專利名稱：一種制備熱穩定疫苗的方法
技術領域：
本發明涉及一種制備熱穩定疫苗的方法，特別涉及一種基于磷酸鈣礦化制備熱穩定疫苗的方法。
背景技術：
傳染性疾病對公共衛生安全造成嚴重的威脅，每年導致上百萬人的死亡。疫苗接種作為對抗傳染病最有效的醫療手段，挽救了無數人的生命。減毒活疫苗(即病毒的減毒毒株)是最為重要的一種疫苗形式，在天花和脊髄灰質炎的消滅過程中發揮了巨大作用。目前仍在臨床使用的減毒活疫苗包括脊髓灰質炎疫苗、水痘疫苗、流感疫苗、黃熱疫苗、麻疹疫苗、腮腺炎疫苗、風疹疫苗、流行性こ型腦炎疫苗、輪狀病毒疫苗、甲型肝炎疫苗以及腺病毒疫苗等。減毒活疫苗的活性成為(I)或(2)或(3)的病原體(I)將病原體經過化學處理后，使病原體的毒性減弱但抗原性基本保持；(2)將病原體進行基因改造，使病原體毒性減·弱但抗原性基本保持不變；(3)直接分離或篩選得到毒性低但抗原性良好的病原體毒株。通過基因改造或分離篩選的方法，世界上已有很多疫苗株，其中部分已經商業化。由于減毒活疫苗為典型的生物制品，具有溫度敏感性，因此運輸和保藏過程必須采用低溫環境(如冷凍)。據統計，由于儲藏或運輸不當，每年約有50%的疫苗被浪費。在缺乏廣泛可靠冷鏈基礎設施的發展中國家和不發達國家，疫苗的低溫保存仍然非常困難。疫苗的冷鏈花費占據了大部分財政支出，毎年超出2億美元。尤其在發展中國家，冷鏈花費占全國疫苗總財政支出的80%以上。因此，改善疫苗的熱穩定性，制備熱穩定的疫苗具有重大價值。現有的改善活疫苗穩定性的方法如下(I)在液體或干粉狀態的疫苗中添加穩定齊U，如重水、MgCl2和非還原性糖；(2)在疫苗的凍干技術中，采用糖玻璃化干燥、噴霧干燥等，以增強疫苗的穩定性；(3)借助蛋白質工程技術，通過增加亞單位之間的靜電作用力，衣売-核酸的相互作用或者引入ニ硫鍵的方式等來增加疫苗粒子的熱穩定性。當上述步驟都存在操作過程復雜以及保護效果有限的局限性。

發明內容
本發明的目的是提供一種制備熱穩定疫苗的方法，特別涉及ー種基于磷酸鈣礦化制備熱穩定疫苗的方法。本發明提供了一種制備磷酸鈣包被的病毒的方法，包括如下步驟(I)向病毒液加入具有Ca2+離子的化合物，即為初始體系；所述病毒液中具有PO,離子；(2)將所述初始體系進行孵育；(3)離心收集沉淀，即為磷酸鈣包被的病毒。步驟(I)的目的是使Ca2+充分在病毒顆粒(負電性)周圍富集，并自發礦化形成磷酸I丐礦物外殼。
所述病毒液的pH可為6. 0-9. 5。所述初始體系中，所述Ca2+離子濃度可為IOmM以上，優選為10_20mM，進ー步優選為 13-17mM，再進ー步優選為 13. 05839-16. 80839mM。所述初始體系中，所述P043_離子的濃度可為0. 5-1. 5mM，優選為0. 906mM。所述初始體系中，所述病毒的濃度可為109_10nPFU/L，優選為2X 101QPFU/L。所述初始體系中，病毒、Ca2+離子和有PO/—離子的配比可為IO9-IOiiPFU 10-20mmol,(優選為 13_17mmol，再進ー步優選為 13. 05839-16. 80839mmol) 0. 5-1. 5mmol(優選為 0. 906mmol)。所述孵育的時間可為2小時以上，優選為2-8小吋。所述孵育的溫度可為25_37°C，具體可為37°C。·所述步驟(2)中，在所述孵育后還包括加入磷酸鈣高親和性大分子(如聚丙烯酸)的步驟。所述磷酸I丐高親和性大分子在體系中的濃度可為lug/mL-100ug/mL,優選為IOug/mL。磷酸鈣高親和性大分子包被在磷酸鈣外殼外，可増加磷酸鈣外殼的穩定性，同時阻止包被磷酸鈣外殼的病毒顆粒進ー步聚集。所述離心的參數具體可為10000g-16000g、5-15min (如lOmin)。所述病毒液的制備方法包括如下步驟將病毒感染哺乳動物細胞(如BHK-21細胞)，采用低糖DMEM培養液進行細胞培養，得到病毒液。