一種基因工程重組蛋白、其制備方法及用圖
【技術領域】
[0001] 本發明涉及醫藥生物技術領域，具體涉及一種生長抑素重組嵌合蛋白、其制備方 法及在促進動物生長中的用途。
【背景技術】
[0002] 近年來食品行業面臨著嚴峻的食品安全問題，廋肉精案件即為其中的一個典型。 如何更有效、更安全地促進動物生長、提高飼料轉化率，是亟待我們解決的重要科學問題。 動物生理生化已經闡明，垂體生長激素(GH)的分泌受下丘腦生長激素釋放因子(GHRH和生 長抑素(SMS)的雙向調控，前者促進生長激素釋放，后者抑制生長激素釋放。已有實驗證明， 將生長抑素與載體蛋白進行化學偶連或制成基因疫苗，主動免疫動物可促進其生長。
[0003]生長抑素是由14個氨基酸殘基組成的小肽，免疫原性極弱，將其與具有較強免疫 佐劑活性的天然來源的蛋白或人工合成的表位構建融合蛋白，是增強其免疫原性的一條有 效途徑。大腸桿菌來源的不耐熱腸毒素(LT)由具有神經節苷脂(GM-1)親和力的B亞基和毒 性A亞基組成，通過對A亞基的點突變獲得的重組LTK63和LTR72，毒性減弱數百倍，具有較強 的黏膜佐劑功能。

【發明內容】

[0004]針對現有技術存在的問題，本發明提供一種生長抑素重組嵌合蛋白，其包含生長 抑素結構域及其片段和大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞基(LTB)及其片段，所述生長抑素結構 域及其片段和大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞基及其片段任選地使用接頭進行連接。
[0005]本發明提供一種編碼所述的生長抑素重組嵌合蛋白的氨基酸序列及其對應基因 的核苷酸序列。
[0006]本發明提供一種包含上述基因序列的重組表達載體及其對應的重組大腸桿菌基 因工程菌。
[0007]本發明提供一種生長抑素重組嵌合蛋白在促進動物生長中的用途。
[0008]本發明提供一種生長抑素重組嵌合蛋白用于制備促進動物生長的藥物組合物或 疫苗組合物的用途，所述藥物組合物或疫苗組合物用于免疫動物，使動物體內產生中和生 長抑素的抗體。
[0009]本發明提供一種生長抑素重組嵌合蛋白的制備方法，所述步驟包括構建含有生長 抑素結構域和大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞基基因的pET28a重組表達載體，及將所述表達載 體轉入E.co1iBL21 (DE3)菌中進行表達及后續的提取、分離、溶解、復性與純化。
【附圖說明】
[0010] 圖1是重組蛋白LTB-SMS_01與對照（Control)生長抑素（SMS)家兔免疫試驗抗體滴 度圖，其中LTB-SMS_01:大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位-生長抑素融合蛋白。
[0011]圖2是重組蛋白LTB-SMS_01家兔促生長試驗結果圖。
[0012] 圖3是重組蛋白LTB-SMS_01雞促生長試驗結果圖。
【具體實施方式】
[0013] 實施例1 LTB基因的克隆 ①取凍存的產腸毒素性大腸桿菌E.coliK88甘油菌接種至LB培養基，37°C振搖培養過 夜。次日，按試劑盒說明書，用細菌基因組DNA提取試劑盒從E.co1iK88培養液中提取并純化 基因組DNA，用超純水適當稀釋，用微量比色皿于260nm與280nm波長處測其吸光度，據此計 算DNA含量與純度(OD26〇/OD28q= 1.7_1.9)〇
[0014] ②按常規方法，將提取的產腸毒素性大腸桿菌基因組DNA(以下簡稱ETEC基因組 DNA)進行瓊脂糖(0.8%)凝膠電泳，電泳結束后用凝膠成像儀進行觀察。
[0015] ③PCR:根據核酸序列數據庫中大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞基(LTB)的基因序列設 計克隆該基因的PCR引物SEQIDN0: 3與SEQIDN0: 4。
[0016] 在0.2mLPCR管中加入ETEC基因組DNA、引物SEQIDNO: 3與SEQIDNO: 4、Pfu PCRMasterMix和雙蒸水，按如下條件：94°C3min-(94°C30s- 55°C30s- 72°C 60s)(30循環)-72°Clmin，以常規PCR方法克隆E.coliLTB基因。PCR反應結束后，1.5%瓊 脂糖凝膠電泳檢測PCR產物(大小在300-350bp之間）并用DNA膠回收試劑盒純化PCR產物。
[0017] 實施例2 pET28a/LTB重組質粒的構建 ①質粒pET28a的制備:取凍存的pET28a/DH5a甘油菌接種于含卡那霉素的LB液體培養 基中，37°C振搖培養過夜。次日，按試劑盒說明書，以質粒DNA小量提取試劑盒提取并純化質 粒pET28a，并按常規方法，用紫外分光光度法測定質粒pET28a的濃度與純度，同時用瓊脂糖 凝膠電泳進行鑒定。
