疫苗株不具備顯著的耐熱特性，且使用的是HA蛋 白自身的信號肽。
[0008] 因此，如何提供一種具有耐熱、穩定性強、冷藏條件要求低的表達信號肽替換的H5 亞型禽流感HA蛋白的重組新城疫耐熱疫苗株及制備方法是本領域技術人員亟待解決的技 術問題。

【發明內容】

[0009]針對現有技術中的不足，本發明進行了深入研究，提供了一種表達信號肽替換的 H5亞型禽流感HA蛋白的重組新城疫耐熱疫苗株及制備方法。
[0010]本發明一方面涉及一種表達信號肽替換的H5亞型禽流感HA蛋白的重組新城疫耐 熱疫苗株，其特征在于所述的耐熱疫苗株分類命名為rTS-tHA/H5,于2016年4月19日保藏于 武漢大學中國典型培養物保藏中心，保藏號為CCTCC N0:V201628。
[0011] 本發明另一方面還涉及表達信號肽替換的H5亞型禽流感HA蛋白的重組新城疫耐 熱疫苗株的制備方法，其特征在于包括如下步驟：
[0012] 1.1 H5亞型禽流感病毒HA基因的PCR擴增
[0013] 將H5N1禽流感病毒A/chicken/Hubei/489/2004株在9-11日齡雞胚上進行增殖，接 種5天后收獲雞胚尿囊液;將收獲的尿囊液進行HA基因的RT-PCR擴增，擴增引物為:上游引 物S^AGAGAGGGCTCTGCTGTGTGCTGCTGCTGTGTGGAGCAGTCTTCGTTTCGCCCAGCGAAATCTCTTCAATTT GCATTGGTTACCATGC-3'，下游引物5' -ATCGGGGCACTCCGATTCTACCCGTAITITTTCTTAATTATTATTA TCCTCTCTTTTTTC-3';對PCR產物進行瓊脂糖凝膠回收純化后，測定DNA濃度，待進行克隆連 接；
[0014] 1.2新城疫病毒耐熱載體片段的PCR擴增
[0015] 以超長片段PCR的方法獲得新城疫病毒載體序列，擴增引物為：上游引物5Y-TCGGAGTGCCCCGATTGTGCCAAGATGGACTCATC-3'，下游引物5' -AGCAGAGCCCTCTCTTCATTGCATCCA TGGTGGCAAGCTTTCTACCCGTATTTTTTCTTAATCCTTAATA-3';擴增模板為新城疫病毒耐熱株質粒 PTS09-C，對PCR產物進行回收純化，測定其濃度，待克隆連接；
[0016] 1.3重組質粒pTS-tHA/H5的克隆連接
[0017]采用In-fusion克隆連接技術，將純化好的HA1基因片段和耐熱載體片段進行克隆 連接，連接產物轉化DH5a感受態細胞，轉化后的細胞在LB平皿上培養16小時后挑單菌落進 行液體培養，對菌液進行HA1基因的PCR鑒定，鑒定為陽性的菌液進行質粒提取；
[0018] 1.4重組病毒rTS-tHA/H5的拯救恢復
[0019]采用脂質體轉染法，將已構建的重組質粒pTS-tHA/H5與三個分別表達NP、P和L蛋 白的輔助質粒共轉染BHK-21細胞，轉染后72小時，反復凍融收獲細胞液，接種9-11日齡SPF 雞胚。接種后5天，收獲雞胚尿囊液，分離得到表達信號肽替換的H5亞型禽流感HA蛋白的重 組新城疫耐熱疫苗株。
[0020] 本發明還涉及上述表達信號肽替換的H5亞型禽流感HA蛋白的重組新城疫耐熱疫 苗株在制備重組病毒中的應用。
[0021] 本發明還涉及上述表達信號肽替換的H5亞型禽流感HA蛋白的重組新城疫耐熱疫 苗株在制備H5禽流感、新城疫二聯耐熱活疫苗疫苗中的應用。
[0022]本申請公開了一種表達信號肽替換的H5亞型禽流感HA蛋白的重組新城疫耐熱疫 苗株，該疫苗株具有顯著的耐熱特性，可極大降低對冷鏈系統的依賴，節省保存運輸成本和 提高疫苗熱穩定性。該毒株在感染動物或細胞后，可高效表達H5亞型禽流感病毒的HA1蛋 白，自帶的tPAs可增強HA1蛋白的分泌表達及免疫原性。該毒株可用于制備H5禽流感、新城 疫二聯耐熱活疫苗。
【附圖說明】
