一種腫瘤融合細胞疫苗的制備方法
【專利摘要】本發明提供一種腫瘤融合細胞疫苗的制備方法，將αTCR及βTCR的基因融合為αβTCR，獲得重組質粒后將αβTCR構建成穿梭質粒pMP71?αβTCR，將αβTCR基因轉染γδT細胞，采用電融合技術融合γδT細胞及腫瘤細胞制成疫苗。本發明利用αβTCR基因轉染γδT細胞與腫瘤細胞形成融合細胞制備疫苗，該腫瘤疫苗能夠對腫瘤細胞特異性識別，融合細胞誘導腫瘤細胞凋亡的能力最強，并且能夠激活機體受體主動免疫來治療腫瘤。
【專利說明】
一種腫瘤融合細胞疫苗的制備方法
技術領域
[0001] 本發明屬于生物技術領域，涉及一種疫苗制備方法，尤其涉及一種腫瘤融合細胞 的疫苗制備方法，是一種利用CtOTCR基因轉染γ δτ細胞與腫瘤細胞形成融合細胞制備疫苗。
【背景技術】
[0002] 惡性腫瘤作為一種嚴重危害人類的身體健康的疾病，發病率呈現逐年上升的趨 勢。根據衛生部腫瘤防治辦公室的數據顯示，近20年來，中國每4至5個死亡者中就有1個死 于癌癥，已成為威脅國民健康的頭號殺手。我國每年癌癥發病人數約260萬人，死亡約180萬 人。
[0003] 近年來，腫瘤的免疫治療備受關注，已成為繼手術、放療、化療后的第4種治療方 法。主要分兩種手段:一是過繼性將體外擴增的具有抗腫瘤活性的特異性毒性免疫細胞，特 另IJ是將T細胞輸入到體內的被動性免疫治療;二是直接在體內刺激抗原遞呈細胞(APC)擴增 及細胞因子釋放，達到抗腫瘤作用的主動性免疫治療。以往，針對腫瘤的免疫治療的研究主 要集中于〇)8+αβΤ細胞(01)、疆細胞和細胞因子方面，008+(^1'細胞免疫療法主要是通過刺 激αβΤ細胞來誘導抗腫瘤反應，但是在腫瘤細胞中經常發現MHC分子的丟失，表現為腫瘤細 胞對αβΤ細胞介導的細胞毒性的耐受，而其他方面的免疫治療也不盡人意，故在較長一段時 間內，腫瘤免疫治療的基礎及臨床研究處于相對停滯狀態（Lai Q，Ma S，Ge J，Huang Ζ， Huang X, etc .Tcrgammadelta( + )Cd4(-)Cd8(-)T Cells Suppress the Cd8( + )T-Cell Response to Hepatitis B Virus Peptides,and Are Associated with Viral Control in Chronic Hepatitis B.PloS one.2014;9(2):e88475)〇
[0004] 傳統上主要采用有抗原肽刺激樹突狀細胞(DC)，腫瘤細胞提取物致敏DC及基因修 飾DC，但因大部分腫瘤缺乏特異性抗原肽，或易誘發自身免疫性疾病，或缺乏特異性篩選標 記分子限制了這些方法的使用與效果。近年來，腫瘤細胞直接融合DC來致敏DC取得了良好 的效果。盡管DC是體內最強的APC，但PBMCs中提取的DC擴增能力很低，多種因子刺激后至多 獲取107個混合DC(包含未成熟，成熟及衰老型），導致它們的抗原提呈能力和持續時間良莠 不齊，大大降低DC腫瘤疫苗的治療效果(Wu Y，Wu W，Wong麗，etc.Human Gamma Delta T Ce 11s: A Lymphoid Lineage Cell Capable of Professional Phagocytosi s . J Immunol·2009;183(9):5622-5629)。

【發明內容】

[0005] 本發明針對目前抗腫瘤免疫治療的缺陷，提供一種腫瘤融合細胞疫苗的制備方 法，是一種利用aOTCR基因轉染γδΤ細胞與腫瘤細胞形成融合細胞制備疫苗的方法。本發明 通過以下步驟實現：
