布魯氏菌多表位融合蛋白疫苗的制備及應用
【專利摘要】本發明公開了布魯氏菌多表位融合蛋白抗原，是將布魯氏菌外膜蛋白BP26、OMP31、OMP16、OMP2b優勢抗原表位的氨基酸序列進行串聯，構建了融合蛋白基因，表達了蛋白，制備了布魯氏菌多表位融合蛋白抗原疫苗。小鼠攻毒實驗表明對布魯氏菌感染具有免疫保護性。
【專利說明】
布魯氏菌多表位融合蛋白疫苗的制備及應用
技術領域
[0001] 本發明涉及分子生物學技術和免疫學領域。具體涉及一種布魯氏菌多表位融合蛋 白抗原及其在制備布魯氏菌病苗方面的應用。
【背景技術】
[0002] 近年來，隨著經濟全球化的快速發展，新的傳染病不斷發生，一些舊的傳染病也開 始死灰復燃，尤其是對人類危害較為嚴重的布魯氏菌病，近幾年發病率呈逐年增加的趨勢， 給世界各國帶來巨大的公共衛生問題和經濟損失。
[0003] 布魯氏菌病是由布魯氏菌侵入機體引起的一種人獸共患傳染病。人群感染布魯氏 菌后可引起發熱、多汗、乏力、游走性關節痛等全身性癥狀，嚴重者出現肝脾及睪丸腫大，關 節變形，最終喪失勞動能力和生育能力;動物在感染布魯氏菌后，公畜會出現睪丸腫大，影 響繁殖和配種，母畜可能出現流產、早產，而且流產胎兒、胎衣、陰道分泌物等含有大量的細 菌，如果不及時消毒，還可能引起同群動物感染或者感染人類。布魯氏菌進入機體后主要在 細胞內寄生，并進行繁殖，因此，一般藥物很難發揮藥效，且復發率很高，目前沒有理想的治 療布魯氏菌病藥物，疫苗預防是防控該病的最為有效的手段。目前布魯氏菌疫苗種類較多， 主要包括弱毒活疫苗、滅活疫苗、突變株疫苗、DNA疫苗等 [1]。由于這些疫苗都存在著動物流 產、免疫效果不好等缺點，目前為止還沒有特別理想的布魯氏菌疫苗應用于布魯氏病的防 控。因此研制新型、有效疫苗是目前防控布魯氏病的研究熱點。
[0004] 基因工程亞單位疫苗和融合蛋白疫苗是布魯氏菌病疫苗研究的一個重要的方向， 其原理是用DNA重組技術，將編碼病原微生物特異性抗原表位的基因導入工程菌(受體菌） 或細胞，使其在受體細胞中高效表達出來，然后加入免疫佐劑后制成疫苗，其優點在于能夠 延長保護期限、不會出現減毒活疫苗轉變致病力而導致人或動物致病、防止動物出現流產、 穩定性好等。因此，本研究擬利用生物信息學技術預測布魯氏菌主要保護性抗原的B細胞、T 細胞優勢抗原表位，利用免疫學技術篩選理想的表位，再利用融合蛋白技術將優勢表位進 行串聯制備出具有自主創新性的、免疫原性好的新型疫苗，為布魯氏菌病的預防和控制提 供良好的手段。

【發明內容】

[0005] 本發明的目的是，提供一種布魯氏菌多表位融合蛋白抗原。
[0006] 布魯氏菌多表位融合蛋白抗原，它的氨基酸序如序列表SQ ID No. 1所示。
[0007] 布魯氏菌多表位融合蛋白抗原，它的堿基序如序列表SQ ID No.2所示。
[0008] 布魯氏菌多表位融合蛋白抗原疫苗，它是權利要求1所述的布魯氏菌多表位融合 蛋白抗原。
[0009] 本發明提供了布魯氏菌多表位融合蛋白抗原，是將布魯氏菌外膜蛋白BP26、 0MP31、0MP16、0MP2b優勢抗原表位的氨基酸序列進行串聯，構建了融合蛋白基因，表達了蛋 白，制備了布魯氏菌多表位融合蛋白抗原疫苗。小鼠攻毒實驗表明對布魯氏菌感染具有免 疫保護性。
【附圖說明】
