Cd19靶向性的嵌合抗原受體和nkt細胞及其制法和應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于用于腫瘤治療的生物制品領域，具體地，涉及CD19靶向性的嵌合抗原 受體和NKT細胞及其制法和應用。更具體地，涉及過繼免疫治療中的嵌合抗原受體 CD19ScFv-CD8-CD137-CD3G及其基因和重組表達載體、工程化CD19靶向性的NKT細胞 (CAR19-NKT細胞)及其應用。
【背景技術】
[0002]自然殺傷細胞(NKT)是一種特殊類型的T淋巴細胞亞群，具有T細胞和NK細胞細胞 兩重性質。NKT細胞能表達T細胞的TCR與NK細胞的NKR-P1兩種受體，在TCR和NKR介導下，NKT 細胞能夠產生大量的IL-4及INFy。。
[0003]通常情況下，輸注的NKT細胞在患者體內半衰期為2周左右，有效期短暫，需要反復 多次輸注。另外，NKT細胞本身缺少特異性抗體，不足以在腫瘤周圍或者瘤巢中富集，制約了 NKT細胞對惡性腫瘤的靶向治療。
[0004] CD19分子是B淋巴細胞表面發揮特異性信號轉導的受體，存在于B細胞成熟的各個 階段，在B祖細胞階段出現并穩定持續地表達。CD19作為B細胞系特異的細胞表面分化抗原， 僅表達于前B細胞和成熟B細胞表面，而在造血干細胞、漿細胞和其他正常組織細胞中不表 達。而且，CD19分子在膜上比較暴露，容易接近，與單克隆抗體結合后無顯著內化及脫落，也 不會因為與抗體的結合而發生抗原調變。此外，近期關于癌基因MYC基因如何推動B淋巴細 胞惡性腫瘤的發生與發展的研究，發現CD19對穩定Myc蛋白來說是絕對必要的，當Myc基因 是穩定的，并處于較高水平時，Myc基因會促使癌癥發展，并且，Myc蛋白水平高的患者更可 能死于淋巴瘤。⑶19可能是控制Myc基因通路上的開關，而控制通斷開關可能代表了治療淋 巴細胞腫瘤的有力工具。基于以上現象，故CD19成為治療CD19陽性的急性B淋巴細胞白血病 的一個重要靶點。

【發明內容】

[0005]本發明的目的是為了克服現有技術中NKT細胞對腫瘤的殺傷作用比較弱、特異殺 傷活性有待提高的缺陷，提供一種嵌合抗原受體CD19ScFv-CD8-CD137-CD3G及其基因和重 組表達載體、工程化⑶19靶向性的NKT細胞(CAR19-NKT細胞)及其應用。
[0006] 本發明的第一方面，提供了一種嵌合抗原受體(CAR)，所述嵌合抗原受體以CD8的 絞鏈區和跨膜區及CD137和CD3G的胞內信號結構域串聯而成的結構為信號傳導結構域。
[0007] 在另一優選例中，所述嵌合抗原受體為CD19ScFv-CD8-CD137-CD3G，由CD19ScFv、 CD8的鉸鏈區和跨膜區、CD137的胞內信號結構域和CD3G的胞內信號結構域串聯構成。
[0008]在另一優選例中，所述嵌合抗原受體的胞外結合區為抗CD19的單鏈抗體。
[0009]在另一優選例中，所述嵌合抗原受體的氨基酸序列如SEQIDNO. 1所示。
[0010]在另一優選例中，所述CD8的鉸鏈區和跨膜區選自下組：
[0011] (A)具有SEQIDN0:17所示氨基酸序列的多肽；
[0012] (B)具有與SEQIDNO: 17所示氨基酸序列2 80%同源性（優選地，2 90%的同源 性;等優選地2 95%的同源性;最優選地，2 97%的同源性）的多肽；（C)將SEQIDNO: 17中 任一所示氨基酸序列經過1-5個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的衍生多肽。
[0013]在另一優選例中，所述⑶137的胞內信號結構域選自下組：
[0014] (A)具有SEQIDN0:18所示氨基酸序列的多肽；