[0023]圖1為本發明表達信號肽替換的H5亞型禽流感病毒截短HA蛋白的重組耐熱新城疫 病毒全長質粒的構建示意圖。其中rTS09-C為親本株的基因組結構，rTS-tHA/H5為在rTS09-C基因組中插入了截短HA蛋白后的結構，詳細標注了插入序列的整體序列組成。
【具體實施方式】
[0024]下面結合實施例對本發明做進一步的說明，以下所述，僅是對本發明的較佳實施 例而已，并非對本發明做其他形式的限制，任何熟悉本專業的技術人員可能利用上述揭示 的技術內容加以變更為同等變化的等效實施例。凡是未脫離本發明方案內容，依據本發明 的技術實質對以下實施例所做的任何簡單修改或等同變化，均在本發明的保護范圍內。 [0025] 實施例1
[0026] 第一步、重組全長質粒pTS_tHA/H5的構建與鑒定 [0027] 1.1 H5亞型禽流感病毒HA基因的PCR擴增
[0028] 將H5N1禽流感病毒A/chicken/Hubei/489/2004株在9-11日齡雞胚上進行增殖，接 種5天后收獲雞胚尿囊液。將收獲的尿囊液進行HA基因的RT-PCR擴增，擴增引物為:上游引 物S^AGAGAGGGCTCTGCTGTGTGCTGCTGCTGTGTGGAGCAGTCTTCGTTTCGCCCAGCGAAATCTCTTCAATTT GCATTGGTTACCATGC-3'，下游引物5' -ATCGGGGCACTCCGATTCTACCCGTAITITTTCTTAATTATTATTA TCCTCTCTTTTTTCHy (下劃線部分為用于In-fusion克隆連接的互補序列）。瓊脂糖凝膠電泳 檢測目的條帶約l.lkb，與預期的llOlbp相符(刪除自身信號肽的HA1基因長度為987bp，分 別在HA1基因前端和后端引入了基因起始序列和基因終止序列，同時在HA1基因前端引入了 Kozak序列和tPAs序列）。對PCR產物進行瓊脂糖凝膠回收純化后，測定DNA濃度，待進行克隆 連接。
[0029] 1.2新城疫病毒耐熱載體片段的PCR擴增
[0030] 以超長片段PCR的方法獲得新城疫病毒載體序列，擴增引物為：上游引物5Y-TCGGAGTGCCCCGATTGTGCCAAGATGGACTCATC-3'，下游引物5' -AGCAGAGCCCTCTCTTCATTGCATCCA TGGTGGCAAGCTTTCTACCCGTATTTTTTCTTAATCCTTAATA-3'(下劃線部分為用于In-fusion克隆 連接的互補序列）。擴增模板為新城疫病毒耐熱株質粒PTS09-C。瓊脂糖凝膠電泳檢測目的 條帶約18kb，與預期的17.8kb大小相符。對PCR產物進行回收純化，測定其濃度，待克隆連 接。
[0031] 1.3重組質粒pTS-tHA/H5的克隆連接
[0032]按照圖1所示的方式，采用In-fusion克隆連接技術，將純化好的HA1基因片段和耐 熱載體片段進行克隆連接(連接序列為AGCGAAATCTCTTCA和TCGGAGTGCCCCGAT)。連接產物轉 化DH5a感受態細胞，轉化后的細胞在LB平皿上培養16小時后挑單菌落進行液體培養。對菌 液進行HA1基因的PCR鑒定。鑒定為陽性的菌液進行質粒提取，待酶切和測序鑒定。
[0033] 1.4重組質粒pTS-tHA/H5的酶切與測序鑒定
[0034]分別以BamHI和Mlul內切酶對全長重組質粒進行酶切鑒定，均得到了與預期相符 的酶切圖譜。將酶切鑒定正確的重組質粒pTS-tHA/H5送至測序公司進行序列測定，結果表 明H5亞型禽流感的HA1基因插入到了新城疫病毒耐熱載體的P和Μ基因之間，tPAs序列成功 替換了HA蛋白自身的信號肽序列，且所有序列與預期完全一致，重組質粒pTS-tHA/H5構建 成功。
[0035] 第二步、重組病毒rTS-tHA/H5拯救恢復與鑒定
[0036] 2 · 1重組病毒rTS-tHA/H5的拯救恢復
