短嘴矮小綜合癥小鵝瘟滅活疫苗的制備方法
【專利摘要】本發明公開了短嘴矮小綜合癥GPV分離株（SBGPV?M15株），保藏在CCTCC，保藏日期：2016年3月16日，保藏編號：CCTCC V201612，本發明還公開了SBGPV?M15株應用于短嘴矮小綜合癥小鵝瘟滅活疫苗的制備方法，該疫苗能有效預防和控制由短嘴矮小綜合癥小鵝瘟病毒引起半番鴨和櫻桃谷鴨的短嘴矮小綜合癥。CCTCC NO: V206
【專利說明】
短嘴矮小綜合癥小鵝瘟滅活疫苗的制備方法
技術領域
[0001 ]本發明涉及短嘴矮小綜合癥小鵝瘟滅活疫苗的制備方法。
【背景技術】
[0002] 2015年以來，我國半番鴨和櫻桃谷鴨流行一種以軟腳、短嘴和生長障礙為主要特 征的新發疫病（暫名"短嘴矮小綜合癥"，養殖戶稱之為"短嘴病"、"玻璃鴨"、"長舌鴨"等 等）。其中福建省漳州地區（含漳浦、龍海)的半番鴨最為嚴重，山東、安徽、江蘇、河南和浙江 等省的櫻桃谷鴨也出現不同程度流行。該病發病率1 〇%~1 〇〇%，死亡率低2%~10%，但僵鴨淘 汰率可高達80%，發病耐過鴨的出欄體重比健康鴨平均低2斤左右(按5元/斤計算，出欄鴨每 只凈減少10元收入，不包括淘汰鴨的損失），病因不明，缺乏有效的防控措施，給我國養殖業 造成很大的經濟損失。

【發明內容】

[0003] 本發明的目的是提供一種安全有效的短嘴矮小綜合癥小鵝瘟滅活疫苗制備方法， 以達到預防和控制因短嘴型（或短嘴矮小型）小鵝瘟病毒感染引起半番鴨和櫻桃谷鴨的短 嘴矮小綜合癥。福建省農業科學院畜牧獸醫研究所在國內外首先分離、鑒定了該病病原為 新型小鵝瘟病毒或小鵝瘟病毒變異株，鑒于該病以短喙和生長障礙為臨床特征，暫將該病 原命名為短嘴型(或短嘴矮小型)小鵝瘟病毒。
[0004] 本發明是通過如下技術方案來實現的： 分離自軟腳、短嘴和生長障礙的半番鴨肝脾組織的短嘴矮小綜合癥小鵝瘟病毒(SBDS-GPV M15株）[保藏在CCTCC，保藏日2016年3月16日，保藏編號:CCTCCNO: V201612]，在番鴨 胚成纖維細胞或番鴨胚尿囊腔中增殖，收取LPA效價達24的病毒液，經甲醛滅活后，按適當 比例與油佐劑混勻，制備成安全有效的短嘴矮小綜合癥小鵝瘟滅活疫苗。該疫苗能有效預 防和控制由短嘴型小鵝瘟病毒引起半番鴨和櫻桃谷鴨的短嘴矮小綜合癥。
【具體實施方式】
[0005] 以下結合具體實施例對本發明進一步說明（但不是對本發明的限制）。
[0006] 短嘴矮小綜合癥小鵝瘟病毒（SBDS-GPV M15株)能在11日齡番鴨胚尿囊腔和MDEF 細胞中穩定增殖傳代，并能致部分胚胎死亡和細胞病變，具有如下特性:SBGPV-M15株經尿 囊腔接種11日齡番鴨胚，胚液LPA效價達2 3以上；對番鴨胚成纖維細胞TCID5q 2 10-3· V 0.1 ml;該毒株保藏在中國武漢大學的中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，保藏日2016年3月 16日，保藏編號:CCTCC N0:V201612,分類命名：短嘴矮小綜合癥小鵝瘟病毒(SBDS-GPV M15 株)。
[0007] 本發明所述的上述短嘴矮小綜合癥小鵝瘟病毒(SBDS-GPV M15株）用于短嘴矮小 綜合癥小鵝瘟滅活疫苗的制備方法： (I)SBDS-GPV M15株的增殖:將SBDS-GPV M15株用滅菌Hanks液1:10稀釋后，經尿囊腔 途徑接種10~11日齡番鴨胚，o.lml/枚，37°C溫箱培養，每日觀察2次至第7天，棄去24h內的 死胚，收獲48h~168h的胚液，-20 °C凍存。
[0008] (2)病毒含量LPA效價測定:取滅活前胚液毒以本團隊制備的抗GPV單抗致敏膠乳 測定LPA效價，當胚液LPA 2 24時，可用于病毒的滅活。
[0009] (3)病毒滅活和濃縮:將LPA 2 24的胚液，加入終濃度為0.1%的甲醛，37°C24h滅活， 置于4 °C保存備用。
[0010] (4)滅活驗證:取滅活并濃縮后的胚液接種11日齡番鴨胚，O.lml/枚，37°C溫箱培 養，丟棄24h內死亡的番鴨胚，第2天至第7天，番鴨胚應全部存活且LPA為陰性。