所述制備方法中，還包括如下步驟將所述細胞培養后的體系離心(具體離心參數可為16000g、10min)，收集上清液并過濾(具體可采用0. 22微米孔徑的濾膜)，收集濾液(即為病毒液)的步驟。所述具有Ca2+離子的化合物具體可為CaCl2。所述PO,離子具體來源于NaH2PO4。本發明還保護磷酸鈣包被的病毒。所述磷酸鈣包被的病毒可為采用以上任一所述方法制備得到的磷酸鈣包被的病毒。所述病毒可為こ型腦炎病毒。所述病毒為疫苗株的時候，所述磷酸鈣包被的病毒即為熱穩定的疫苗。所述病毒具體可為こ型腦炎病毒SA14-14-2韋株。本發明還保護ー種疫苗，它的活性成分為所述磷酸鈣包被的病毒；所述病毒為疫苗株。所述疫苗可為こ型腦炎病毒疫苗，所以病毒為こ型腦炎病毒的疫苗株。所述病毒具體可為こ型腦炎病毒SA14-14-2毒株。我國目前廣泛使用的流行性こ型腦炎減毒活病毒(SA14-14-2毒株)安全性和有效性俱佳，已出口印度、韓國、尼泊爾等國家。本發明以SA14-14-2毒株作為模型建立ー種能夠通過生物礦化的方法提高病毒熱穩定性的方法，該方法可以在病毒液中直接完成，簡單方便。因此，本發明在熱穩定性減毒活疫苗研發中具有良好的前景。本發明將SA14-14-2毒株表面進行了磷酸鈣修飾，在病毒顆粒表面形成具有保護作用的無機外殼(磷酸鈣薄層)。本發明提供的方法簡單、快速。表面進行磷酸鈣修飾的病毒作為疫苗的活性成分具有如下優點(結構原理示意圖見圖I):表面礦化提高了病毒沉降性，使得病毒能夠在常速離心條件下快速高效的富集；生物可逆的礦化相能在細胞內溶解并且釋放病毒顆粒，礦物相可輔助提高疫苗的熱穩定性，使疫苗在常溫的穩定性大大增強；該修飾沒有顯著改變病毒的生物學性質，不影響病毒本身的后續處理；其表面的磷酸鈣外殼能夠相應提高病毒的免疫原型，從而更好的實現其作為熱穩性疫苗的功能。本發明通過病毒表面的礦化修飾，能夠高效地解決疫苗運輸和保存中的熱失活現象，顯著降低減毒活疫苗的財政支出。本發明在新型熱穩定疫苗生產和制備中有廣泛的應用。


圖I為JEV-CaPi疫苗液與JEV疫苗液在熱處理下的變化示意圖。圖2為實施例2中原位斑點雜交實驗的結果；A :實施例I得到的JEV疫苗液；B JEV-CaPi疫苗液-甲-I離心得到的上清液；C JEV-CaPi疫苗液-甲-II ；D =JEV-CaPi疫苗液-こ-I離心得到的上清液；E JEV-CaPi疫苗液-こ-II ；F : JEV-CaPi疫苗液-丙-I離心得到的上清液；G JEV-CaPi疫苗液-丙-II ;H : JEV-CaPi疫苗液-丁 - I離心得到的上清液;I JEV-CaPi疫苗液-丁 - II。圖3為實施例2中離心實驗的結果和礦化效率的結果；A :離心實驗的結果；B :通過病毒RNA評價礦化效率的結果；C :通過空斑試驗檢測到的病毒滴度評價礦化效率的結
果。·圖4為實施例2中JEV-CaPi疫苗液-丙-II在透射電子顯微鏡下的照片；主照片為不經過負染的JEV-CaPi疫苗液-丙-II在透射電子顯微鏡下的照片，右上角為經過磷鎢酸負染后的JEV-CaPi疫苗液-丙-II照片。圖5為實施例2中JEV-CaPi疫苗液-丙-II的X射線能譜分析圖。 圖6為實施例2中JEV-CaPi疫苗液-丙-II的X射線粉末衍射儀檢測圖。圖7為實施例3中JEV-CaPi疫苗液的生物學特征實驗結果；A為空斑形態結果；B為ー步生長曲線結果；C為熒光顯微鏡下的觀察結果。圖8為實施例4中JEV-CaPi疫苗液在小鼠體內誘導體液免疫和細胞免疫的能力結果；A為IgG結果；B為中和抗體結果；C為刺激細胞廣生Y干擾素能力結果。圖9為實施例5中JEV-CaPi疫苗液在不同溫度下的穩定性實驗結果；A為26°C ；B為37°C ；C為42°C ;正方形標注的是JEV疫苗液，圓形標注的是JEV-CaPi疫苗液-丙-II。圖10為實施例6中熱處理后JEV-CaPi疫苗液在小鼠體內誘導體液免疫和細胞免疫的能力；A為IgG結果；B為中和抗體結果；C為刺激細胞產生、干擾素能力結果。圖11為實施例7中礦化反應時間對表面磷酸鈣修飾程度的影響。圖12為實施例8中JEV-CaPi疫苗液的制備和耐熱性能分析的結果；正方形標注的是JEV疫苗液，圓形標注的是JEV-CaPi疫苗液。