[0037]采用脂質體轉染法，將已構建的重組質粒pTS-tHA/H5與三個分別表達NP、P和L蛋 白的輔助質粒共轉染BHK-21細胞(已預感染表達T7RNA聚合酶的痘苗病毒）。轉染后72小時， 反復凍融收獲細胞液，接種9-11日齡SPF雞胚。接種后5天，收獲雞胚尿囊液，待進行新城疫 病毒檢測。
[0038] 2.2重組病毒的血凝效價和熒光定量PCR檢測
[0039] 以血凝試驗和熒光定量PCR的方法，對收獲雞胚尿囊液進行檢測，結果均為新城疫 陽性。初步表明重組病毒rTS-tHA/H5拯救成功。
[0040] 2.3重組病毒HA1基因的PCR擴增與測序
[0041 ] 應用H5亞型禽流感病毒HA1基因的特異性擴增引物，對重組病毒rTS-tHA/H5的HA1 基因進行RT-PCR擴增，對PCR擴增產物進行序列測定分析，得到llOlbp長的HA1基因序列 (SEQ ID No. 1)，從5'到3'端，依次包含了P基因的部分非編碼區序列(UTR)、P基因的基因終 止序列(GE)、中間序列（IG)、HA1基因的基因起始序列(GS)、Kozak序列、tPAs序列、HA1基因 序列(刪除了自身信號肽）、HA1基因的雙重終止密碼子、HA1基因的GE序列、IG序列、Μ基因的 GS序列和Μ基因的UTR序列。與預期序列100%-致。
[0042] 第三步、信號肽替換的Η5亞型禽流感病毒截短ΗΑ蛋白在重組病毒rTS-tHA/H5中的 表達驗證
[0043] 3.1間接免疫熒光法檢測信號肽替換的HA1蛋白的表達
[0044] 將重組病毒rTS-tHA/H5和rTS09-C(對照）分別以0.01M0I感染BHK-21細胞，24h后 進行間接免疫熒光檢測，一抗為NDV陽性雞血清或H5亞型禽流感陽性血清。檢測結果表明， 重組病毒rTS-tHA/H5感染的細胞內，使用NDV陽性雞血清或H5亞型禽流感陽性血清作為一 抗時均能檢測到綠色熒光，而rTS09-C株感染的細胞只在NDV陽性血清作用下檢測到熒光。 [0045] 3.2 Western Blot法檢測信號肽替換的HA蛋白的表達
[0046] 將重組病毒rTS-tHA/H5和rTS09-C(對照）分別以0.01M0I感染BHK-21細胞，24h后 收集細胞裂解液，以H5亞型禽流感陽性雞血清為一抗進行Western Blot檢測。檢測結果表 明，在40KDa附近出現一條明顯的目的條帶，與預期的40.6KDa大小相近。表明信號肽替換的 HA1蛋白在重組病毒感染的細胞內正確表達。
[0047] 第四步、重組病毒rTS_tHA/H5的生物學特性鑒定
[0048] 4.1重組病毒的增殖特性測定
[0049] 為比較重組病毒rTS-tHA/H5株與親本rTS09-C株的生長增殖情況，將兩株病毒分 別以100 TCID5Q接種BHK-21細胞，接種后2處、4811、7211、9611取上清50(^1，測定病毒1'(：1〇 50， 繪制病毒的生長曲線。結果表明，重組病毒rTS-tHA/H5株和親本rTS09-C株在BHK-21細胞的 生長曲線相似，增殖滴度相近，約為10 7· WciDso/ml。
[0050] 4.2重組病毒的致病性測定
[0051] 測定重組病毒對雞胚的最小致死劑量的平均致死時間（MDT/MLD)，結果顯示不同 稀釋度（ΠΓ1至10-9)的病毒接種雞胚后的120h內均不會對雞胚致死，重組病毒rTS-tHA/H5 的MDT/MLD大于120h，表明重組病毒保持了親本株的低毒特性，外源基因的插入并未改變重 組病毒的致病性。
[0052] 4.3重組病毒的耐熱特性測定
[0053] 測定重組病毒在56°C環境下的HA耐熱特性，同時設置非耐熱株LaSota株和耐熱株 rTS09-C株為對照。如表1所示，非耐熱株LaSota在56°C耐熱處理9min后，HA效價降為0,親本 株rTS09-C和重組病毒rTS-tHA/H5在56°C耐熱處理150min后仍具有血凝活性。表明重組病 毒rTS-tHA/H5的耐熱特性與親本株一致，均為耐熱株。（該病毒株已經保藏，保藏在武漢大 學中國典型培養物保藏中心，保藏號為CCTCC NO: V201628)。