[0015] (B)具有與SEQIDN0:18所示氨基酸序列2 80%同源性（優選地，2 90%的同源 性;優選地2 95%的同源性;最優選地，2 97%的同源性），并且能夠轉導效應子功能信號的 多肽；
[0016] (C)將SEQIDN0:18中任一所示氨基酸序列經過1-5個氨基酸殘基的取代、缺失或 添加而形成的衍生多肽。
[0017]在另一優選例中，所述〇)3ζ的胞內信號結構域選自下組：
[0018] (Α)具有SEQIDΝ0:19所示氨基酸序列的多肽；
[0019] (B)具有與SEQIDN0:19所示氨基酸序列2 80%同源性（優選地，2 90%的同源 性;等優選地2 95 %的同源性;最優選地，2 97 %的同源性），并且能夠轉導效應子功能信號 的多肽；
[0020] (C)將SEQIDN0:19中任一所示氨基酸序列經過1-5個氨基酸殘基的取代、缺失或 添加而形成的衍生多肽。
[0021]在另一優選例中，所述CAR包括SEQIDN0:9所示的氨基酸序列。
[0022] 在另一優選例中，所述嵌合抗原受體(CAR)還包括抗原結合結構域。
[0023]在另一優選例中，所述抗原結合結構域為抗體或其抗原結合片段。
[0024] 在另一優選例中，所述抗原結合片段為Fab或scFv。
[0025]在另一優選例中，所述抗原包括腫瘤抗原。
[0026] 在另一優選例中，所述腫瘤抗原與血液惡性腫瘤相關。
[0027]在另一優選例中，所述腫瘤抗原與實體瘤相關。
[0028] 在另一優選例中，所述腫瘤抗原選自下組:⑶19、⑶20、⑶30、Herl。
[0029]在另一優選例中，所述嵌合抗原受體(CAR)為分離的。
[0030]在另一優選例中，所述嵌合抗原受體(CAR)的氨基酸序列如SEQIDN0.:1所示。
[0031] 本發明的第二方面，提供了一種核酸分子，所述核酸分子編碼本發明第一方面所 述的嵌合抗原受體(CAR)。
[0032] 在另一優選例中，所述核酸分子包含選自下組的編碼所述CD8的鉸鏈區和跨膜區 的核酸序列：
[0033] (a)編碼如SEQIDN0. : 17所示多肽的多核苷酸；
[0034] (b)序列如SEQIDΝ0·:3所示的多核苷酸；
[0035] (c)核苷酸序列與SEQIDΝ0. : 3所示序列的同源性2 90% (較佳地2 95%)，并且 編碼SEQIDN0.: 17所示氨基酸序列的多核苷酸；
[0036] (d)與(a)-(c)任一所述的多核苷酸互補的多核苷酸。
[0037]在另一優選例中，所述核酸分子包含選自下組的編碼所述CD137的胞內信號結構 域的核酸序列：
[0038] (a)編碼如SEQIDN0. : 18所示多肽的多核苷酸；
[0039] (b)序列如SEQIDNO. :4所示的多核苷酸；
[0040] (c)核苷酸序列與SEQIDNO. :4所示序列的同源性2 90% (較佳地2 95%)，并且 編碼SEQIDN0.: 18所示氨基酸序列的多核苷酸；
[0041] (d)與(a)-(c)任一所述的多核苷酸互補的多核苷酸。
[0042]在另一優選例中，所述核酸分子包含選自下組的編碼所述CD3G的胞內信號結構域 的核酸序列：
[0043] (a)編碼如SEQIDN0. : 19所示多肽的多核苷酸；
[0044] (b)序列如SEQIDΝ0·:5所示的多核苷酸；
[0045] (c)核苷酸序列與SEQIDΝ0. : 5所示序列的同源性2 90% (較佳地2 95%)，并且 編碼SEQIDN0.: 19所示氨基酸序列的多核苷酸；
[0046] (d)與(a)-(c)任一所述的多核苷酸互補的多核苷酸。
[0047]在另一優選例中，所述核酸分子包含選自下組的核酸序列：