[0006] 1.取外周血單核細胞(PBMC)，加入唑來膦酸ΙμΜ和人重組IL-2 400IU/mL并分離出 γ ST細胞；將HER2369(10-8M)與β2-微球蛋白（10μπιο1/1)加入到細胞中，37°C，放置2h;每 20min輕輕點到混勻使其充分結合；用與HER2369結合的T2細胞刺激與外周血HLA-A2-T細 胞;刺激7-14天后，對細胞進行梯度稀釋可得到HER2特異性T細胞。
[0007] 2.提取HER2特異性T細胞RNA，用提取的RNA產物來進行下一步逆轉錄反應，反應條 件：室溫IOmin，42 °C Ih，99 °C 5min滅活AMV Reverse Transcriptase;將反轉錄的 cDNA置于-80度冰箱保存，備用。以反轉錄得到的cDNA為模板PCR合成TCRa-以及TCRP目的片段，合成的 目的片段帶有Not I、EcoR I酶切位點。提取的RNA產物行PCR反應，PCR反應程序如下:預熱 95°C，2min; 95°C變性30s，65°C退火30s，70°C延伸2min，（35個循環）70°C IOmin，4°C停止。凝 膠電泳檢測PCR產物，參照說明書用凝膠回收試劑盒回收PCR產物;或者用PCR純化試劑盒對 PCR產物進行純化。純化后的目的片段與載體進行酶切反應，Not I和EcoR I雙酶切目的片 段以及載體PMP71 (比例5:1)，之后進行連接，16 °C連接16h，65 °C加熱IOmin使酶滅活，連接 產物轉化至T0P10感受態細胞。以堿裂法提取得到ρΜΡ71/ΤΟ?αβ質粒。
[0008] 3.用脂質體Lipofectamine2000將穿梭質粒ρΜΡ71-αβΤΟ?和骨架質粒(腺病毒轉染 需要穿梭質粒與骨架質粒）共轉染293Τ細胞，質粒與脂質體2000的比率為Iyg :1.5μ1。取 2x105-5x105激活的γ δΤ細胞，在室溫下將凍存的慢病毒顆粒融化，輕輕混勻，將0.75ml慢 病毒顆粒加入T細胞中；2周后，使用抗人⑶3，⑶45，⑶4，⑶8，⑶45R0，⑶62L抗體以及FITC標 記的羊抗鼠 F(ab'）2抗體，進行流式細胞儀分析;轉染成功HER2c^TCR- γ δΤ細胞。
[0009] 4.采用電融合技術融合γδτ細胞及腫瘤細胞制成疫苗。將上述轉染的HER2-ai3 TCR-γδΤ細胞與經80Gy射線照射后的SA0S-2-LUC細胞在融合介質中洗滌、重懸，細胞濃度 在5 X 106-15 X 10%1，利用電融合儀進行融合得到融合細胞。
[0010] 本發明的另一個目的是提供所述方法在制備腫瘤融合細胞疫苗中的應用。
[0011] 本發明制備對腫瘤細胞特異性識別且激活機體受體主動免疫的細胞疫苗，增加特 異性，提高其在體內的作用時間和效果。本發明在制備出腫瘤疫苗后測試其效果，分別對腫 瘤細胞進行CCK-8增殖活性檢測，LDH細胞毒性反應檢測，細胞凋亡流式檢測。實驗分組:① SA0S-2-LUC腫瘤細胞對照組、② γ ST+SA0S-2-LUC細胞組、③HER2c^TCR- γ ST+SA0S-2-LUC 細胞組、④腫瘤融合細胞+SA0S-2-LUC細胞組，每個組別設置3個重復孔，37 °C、5 % C02培養。 實驗結果表明，該腫瘤疫苗能夠對腫瘤細胞特異性識別，融合細胞誘導腫瘤細胞凋亡的能 力最強，能夠激活機體受體主動免疫來治療腫瘤。
【附圖說明】
[0012]圖1是顯微鏡檢測γ δΤ細胞體外誘導效果。
[0013] 圖2是流式細胞術鑒定γδτ細胞。