[0018]②質粒pET28a的酶切：取一個干凈滅菌的1.5mLEp管，依次加入滅菌的雙蒸水、lOXBufferTango?緩沖液、pET28a(+)、核酸內切酶Ncol與EcoRI，總體積30仙，于37°C反 應3h。按試劑盒說明書，用DNA產物純化試劑盒純化pET28a酶切產物。
[0019] ③ETEC基因組DNAPCR產物（以下簡稱LTBPCR產物）的酶切：取一個干凈滅菌的 1.5mLEp管，依次加入LTBPCR產物、滅菌的雙蒸水、lOXBufferTangoTM緩沖液、核酸內 切酶Ncol與EcoRI，總體積30仙，于37°C反應3h。按試劑盒說明書，用DNA產物純化試劑盒純 化LTBPCR酶切產物。
[0020] ④載體和目的基因的連接：取一個干凈滅菌的1.5mLEp管，依次加入酶切后的 pET28a、LTBPCR產物、雙蒸水、連接緩沖液、T4DNA連接酶，總體積20UL，于20°C反應lh。置 于冰上，用于轉化實驗。
[0021 ] 實施例3 pET28a_LTB/DH5a基因工程重組菌的構建 ①E.coliDH5a感受態細胞的制備：按《分子克隆實驗指南》，以CaCl2法制備E.coli DH5a感受態細胞。
[0022]②轉化與篩選：將酶切后的pET28a_LTBPCR產物連接液用熱激法轉化E.coli DH5a感受態細胞。轉化完成后，加入400yLLB培養液，37°C緩慢振蕩培養60min。取100yL培 養液均勻涂布于LB/Kan瓊脂篩選平板上，37°C倒置培養過夜。
[0023]③重組菌的鑒定--菌落PCR法鑒定陽性克隆：用干凈無菌的牙簽挑取單菌落 至10yL的雙蒸水中，100°C水浴保溫5min，以裂解菌體；18°C，15，000rpm，離心5min;取5yL 上清液進行PCR檢測。
[0024]取1個干凈無菌的0.2mL的薄壁PCR管置于冰上，依次加入DNA模板、引物LTB-F和LTB_R、2XPfuPCRMasterMix、滅菌的雙蒸水，總體積20μΙ^4°〇，4,00〇Γρηι短暫離心 lmin，使溶液集中在管底。將PCR管置于PCR儀中，按如下條件:94°C3min-(94°C30s- 55°C30s- 72°C2min)(30循環）-72°ClOmin，進行PCR反應。反應結束后利用1.5%瓊 脂糖凝膠電泳，檢測菌落PCR產物，篩選出陽性克隆菌。經菌落PCR鑒定后的重組子，送往生 工生物工程(上海)股份有限公司進行DNA測序。
[0025] 實施例4 生長抑素基因（SMS_01)的PCR克隆 ①設計包含酶切位點EcoRI和Xhol的生長抑素基因引物SEQIDNO: 5與SEQIDNO: 6。委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成該基因引物，將合成的SMS_01的上游引物和 下游引物加入PCR退火緩沖液中，95°C變性2分鐘，隨后緩慢退火至室溫。退火產物置于4°C 備用，利用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測退火產物。
[0026] 實施例5 重組質粒pET28a-LTB-SMS_01的構建 ①重組質粒pET28a-LTB的制備：取凍存的pET28a-LTB/E·coliDH5α甘油菌接種于含 卡那霉素的LB液體培養基中，37°C振搖培養過夜。次日，按試劑盒說明書，以質粒DNA小量提 取試劑盒提取并純化重組質粒pET28a-LTB，并按常規方法，用紫外分光光度法測定重組質 粒的濃度與純度，同時用瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定。
[0027]②重組質粒pET28a_LTB的酶切:取一個干凈滅菌的1.5mLEp管，依次加入滅菌的 雙蒸水、lOXFastDigest?緩沖液、重組質粒pET28a-LTB、核酸內切酶EcoRI與Xhol，總體 積30HL，于37°C反應3h。按試劑盒說明書，用普通DNA產物純化試劑盒純化重組質粒pET28a-LTB的酶切產物。
[0028]③載體和目的基因的連接:取一個干凈滅菌的1.5mLEp管，依次加入酶切后的重 組質粒pET28a-LTB、酶切后的生長抑素基因SMS_01的PCR產物、雙蒸水、連接緩沖液、T4DNA 連接酶，總體積2〇tiL，于20°C反應lh。置于冰上，用于轉化實驗。
[0029] 實施例6 pET28a-LTB-SMS_01 /E.co1iDH5a基因工程重組菌的構建 ①E.coliDH5a感受態細胞的制備：按《分子克隆實驗指南》，以CaCl2法制備E.coli DH5a感受態細胞。
[0030]②轉化與篩選:將酶切后的載體pET28a-LTB和酶切后的生長抑素基因SMS_01的 PCR產物連接液用熱激法轉化E.coliDH5a感受態細胞。轉化完成后，加入400yLL