[0048] (a)編碼如SEQIDN0. :9所示多肽的多核苷酸；
[0049] (b)序列如SEQIDN0·: 10所示的多核苷酸；
[0050] (c)核苷酸序列與SEQIDN0. : 10所示序列的同源性2 95% (較佳地2 98%)，并且 編碼SEQIDN0. :9所示氨基酸序列的多核苷酸；
[0051] (d)與(a)-(c)任一所述的多核苷酸互補的多核苷酸。
[0052]在另一優選例中，所述核酸分子為分離的。
[0053]在另一優選例中，所述核酸分子還包括編碼前導序列（信號肽）的多核苷酸，所述 前導序列的氨基酸序列如SEQIDN0. :21所示：
[0054] 在另一優選例中，所述核酸分子的序列如SEQIDN0.:2所示。
[0055]本發明的第三方面，提供了一種載體，所述的載體含有本發明第一方面所述的核 酸分子。
[0056]在另一優選例中，所述載體為慢病毒載體。
[0057]本發明的第四方面，提供了一種宿主細胞，所述的宿主細胞中含有本發明第三方 面所述的所述的載體或染色體中整合有外源的本發明第二方面所述的核酸分子。
[0058]在另一優選例中，所述細胞為分離的細胞，和/或所述細胞為基因工程化的細胞。
[0059]在另一優選例中，所述細胞為哺乳動物細胞。
[0060]在另一優選例中，所述細胞為NKT細胞、或T細胞。
[0061]在另一優選例中，所述T細胞為NKT細胞。
[0062]本發明的第五方面，提供了一種藥物組合物，所述組合物含有藥學上可接受的載 體以及本發明第一方面所述的嵌合抗原受體、本發明第二方面所述的核酸分子、本發明第 三方面所述的載體、或本發明第四方面所述的細胞。
[0063]本發明的第六方面，提供了本發明第一方面所述的嵌合抗原受體、本發明第二方 面所述的核酸分子、本發明第三方面所述的載體、或本發明第四方面所述的細胞的用途，用 于制備治療腫瘤的藥物或制劑。
[0064]在另一優選例中，所述的腫瘤包括白血病。
[0065]在另一優選例中，所述白血病是指進展期CD19陽性的急性B淋巴細胞白血病。
[0066]本發明的第七方面，提供了一種治療疾病的方法，包括給需要治療的對象施用適 量的本發明第一方面所述的嵌合抗原受體、本發明第二方面所述的核酸分子、本發明第三 方面所述的載體、或本發明第四方面所述的細胞、或本發明第五方面所述的藥物組合物。
[0067] 在另一優選例中，所述疾病為腫瘤。
[0068]本發明的第八方面，提供了一種嵌合抗原受體，所述嵌合抗原受體以CD8的hinge 區和跨膜區及CD137和CD3G的胞內信號結構域串聯而成的結構為信號傳導結構域，所述信 號傳導結構域氨基酸序列如SEQIDN0:9所示。
[0069] 本發明的第九方面，提供了一種NKT細胞群，所述NKT細胞群中：
[0070] CD3+CD8+NKT細胞/CD3+CD4+NKT細胞的比率為10/1~4/1(優選為9/1~6/1);并且 CD3+CD56+NKT細胞/CD3+CD8+NKT細胞的比率為1/18~10/18(優選為5/18~10/18,如可以為 1/8、1/6、1/4、1/3)〇
[0071] 在另一優選例中，所述NKT細胞群中：
[0072] 〇)3+細胞比率2 95%;〇)3+〇)8+細胞比率2 90.99%;〇)3+〇)56+細胞比率2 15%(優 選地，2 18%;更優選地 2 20%;最優選地 2 22%，如 2 24%、2 26%、2 28%、2 30%) ;CD8+ CD56+細胞比率2 15% (優選地，2 18% ;更優選地2 20% ;最優選地2 22%，如2 24%、2 26%、> 28%、> 30%)。