[0014] 圖3是LDH法檢測γ δΤ細胞對SAOS的殺傷作用。
[0015] 圖4是ELISA檢測HER2特異性（*與Control比較Ρ〈0·05,林*與Control比較Ρ〈 0 · 001，η = 3)。
[0016] 圖5是CCCK-8檢測靶細胞增殖活性(*與Contro 1比較Ρ〈0 · 05，*#與Control比較Ρ〈 0 · 01，η = 3)。
[0017] 圖6是LDH法檢測靶細胞毒性反應(*與Control比較Ρ〈0· 05，#與Control比較Ρ〈 0 · 01，η = 3)。
[0018]圖7是流式細胞術檢測靶細胞凋亡。
【具體實施方式】
[0019] 本發明結合實施例作進一步的說明。
[0020] 實施例1 一種腫瘤融合細胞疫苗制備方法
[0021] 1.外周血單核細胞(PBMC)的分離
[0022] 取外周血單核細胞PBMC(或以RPMI 1640培養基1:1稀釋外周血標本，加入含有淋 巴細胞分離液的離心管(稀釋靜脈血與淋巴細胞分離液體積比2:1 )，500 X g離心20min。吸 取淋巴細胞分離液界面乳白色單核細胞層，以RPMI 1640培養基洗滌2次以完全培養基調整 細胞濃度至IO6細胞/mL備用。
[0023] 2.γδΤ細胞的制備
[0024] 1)正常人及OS患者γ δΤ細胞的分離，計數外周血單個核細胞總量，調整細胞濃度 為1~2 X 106/mL，取24孔板，每孔加入ImL細胞懸液，置于37 °C、5 % CO2培養箱內培養；
[0025] 2)培養第一天加入唑來膦酸ΙμΜ和人重組IL-2 400IU/mL(Zol+IL-2組）；
[0026] 3)每3d更換一次培養基，添加含人重組IL-2 400IU/mL的新鮮培養基，培養12-14d 后收獲正常人的γ ST細胞。結果見圖1。
[0027] 3. γδΤ細胞分離、培養、鑒定
[0028] 胰酶消化下細胞，1500rpm離心5min，并用0.01Μ PBS清洗細胞2次；用0.01Μ PBS制 備細胞懸浮液，細胞濃度約為5 X 106/mL。根據細胞需要量分細胞于3個1.5mL干凈的EP管 中。分別標記為ctr組；IL-2組、Zol+IL-2組；Ctr組為PBS對照（未處理組）加入TCR-γδΤ-ΡΕ 抗體+CD3-FITC抗體；IL-2組加入TCR- γ δΤ-PE抗體+CD3-FITC抗體；Zol+IL-2組加入TCR- γ ST-PE抗體+⑶3-FITC抗體;上述三組細胞室溫孵育30min;0.OlM PBS清洗兩遍，重新調整細 胞濃度，上機前先用篩網過濾細胞，以防止細胞堵塞分選孔，然后上機檢測。結果見圖2。 [0029] 4.正常人γ δΤ細胞殺傷活性驗證
[0030] 將分離得到的正常人γ δΤ細胞與SAOS共培養4h，LDH法檢測γ δΤ細胞對SAOS的殺 傷作用，篩選殺傷率較高者進行后續實驗。
[0031] 1)將分離得到的正常人及OS患者γ δΤ細胞與SAOS細胞共培養4h;
[0032] 2)依照不同比例進行共培養，通常比例設置，1.5:1;3:1;6 :1;12:1;
[0033] 3)每個組別設置3個重復孔，37 °C 5 % C02培養；
[0034] 4)24h后取上清，根據LDH ELISA檢測試劑盒的說明書步驟操作；
[0035] 5)酶標儀讀數。結果見圖3。
[0036] 3.HER2特異性T細胞的制備
[0037] 制備步驟
[0038] 1)用RPMI-1640清洗HLA-A2+T2細胞（品牌：IBL-America，貨號：Cell-02816)兩次， 以去除細胞培養基中的多肽；