[0011] (5)疫苗配制：按1:1.5的比例加入滅活胚液和油佐劑，攪拌均勻制成油包水型乳 劑疫苗。
[0012] (6)疫苗免疫學指標測定 6.1無菌檢驗:按現行《中華人民共和國獸藥典》附錄進行，均無菌生長。
[0013] 6.2安全檢驗：用2日齡無母源抗體櫻桃谷鴨各20羽，隨機分成2組，每組10羽。試 驗組每羽頸部皮下注射0.5ml疫苗;對照組每羽腿部肌肉注射0.5ml Hanks液；隔離飼養并 觀察20天，接種鴨采食、飲水等未見異常，全部存活，且體重和喙發育均正常。表明該滅活疫 苗對2日齡櫻桃谷鴨具有良好的安全性。
[0014] 6.3效力檢測 6.3.1疫苗免疫櫻桃谷鴨的攻毒保護力 取2d櫻桃谷鴨(抗體陰性)30羽，隨機分成3組，其中健康對照組和攻毒對照組各10羽， 不免疫；免疫攻毒組10羽，每羽腿肌注射滅活苗〇.2mL，并于免疫后7天連同攻毒對照組10 羽，口服感染SBGPV-Ml 5株0.3ml/羽，觀察28天，測定各組體重、喙長寬、發病率和死亡率。 [0015] 結果顯示(見表1):攻毒對照組(9日齡櫻桃谷鴨）口服感染后7天(PI7d)個別鴨拉 白色稀便、拱背羽毛蓬松，喜臥至軟腳，精神萎頓、食欲下降，PI20d后可觀察到短喙、長舌、 骨折鴨，至PI 28d的發病率為60%，死亡率為零;而健康對照組和免疫攻毒組鴨均未出現上 述癥狀，且體重、喙長等均明顯高于攻毒對照組。表明2d櫻桃谷鴨免疫后7天可有效抵抗短 嘴矮小綜合癥GPV強毒的攻擊。
[0016]表1、2d櫻桃谷鴨免疫后7天對強毒的保護結果
注:表中數據為攻毒后28d(即37日齡)的結果 6.3.2疫苗免疫抗體水平測定 取55d半番鴨(抗GPV LPAI抗體陰性)30羽，隨機分成2組，其中對照組10羽不免疫;免疫 組每羽腿肌注射滅活苗1.0 mL;分別于免疫前、免疫后(PI) 14d、2Id、28d、56d采血分離血清， 測定GPV LPAI抗體效價。
[0017] 結果顯示(見表2):對照組直至試驗結束血清抗體均為陰性;免疫組免疫后14天抗 SB GPV抗體全部陽轉，平均抗體達2.61og2,免疫后21天抗體逐漸升高至較高水平，直至免 疫后56天抗體仍處于高峰期。表明該滅活苗免疫半番鴨能誘導良好的抗體應答。
[0018] 表2、半番鴨滅活痔苗免痔后的LPAI抗體水平測宙結果
注:表中數據表示10羽鴨血清LPAI效價平均值(Log2負對數的平均數）。
【主權項】
1. 短嘴矮小綜合癥小鵝瘟病毒(SBDS-GPV M15株），該毒株保藏在中國武漢大學的中國 典型培養物保藏中心(CCTCC)，保藏日2016年3月16日，保藏編號:CCTCC V201612。2. 根據權利要求1所述的短嘴矮小綜合癥小鵝瘟病毒(SBDS-GPV M15株)用于短嘴矮小 綜合癥小鵝瘟滅活疫苗的制備方法： (1) SBDS-GPV M15株的增殖:將SBDS-GPV M15株用滅菌Hanks液1:10稀釋后，經尿囊腔 途徑接種10~11日齡番鴨胚，0.1ml/枚，37°C溫箱培養，每日觀察2次至第7天，棄去24h內的 死胚，收獲48h~168h的胚液，-20 °C凍存； (2) 病毒含量LPA效價測定：取滅活前胚液毒以本團隊制備的抗GPV單抗致敏膠乳測定 LPA效價，當胚液LPA 2 24時，可用于病毒的滅活； (3) 病毒滅活和濃縮:將LPA 2 24的胚液，加入終濃度為0.1%的甲醛，37°C24h滅活，置于4 °C保存備用； (4) 滅活驗證:取滅活并濃縮后的胚液接種11日齡番鴨胚，0.1ml/枚，37°C溫箱培養，丟 棄24h內死亡的番鴨胚，第2天至第7天，番鴨胚應全部存活且LPA為陰性； (5) 疫苗配制：按1:1.5的比例加入滅活胚液和油佐劑，攪拌均勻制成油包水型乳劑疫 苗。
【文檔編號】A61K39/23GK105861449SQ201610193595
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年3月31日
【發明人】陳少鶯, 陳仕龍, 程曉霞, 俞伏松, 林鋒強, 朱小麗, 王劭, 肖世峰, 吳南洋, 王錦祥
【申請人】福建省農業科學院畜牧獸醫研究所, 陳少鶯