[0073]在另一優選例中，所述NKT細胞為表達嵌合抗原受體的NKT細胞。
[0074]在另一優選例中，所述NKT細胞為本發明第四方面所述的細胞。
[0075]本發明的第十方面，提供了一種制備本發明第九方面所述的NKT細胞群的方法，其 特征在于，所述方法包括步驟：
[0076] (a)將單個核細胞(PBMCs)培養于NKT細胞培養基中，所述NKT細胞培養基含有抗 CD3單克隆抗體、白介素-2、和白介素-15,進行第一階段培養。
[0077]在另一優選例中，通過所述第一階段培養，從而分離單個核細胞中原始的NKT細胞 并刺激其增殖。
[0078]在另一優選例中，所述第一階段培養所用的細胞培養容器是經RetroNectin包被 的。
[0079] 在另一優選例中，所述抗CD3單克隆抗體的濃度為20ng/ml-80ng/ml(優選為30ng/ ml-70ng/ml，更優選為40ng/ml-60ng/ml，最優選為約50ng/ml);和/或 [0080] 所述白介素-2的濃度為200U/mL-800U/mL(優選為300U/mL-700U/mL，更優選為 400U/mL-600U/mL，最優選為約500U/mL);和/或
[0081 ] 所述白介素-15的濃度為20ng/mL-80ng/mL(優選為30ng/mL-70ng/mL，更優選為 40ng/mL-60ng/mL，最優選為約 50ng/mL)。
[0082]在另一優選例中，所述第一階段的培養時間為2天-6天;優選為3天-5天;更優選為 4天。
[0083]在另一優選例中，所述NKT細胞培養基為GT-T551培養基。
[0084]在另一優選例中，所述NKT細胞培養基中還包含血清;優選地所述血清為自體血清 或胎牛血清;更優地所述血清為自體血清。
[0085] 在另一優選例中，所述血清含量為0.4% (v/v)_0.8% (v/v);優選為0.6% (v/v)。
[0086] 在另一優選例中，所述單個核細胞(PBMCs)來源于哺乳動物，更優選地來源于人。
[0087]在另一優選例中，所述方法包括步驟：
[0088] (b)將所述第一階段培養的細胞轉移到培養瓶中，加入NKT細胞培養基，進行第二 階段培養，其中，所述NKT細胞培養基中含有白介素-2;優選地，所述白介素-2的濃度為 200U/mL-800U/mL(優選為 300U/mL-700U/mL，更優選為400U/mL-600U/mL，最優選為約 500U/ mL) 〇
[0089] 在另一優選例中，通過所述第二階段培養從而實現NKT細胞體外的擴增。
[0090]在另一優選例中，用于所述第二階段培養的培養瓶是未包被的。
[0091]在另一優選例中，用于所述第二階段培養的所述NKT細胞培養基中還包含血清;優 選地所述血清為自體血清或胎牛血清;更優地所述血清為自體血清。
[0092] 在另一優選例中，所述血清含量為0.4% (v/v)_0.8% (v/v);優選為0.6% (v/v)。
[0093] 在另一優選例中，所述第二階段的培養時間為8天-20天;優選為10天-18天;更優 選為為12天-16天。
[0094]在另一優選例中，所述方法還包括步驟；
[0095] (c)將嵌合抗原受體(CAR)基因整合于所述NKT細胞中，從而制備表達嵌合抗原受 體的NKT細胞。
[0096]在本發明的一個優選的實施方式中，根據本發明的嵌合抗原受體，為CD19ScFv_ ⑶8-⑶137-⑶3ζ，由⑶19ScFv、⑶8的鉸鏈區和跨膜區、⑶137的胞內信號結構域和⑶3ζ的胞 內信號結構域串聯構成。
[0097]優選地，所述嵌合抗原受體的氨基酸序列如SEQIDNO. 1所示。
[0098]本發明還提供了編碼根據本發明的嵌合抗原受體的基因。
[0099]優選地，