[0039] 2)將細胞以2xl06/ml濃度重懸于無血清培養基(AIM-V)中；
[0040] 3)將HER2369(10-8M)與β2-微球蛋白（10μπιο1/1)加入到細胞中，37°C，放置2h;每 20min輕輕點到混勻使其充分結合；
[00411 4)RPMI-1640清洗細胞一次，重懸于培養基中；
[0042] 5)用與HER2369結合的T2細胞刺激與從健康志愿者血液中分離得到HLA-A2-T細 胞；
[0043] 6)刺激7-14天后，對細胞進行梯度稀釋可得到HER2特異性T細胞。
[0044] 4.pMP71/TCRa 和 pMP71/TCR0 質粒構建
[0045] HER2特異性T細胞RNA提取：
[0046] 1)收取激活后的HER2特異性T細胞I X 106,用PBS沖洗2遍；
[0047] 2)去掉上清后，向細胞沉淀中加入1ml Trizol，吹打成均勻細胞懸浮液；
[0048] 3) Iml注射器來回抽吸以剪切基因組DNA，然后用注射器直接將樣品轉移到一新的 1.5ml EP管中；
[0049] 4)向EP管中加入200微升氯仿，劇烈震蕩30sec，12000rpm離心5min;
[0050] 5)將上清移至另一新的1.5ml EP管中，并加入等體積的異丙醇，室溫放置5min;
[0051 ] 6)12000rpm 離心 5min，吸走上清液；
[0052] 7)加入70%乙醇700微升，不需吹打，12000rpm離心2min;
[0053] 8)盡可能徹底去除上清，室溫干燥使乙醇揮發；
[0054] 9)用50微升DEPC水溶解沉淀；
[0055] 10)取溶解的RNA 2微升加入1ml DEPC水中，紫外分光光度計測量260nm和280nm的 吸光度值。按IOD = 40微克RNA計算RNA的產率:0D260/280在1.8-2.0視為提取的RNA純度很 尚；
[0056] 11)用提取的RNA產物來進行下一步RT反應。
[0057] 表1 RT反應條件
[0059] RT 反應條件：室溫 1〇111；[11，42。0111，99。05111；[11滅活4]\^1^￥6186 1'瓜118(31^口七&86;將 反轉錄的cDNA置于-80度冰箱保存，備用。以反轉錄得到的cDNA為模板PCR合成TCRa-以及 TCRP目的片段，合成的目的片段帶有Not I、EcoR頂每切位點。
[0060] 表2 PCR體系

[0065] PCR反應程序如下：預熱95°C，2min;95°C變性30s，65°C退火30s，70°C延伸2min， (35個循環)70°C10min，4°C停止。凝膠電泳檢測PCR產物，參照說明書用凝膠回收試劑盒回 收PCR產物;或者用PCR純化試劑盒對PCR產物進行純化。純化后的目的片段TCR-HER2-la和 TCR-HER2-li3(具體序列詳見序列表)與載體進行酶切反應，具體操作如下：
[0066] Not I和EcoR I雙酶切目的片段以及載體pMP71(比例5:1)，之后進行連接，過程見 表4。
[0067] 表4 Not I和EcoR I雙酶切體系：
L 0072 J 16Γ連接16h，65uc加熱1〇!1^11便_火沽，連接嚴物轉化全TOPlO感受態細胞。
[0073] 質粒DNA的轉化TOPlO感受態細胞：
[0074] 1)無菌狀態下取新鮮感受態500微升；如果使用凍存的感受態細胞時，則將其從- 70°C冰箱取出，置于冰上，待其解凍后立即吸取500微升，剩余的感受態可棄去，不能再凍存 復用；