[0010] 圖1布魯氏菌rMEP表達及定位(M:蛋白Marker; 1:誘導前;2:37°C誘導4h的上清； 3:37°C誘導4h的沉淀）； 圖2布魯氏菌rMEP鎳瓊脂糖親和層析SDS-PAGE結果(M:Protein marker; 1:上樣；2:流 出；3: 10mmol/L Imidazole洗脫組分；4:20 mmol/L Imidazole洗脫組分；5-8:50 mmol/L Imidazole洗脫組分；9:500 mmol/L Imidazole洗脫組分）； 圖3布魯氏菌rMEP陰離子交換層析SDS-PAGE結果(M:Protein marker; 1:上樣;2:流出； 3: 50 mmol/L NaCl洗脫組分;4-7:100 mmol/L NaCl洗脫組分;8-10:150 mmol/L NaCl洗 脫組分；11:200 mmol/L NaCl洗脫組分；12:300 mmol/L NaCl洗脫組分；13:1 mol/L NaCl 洗脫組分）； 圖4布魯菌rMEP表達SDS-PAGE鑒定結果(M為蛋白質Marker; 1為布魯菌多表位融合蛋 白）； 圖5布魯菌rMEP表達Western Blot鑒定結果(M為蛋白質Marker; 1為布魯菌多表位融 合蛋白）； 圖6三組小鼠血清中特異性抗體水平測定結果； 圖7三組小鼠血清中特異性抗體亞型測定結果； 圖8三組小鼠脾細胞培養上清液中細胞因子IFN- γ和IL-6測定； 圖9三組小鼠 CTL活性檢測結果； 圖10三組小鼠 Τ細胞亞型檢測結果。
【具體實施方式】
[0011]下面將結合附圖，對本發明的優選實施例進行詳細的描述。實施中未注明具體條 件的實驗方案，通常按照常規條件，或按照制造廠商所建議的條件進行。
[0012] 實施例1布魯氏菌多表位融合基因的設計及質粒的構建 從Pubmed數據庫中調取布魯氏菌優勢外膜蛋白的氨基酸序列，采用BepiPred (//www.cbs.dtu.dk/services/Bepipred/)， ABCpred (// www. imtech. res . in/ raghava/abcpred/)和COBEpro (// scratch. proteomics. ics. uci. edu/)等軟件對布魯氏菌外膜蛋白的B細胞表位進行預測，采用IEDB (// tools, iedb .org/main/tcell/)網站的T細胞表位預測工具對T細胞表位進行預測，采用BLASTP analysis對抗原表位進行相似性分析，選擇優勢抗原表位，在相鄰表位之間加入一段連接 肽序列，采用DNA Star對抗原表位的串聯順序和連接肽的種類進行優化，選擇免疫原性好 的序列作為目的融合蛋白疫苗的氨基酸序列，用于下一步布魯氏菌rMEP疫苗的表達及應用 研究。
[0013] 采用DNAStar對所設計的布魯氏菌rMEP疫苗的α螺旋、β折疊、柔性、親水性、抗原性 等免疫學參數進行預測，根據設計好的布魯氏菌rMEP疫苗的氨基酸序列進行密碼子優化 后，人工合成或PCR方法構建融合蛋白基因序列如SEP ID N0.2所示，將所構建的融合蛋白 基因連接于PET-28b載體的多克隆酶切位點處。
[0014] 上述步驟中的選取的優勢外膜蛋白為布魯氏菌8?26、01^31、01^16和01^213。
[0015]上述步驟中的抗原表位見表1。
[0016] 上述連接肽序列Linker的編碼"GGGS"。
[0017] 實施例2布魯氏菌rMEP的表達 表達宿主菌大腸桿菌BL2UDE3)菌種由吉林大學公共衛生學院衛生檢驗教研室保存； 含布魯氏菌rMEP疫苗堿基序列的表達載體pET-28b質粒由實施例1中所構建;各種分子生物 學試劑均購于生物試劑公司。
[0018] 將實施例1中獲得的pET-28b質粒轉化大腸桿菌BL2UDE3)表達菌，42°C熱擊90s， 冰上靜置2min后涂LA平板(含30yg/mL卡那霉素），37°C培養過夜。挑取表達菌株的單個菌落 于4mL LB培養基(含30yg/mL卡那霉素）中，37°C，220r/min培養18~24h。取0.4mL培養物加入 到4mL新鮮的LB培養基(含30yg/mL卡那霉素沖繼續培養，當菌液的OD600達到0.6左右時，添 加終濃度為0.5mmol/L的IPTG，37°C，220r/min誘導4h，同時設定未添加 IPTG誘導劑的作為 陰性對照。12000r/min離心10min，收集菌體。采用SDS-PAGE檢測布魯氏菌rMEP疫苗的表達 情況及定位，結果如附圖1所示。結果顯示宿主菌經誘導后在細菌沉淀與上清中均有目的融 合蛋白表達，且在菌體沉淀中表達量最高，說明所表達的布魯氏菌融合蛋白為包涵體蛋白。