[0054]表1.重組病毒的HA耐熱特性測定結果
[0055]
[0056] a表示病毒具有血凝活性，|3表示病毒沒有血凝活性
[0057]以上所述實施例只是本發明的較佳實例，而沒有限制本發明的實施范圍。因此，凡 是根據本
【發明內容】
的實質所作出的等效修改，都應屬于在本發明的保護范圍內。
【主權項】
1. 表達信號肽替換的H5亞型禽流感HA蛋白的重組新城疫耐熱疫苗株，其特征在于所述 的耐熱疫苗株分類命名為rTS-tHA/H5，于2016年4月19日保藏于武漢大學中國典型培養物 保藏中心，保藏號為CCTCC N0:V201628。2. 表達信號肽替換的H5亞型禽流感HA蛋白的重組新城疫耐熱疫苗株的制備方法，其特 征在于包括如下步驟： 1.1 H5亞型禽流感病毒HA基因的PCR擴增 將H5N1禽流感病毒A/chicken/Hubei/489/2004株在9-11日齡雞胚上進行增殖，接種5 天后收獲雞胚尿囊液;將收獲的尿囊液進行HA基因的RT-PCR擴增，擴增引物為：上游引物 S^AGAGAGGGCTCTGCTGTGTGCTGCTGCTGTGTGGAGCAGTCTTCGTTTCGCCCAGCGAAATCTCTTCAATTTGC ATTGGTTACCATGC-3'，下游引物5' -ATCGGGGCACTCCGATTCTACCCGTATTTTTTCTTAATTATTATTATC CTCTCTTTTTTC-3';對PCR產物進行瓊脂糖凝膠回收純化后，測定DNA濃度，待進行克隆連接； 1.2新城疫病毒耐熱載體片段的PCR擴增 以超長片段PCR的方法獲得新城疫病毒載體序列，擴增引物為：上游引物5'-TCGGAGTGCCCCGATTGTGCCAAGATGGACTCATC-3'，下游引物5' -AGCAGAGCCCTCTCTTCATTGCATCCA TGGTGGCAAGCTTTCTACCCGTATTTTTTCTTAATCCTTAATA-3';擴增模板為新城疫病毒耐熱株質粒 PTS09-C，對PCR產物進行回收純化，測定其濃度，待克隆連接； 1.3重組質粒pTS-tHA/H5的克隆連接 采用In-fusion克隆連接技術，將純化好的HA1基因片段和耐熱載體片段進行克隆連 接，連接序列為AGCGAAATCTCTTCA和TCGGAGTGCCCCGAT，連接產物轉化DH5a感受態細胞，轉化 后的細胞在LB平皿上培養16小時后挑單菌落進行液體培養，對菌液進行HA1基因的PCR鑒 定，鑒定為陽性的菌液進彳丁質粒提取； 1.4重組病毒rTS-tHA/H5的拯救恢復 采用脂質體轉染法，將已構建的重組質粒pTS-tHA/H5與三個分別表達NP、P和L蛋白的 輔助質粒共轉染BHK-21細胞，轉染后72小時，反復凍融收獲細胞液，接種9-11日齡SPF雞胚。 接種后5天，收獲雞胚尿囊液，分離得到表達信號肽替換的H5亞型禽流感HA蛋白的重組新城 疫耐熱疫苗株。3. 權利要求1所述的表達信號肽替換的H5亞型禽流感HA蛋白的重組新城疫耐熱疫苗株 在制備重組病毒中的應用。4. 權利要求1所述的表達信號肽替換的H5亞型禽流感HA蛋白的重組新城疫耐熱疫苗株 在制備H5禽流感、新城疫二聯耐熱活疫苗中的應用。
【文檔編號】A61K39/145GK106085970SQ201610426943
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月15日
【發明人】邵華斌, 溫國元, 羅青平, 潘茲書, 喬磊, 羅玲, 王紅琳, 張騰飛, 汪宏才, 張蓉蓉, 盧琴, 艾地云
【申請人】湖北省農業科學院畜牧獸醫研究所