[0075] 2)每管加入2微升連接產物，輕輕旋轉以混合內容物，在冰上放置30min;
[0076] 3)42。(：熱激458，冰上靜置2!1^11;
[0077] 4)每管加200μ1 S.0.C培養基，37°C，300rpm Ih;
[0078] 5)用無菌彎頭玻璃鋪菌器將100微升菌液鋪于含氨卞青霉素 (Amp)的LB平板表面， 37°C平放20min，然后倒置培養過夜。挑取陽性克隆進行測序及PCR驗證。
[0079] 堿裂解法小量提取質粒(QIAGEN公司質粒提取試劑盒）：
[0080] 1)用無菌牙簽從LB平板上挑取單個菌落，接種于3mL含氨芐青霉素（lOOyg/mL)的 LB培養液中，37 °C 230 X g，劇烈振搖12~16h;
[0081 ] 2)取2mL菌液置eppendorf管中，12000 X g離心2min，棄上清液；
[0082] 3)用250yL的Solution〗（含RNase A)充分懸浮細菌沉淀(注意不要殘留細小菌塊， 可以使用振蕩器(Vortex)等劇烈振蕩使菌體充分懸浮）；
[0083] 4)加入150yL的Solutionn輕輕地上下翻轉混合5~6次，隨后將離心管放置于冰 上1~2min，使菌體充分裂解，形成透明溶液(此步驟不宜超過2min);
[0084] 5)加入150uL Solutionm，立即溫和顛倒離心管數次，室溫放置Smint3WOOOXg離 心12min。要得到更好的質粒提取效果，請于步驟2和步驟3,冰上放置；
[0085] 6)將420uL結合緩沖液加入離心吸附柱中，然后將步驟5中的上清加入A型離心吸 附柱中（盡量去除雜質），混勻，12000 X g離心30s。倒掉廢液收集管中的廢液；
[0086] 7)加入750uL漂洗液于離心吸附柱中，靜置Imin后，12000 Xg離心15s。倒掉廢液收 集管中的廢液。重復一次。倒掉廢液后。再次于12000 X g離心2min，盡量除去漂洗緩沖液； [0087] 8)小心取出離心吸附柱，將其套入一個干凈的1.5mL Eppendorf離心管中，加入適 量dH20水或洗脫緩沖液(Elution buffer)，室溫放置2~5min后，12，000 X g離心Imin;
[0088] 9)柱子上還掛有適量質粒DNA，重復步驟8，取20uL洗脫，室溫放置1~3min，12000 X g離心Imin，最后將洗脫的體積合為一管。
[0089] 以克隆得到的pMP71/TCRa和pMP71/TCRf3質粒為模板，進行αβΤΟ?的基因融合及克 隆，獲得重組質粒后將ai3TCR連接到腺病毒穿梭質粒ρΜΡ71載體中構建穿梭質粒ρΜΡ71_αβ TCR;具體操作步驟如下:aPTCR重組質粒與ρΜΡ71載體分別進行Not I、EcoR I雙酶切，酶切 體系見表6。
[0090]表 6
[0093]將酶切產物進行純化，準備連接，過程參見表7。
[0094] 表7連接體系
[0096] 16°C連接16h，65°C10min使酶失活，將連接產物轉化至T0P10感受態中。質粒的提 取參照上法。將陽性克隆進行PCR及測序驗證。
[0097] 堿裂解法小量提取質粒(QIAGEN公司質粒提取試劑盒)方法見上。
[0098] 重組質粒的大量提取(QIAGEN公司無內毒素質粒大提試劑盒），大量制備穿梭質粒 為轉染做準備：
[0099] 1)收集菌體:500ml離心管收集菌體，4500rpm lOmin，加 STE 15m懸浮菌液于50ml 離心管中；
[0100] 2)4°C，8000rpm，15min去上清，菌液懸浮于solution I 3.2mL;