具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平均值。實施例中，均采用低糖DMEM培養液調節JEV疫苗液或JEV-CaPi疫苗液的病毒濃度(在實際應用中，也可采用PBS緩沖液調節疫苗液的濃度)。BHK-21細胞購自ATCC，產品目錄號為CCL-10 。こ型腦炎病毒SA14-14-2毒株(ー種こ型腦炎病毒減毒活疫苗株)購自中生集団成都生物制品研究所有限公司。聚丙烯酸(平均相對分子量為1800):購自sigma公司，貨號323667。低糖DMEM培養基干粉購自Iifetechnologies公司，貨號31600-034。堿性磷酸酶標記的羊抗鼠IgG :購自Jackson,貨號，515-055-003,名稱Alkal ine Phosphatase-conjugated AffiniPure SheepAnti-Mouse IgG(H+L)。BCIP/NBT (染液)購自 Sigma，貨號 B1911-100ML。BALB/c 雌性小鼠購自軍事醫學科學院實驗動物中心。低糖DMEM培養基干粉按說明書配制，得到低糖DMEM培養液；低糖DMEM培養液的溶劑為水，溶質及其濃度見表I。低糖DMEM培養液中的Ca2+離子(由D-泛酸鈣和CaCl2提供)濃度為I. 80839mM, PO廣離子(由NaH2PO4 H2O提供)濃度為0. 906mM。 表I低糖DMEM培養液的溶質及其濃度
權利要求
1.一種制備磷酸鈣包被的病毒的方法，包括如下步驟 (1)向病毒液加入具有Ca2+離子的化合物，即為初始體系；所述病毒液中具有PO廣離子; (2)將所述初始體系進行孵育； (3)離心收集沉淀，即為磷酸鈣包被的病毒。
2.如權利要求I所述的方法，其特征在于所述病毒液的pH為6.0-9. 5。
3.如權利要求I或2所述的方法，其特征在于所述初始體系中，所述Ca2+離子濃度為IOmM以上。
4.如權利要求I至3中任一所述的方法，其特征在于所述初始體系中，所述PO/—離子的濃度為0. 5-1. 5mM。
5.如權利要求I至4中任一所述的方法，其特征在于所述初始體系中，所述病毒的濃度為 109-10nPFU/L。
6.如權利要求I至5中任一所述的方法，其特征在于所述孵育的時間為2小時以上。
7.如權利要求I至6中任一所述的方法，其特征在于所述步驟(2)中，在所述孵育后還包括加入磷酸鈣高親和性大分子的步驟。
8.磷酸鈣包被的病毒。
9.如權利要求8所述的磷酸鈣包被的病毒，其特征在于所述磷酸鈣包被的病毒是采用權利要求I至7中任一所述方法制備得到的。
10.一種疫苗，它的活性成分為權利要求8或9所述的磷酸鈣包被的病毒；所述病毒為疫苗株。
全文摘要
本發明公開了一種制備熱穩定疫苗的方法，特別涉及一種基于磷酸鈣礦化制備熱穩定疫苗的方法。本發明提供了一種制備磷酸鈣包被的病毒的方法，包括如下步驟(1)向病毒液加入具有Ca2+離子的化合物，即為初始體系；所述病毒液中具有PO43-離子；(2)將所述初始體系進行孵育；(3)離心收集沉淀，即為磷酸鈣包被的病毒。本發明通過病毒表面的礦化修飾，能夠高效地解決疫苗運輸和保存中的熱失活現象，顯著降低減毒活疫苗的財政支出。本發明在新型熱穩定疫苗生產和制備中有廣泛的應用。
文檔編號A61P31/14GK102784390SQ201210282409
公開日2012年11月21日 申請日期2012年8月9日 優先權日2012年8月9日
發明者唐睿康, 王廣川, 秦成峰 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院微生物流行病研究所