[0019] 為了獲得可溶性的布魯氏菌rMEP，將收集的菌體用破碎緩沖液(0.05m〇VL Tris， 0.3 mol/LNaCl，0.1% Trition X-100，pH=8.0)重懸后，冰浴中超聲破碎菌體，超聲功率為 400W，20min(超聲2s，暫停6s)，超聲后，12000r/min，4°C離心20min，棄上清，沉淀用包涵體 溶解緩沖液（〇.〇〇8mol/L尿素，0.05mol/L Tris，0.3 mol/LNaCl，0.1%Triton X-100，pH= 8.0)溶解，冰浴中超聲破碎菌體，超聲功率為400W，20min(超聲2s，暫停6s)，12000r/min，4 °C離心20min，棄沉淀，上清中含有目的融合蛋白，進行下一步純化。
[0020] 實施例3布魯氏菌rMEP的純化 取上述實施例2超聲破碎后的上清液，所述細菌上清液中含有布魯氏菌可溶性rMEP，采 用鎳瓊脂糖親和層析和陰離子交換層析對上清液中的布魯氏菌可溶性rMEP進行純化，具體 純化液和純化方法按照相關試劑盒的說明書進行配制和操作，將收集的純化蛋白液的各洗 脫組分經SDS-PAGE檢測后，將高純度組分透析到roS緩沖液(含0. l%SKL，pH=7.4)中，4°C透 析過夜，0.4 5 μ m濾膜過濾除菌后分裝，置于-8 0 °C冰箱長期保存。采用S D S - P A G E電泳和 Western Blot檢測對純化后的融合蛋白進行檢測，結果如附圖4和附圖5所示，所表達的融 合蛋白分子量位于60kD左右，條帶清晰且沒有雜帶。經SK3071非干擾型蛋白濃度測定試劑 盒測定蛋白濃度，標準曲線方程為y=-〇. 0054x+0.9946，R2=0.9946，經計算，純化后的蛋白 濃度為 1.39mg/mL。
[0021] 實施例4布魯氏菌rMEP疫苗的制備及小鼠免疫 取上述實施例3純化的布魯氏菌rMEP，用無菌roS緩沖液調整蛋白濃度為600yg/mL，與 等體積的弗氏完全佐劑（或弗氏不完全佐劑）混合至完全乳化狀態，即為布魯氏菌rMEP疫 苗。取布魯氏菌疫苗株M5-90,調整菌濃度為2X10 9CFU/mL，與等體積的弗氏完全佐劑(或弗 氏不完全佐劑)混合至完全乳化狀態，即為對照疫苗。取無菌PBS，與等體積的弗氏完全佐劑 (或弗氏不完全佐劑)混合至完全乳化狀態，即為陰性疫苗。
[0022]取BALB/c小鼠30只，標記后適應性飼養一周，均無異常，將小鼠隨機分為三組，第 一組小鼠免疫布魯氏菌rMEP疫苗，第二組小鼠免疫對照疫苗，第三組小鼠免疫陰性疫苗，作 為空白對照組。小鼠免疫途徑為腹腔注射。初次免疫采用弗氏完全佐劑疫苗進行免疫，初次 免疫后15天、30天和45天采用免疫弗氏不完全佐劑疫苗加強免疫，免疫途徑均為腹腔注射， 劑量均為l〇〇yL/只，每次免疫前均采用尾靜脈采血的方式收集血清，-70°C保存備用。
[0023]實施例5布魯氏菌rMEP疫苗的免疫保護效果評價及應答分析 (1)小鼠血清中特異性抗體水平測定 采用間接ELISA法檢測免疫前后小鼠血清中特異性抗體水平的變化，具體操作步驟為： 用實施例3純化的布魯氏菌rMEP、布魯氏菌疫苗株M5-90分別包被酶標板，lOOyL/孔，4°C過 夜，PBST拍洗三次后，用1%BSA封閉37°C封閉2h，300yL/孔，加入1: 200開始倍比稀釋的血清 樣品，100μL7孔，37 °C孵育lh，TOST拍洗三次后，加入1:10000稀釋的HRP標記的羊抗鼠二抗， lOOyL/孔，37°C孵育lh，PBST拍洗三次后，加入TMB顯色液，lOOyL/孔，室溫避光反應15min， 加入2M H2S〇4,50yL/孔終止反應，酶標儀讀取0D450。結果如圖6所示，免疫布魯氏菌rMEP和 布魯氏菌疫苗株M5-90后，小鼠體內均能夠產生特異性抗體，而且免疫布魯氏菌rMEP的小鼠 體內出現特異性抗體的時間早于免疫布魯氏菌疫苗株M5-90的小鼠。
[0024] (2 )小鼠血清中特異性抗體亞型測定 米用抗體亞型測定試劑盒（Cat.5300-5; Southern Biotech, Birmingham, AL, USA) 檢測小鼠陽性血清中總IgG、IgM、IgG 1、IgG2a、IgG2b和IgG3的水平，具體操作步驟為：用實 施例3純化的布魯氏菌rMEP、布魯氏菌疫苗株M5-90和捕獲抗體包被酶標板，lOOyL/孔，4°C 過夜，PBST拍洗三次后，用1%BSA封閉37 °C封閉lh，300yL/孔，加入1:1000稀釋的小鼠血清樣 品，100μL7孔，37 °C孵育lh，PBST拍洗三次后，加入1:500稀釋的HRP標記的亞型抗體，lOOyL/ 孔，37 °C孵育lh，PBST拍洗三次后，加入ABTS顯色液，lOOyL/孔，室溫避光反應10~20 min，加 入2M H2S〇4，50μ!7孔終止反應，酶標儀讀取0D450。結果如圖7所示，免疫布魯氏菌rMEP疫苗 和疫苗株M5-90后，小鼠血清中的I gM、I gG 1、I gG2a、I gG2b和I gG3均較陰性對照組升高明 顯，而且免疫布魯氏菌rMEP小鼠血清中的I gG 1、I gG2a、I gG2b和I gG3水平明顯高于陰性對 照組和疫苗株M5-90組，說明所制備的布魯氏菌rMEP疫苗能夠引起刺激機體產生強烈的體 液免疫應答。
[0025] (3)小鼠脾淋巴細胞分離 最后一次免疫結束后兩周，頸椎脫白處死小鼠，體表消毒后無菌分離小鼠脾臟，將脾臟 置于鋼網上，加入適量1640培養基輕輕研磨脾臟，制備單細胞懸液，lOOOr/min離心5min后， 棄上清，加入10mL紅細胞裂解液，靜止5min，1000r/min離心5min，用1640培養基離心洗滌 細胞兩次，將細胞重懸于1640培養基中，得到小鼠脾淋巴細胞單細胞懸液。
[0026] (4)細胞因子IFN- γ和IL-6測定 取上述小鼠脾淋巴細胞單細胞懸液，用含10%胎牛血清的1640培養調整細胞濃度為2 X 106個/mL，加入到24孔板中，每孔2mL，37 °C，5%C02培養過夜，棄去培養液，每孔分別加入lmg/ mL融合蛋白、PBS或者2.5 mg/mL ConA，37°C，5%C02培養48h，收集上清，用于細胞因子的測 定。采用IFN-γ和IL-6細胞因子測定試劑盒(Peprotech，RockyHill，NJ，USA)測定脾細 胞培養上清液中IFN- γ和IL-6的水平，具體操作步驟為：用試劑盒中的捕獲抗體包被酶標 板，1〇〇μL7孔，4 °C過夜，PBST拍洗三次后，用1%BSA，300yL/孔，封閉室溫封閉，每孔分別加入 不同濃度的標準品或脾細胞培養上清液，l〇〇yL/孔，室溫孵育2h，PBST拍洗三次后，加入生 物素標記的檢測抗體，lOOyL/孔，室溫孵育2h，PBST拍洗三次后，加入親和素標記的HRP，1: 2000稀釋，lOOyL/孔，室溫孵育0.5h，PBST拍洗三次后，加入ABTS顯色液，lOOyL/孔，室溫避 光反應10~20 min，加入2Μ H2S〇4，50yL/孔終止反應，酶標儀讀取0D450。結果如圖8所示，免 疫布魯氏菌rMEP疫苗和疫苗株Μ5-90后，小鼠脾細胞培養上清液中產生的IFN- γ和IL-6水 平明顯升高，且免疫布魯氏菌rMEP疫苗小鼠脾細胞培養上清液中產生的IFN- γ和IL-6水 平明顯高于陰性對照組和疫苗株Μ5-90組，同樣說明所制備的布魯氏菌rMEP疫苗能夠引起 刺激機體產生強烈的體液免疫應答。
[0027] (5)CTL殺傷實驗 取上述步驟(3)小鼠脾淋巴細胞單細胞懸液，調整細胞濃度為3 X106個/mL加入到96孔 細胞培養板中，37°C，5%C02培養2h，貼壁細胞即為巨噬細胞，洗去未貼壁的細胞，加入10yg/ mL的融合蛋白，培養過夜，按照脾細胞:巨噬細胞=25:1加入脾細胞，同時設置僅有脾細胞和 僅有效應細胞的對照組，37°C，5%C0 2培養24h，每孔加入20yL MTT，37°C，5%C02培養4h，棄去 上清培養液，每孔加入150yL DMS0,酶標儀讀取0D492。結果如圖9所示，說明免疫布魯氏菌 rMEP疫苗和疫苗株M5-90的小鼠的CTL活性均顯著高于陰性對照組，說明所制備的布魯氏菌 rMEP疫苗能夠較好的誘導脾細胞的CTL活性。
[0028] (6)T細胞亞型測定 取上述步驟(3)小鼠脾淋巴細胞單細胞懸液，調整細胞濃度為IX 107個/mL，分別取100 yL加入到EP管中，1000r/min離心5min，棄上清，用含2%胎牛血清的PBS重懸細胞，加入FITC 標記的抗鼠⑶4抗體、PE標記的抗鼠⑶8抗體、APC-Cy 7標記的抗鼠⑶3抗體，避光，冰浴反應 15~20min，1000r/min離心5min，用含2%胎牛血清的roS洗滌細胞兩次，用350yL的含2%胎牛 血清的PBS重懸細胞，采用流式細胞儀進行檢測。結果如圖10所示，說明免疫布魯氏菌rMEP 疫苗小鼠的CD 3、CD4和CD8細胞比例均高于免疫布魯氏菌疫苗株M5 -9 0的小鼠和陰性對照 組，說明所制備的布魯氏菌rMEP疫苗比布魯氏菌疫苗株M5-90具有更好的免疫保護作用。
[0029] (7)小鼠攻毒實驗 最后一次免疫結束后30天進行小鼠攻毒實驗，每只小鼠腹腔注射5 X 105CFU 16M，攻毒結束后2周，處死小鼠，無菌取脾，用含有0.1% Triton X-100的roS研 磨脾臟，研磨液進行倍比稀釋后涂于TSA平板，37°C培養進行菌落計數。結果如表2所示，與 PBS相比，魯氏菌rMEP疫苗具有明顯的保護性，其免疫保護力高于我國現在常用的布魯氏菌 疫苗株M5-90。實驗結果顯示布魯氏菌rMEP疫苗對布魯氏菌感染具有免疫保護性。
免疫保護力a: PBS免疫組脾細胞中l〇g1QCFU的平均值減去實驗免疫組脾細胞中 logioCFU的平均值。
【主權項】
1. 一種布魯氏菌病特異性融合蛋白抗原，它的氨基酸序如序列表SQ ID No. 1所示。2. -種布魯氏菌病特異性融合蛋白抗原基因，它的堿基序如序列表SQ ID No.2所示。3. -種原核表達載體，它是在含有T7啟動子的原核融合蛋白表達載體中插入了如序 列表SQ ID No.2所不的基因。4. 根據權利要求3所述的一種原核表達載體，其特征在于:所述的原核表達載體為pET-28b 〇5. -種大腸桿菌工程菌，它是轉染了上述原核表達載體的大腸桿菌BL21 (DE3)。6. -種布魯氏菌病的檢測試劑盒，其特征在于它的診斷抗原為權利要求1所述的特異 性融合蛋白抗原，檢測試劑盒為人布魯氏菌病抗體ELISA試劑盒。
【文檔編號】C07K19/00GK105906717SQ201610277587
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年4月29日
【發明人】徐坤, 李娟 , 李麗, 殷德輝, 宋秀玲, 王娟, 劉玉申, 宋丹丹, 曲笑鋒, 鞠文, 趙超, 龐博, 孟祥君, 張惠雯, 翟玥, 暴昊
【申請人】吉林大學