[0101] 3)加 solution II 6.4mL，立即溫和震蕩，至菌體清亮，室溫放置3-10min;
[0102] 4)加 solution III 4.8mL，立刻搖勾，于(TC放3_5min;
[0103] 5)4°C，8000rpm，15rain，收集上清于50ml離心管；
[0104] 6)加等體積氯仿:異戊醇(24:1)混勾，4°C，8000rpm，15min;
[0105] 7)取上清于50ml離心管中，加0.6倍體積的異丙醇，20°C30min;
[0106] 8)4°C，8000rpm，15min，去上清；
[0107] 9)加 Iml 50XTE，溶解沉淀，再加 Iml RNase酶母液(終濃度lmg/ml)，37°C1-2h;
[0108] 10 )加2倍體積的無水乙醇和I /10體積的NaAc (3M，pH5.2 )，混勻5miη，4 °C， 9000rpm，15min，去上清；
[0109] 11)70%乙醇洗滌lmin，9000rpm lmim;
[0110] 12)500ul TE溶解，-20°C保存。
[0111] 5.穩定細胞系構建
[0112] PS:腺病毒包裝中的難點主要在于怎么將外源基因表達框構建至腺病毒骨架載體 上。由于腺病毒骨架載體比較大（~30kb)，而且載體中的一些常用酶切位點幾乎都有多個， 如果用常規的酶切-連接的方式將外源基因構建至腺病毒骨架載體上，成功率很低，因此， 目前的腺病毒表達系統基本上都是用穿梭載體利用同源重組的方法將外源基因構建至腺 病毒骨架載體上。現在使用的慢病毒載體大多是四質粒系統，四質粒共轉染293細胞，即是 Gag/P0l、Rev、VSV-G(代替HIV-l的EnV)分別獨立放置在3個質粒上即骨架質粒(pGag/P 0l、 pReV、pVSV-G)，另外的一個就是可以放目的基因的質粒即穿梭質粒。VSV-G來源于水泡口炎 病毒具有廣泛的嗜性，能夠感染大多數細胞。四質粒系統將Gag/Pol、Rev分別放在不同的載 體上，增強了病毒載體的安全性。
[0113] 慢病毒顆粒獲取
[0114] I) 75cm2的細胞培養瓶培養293T細胞，選取融合度60-70 % 293T細胞，換液后三小 時后備用；
[0115] 2)用脂質體Lipofectamine2000將穿梭質粒ρΜΡ71-αβΤΟ?和骨架質粒(腺病毒轉染 需要穿梭質粒與骨架質粒)共轉染293Τ細胞，質粒與脂質體2000的比率為Iyg :1.5μ1;
[0116] 表8
[0118] (四質粒之間比例可以根據實際情況進行調節，以達到最大感染效率。）
[0119] 3)待細胞長滿培養板時，將其消化轉移至IOcm細胞培養皿中繼續培養；
[0120] 4)細胞轉染后約IO-Hd時，可觀察到病毒病變斑出現，繼續培養1-2天使病變斑擴 大；
[0121] 5) 1000 g離心5min收集細胞，將細胞于-80°C和37 °C反復凍融3次后1000 g離心 IOmin，上清液即為初次收獲的病毒液。
[0122] 慢病毒的濃縮
[0123] 1)取收集的293T細胞上清液約35ml收集于50ml離心管中，2000rpm離心10min，去 除293T細胞碎片；
[0124] 2)將獲得的上清液置于冰上，用60ml注射器連接0.45μπι針頭濾器將離心后的上清 液過濾于35ml超速離心管中，25 ,OOOrpm離心3小時；
[0125] 3)將離心管輕輕取出，置于冰上；
[0126] 4)在病毒專用超凈臺中，打開金屬離心管，吸去部分離心后的病毒上清，用鑷子取 出超速離心管，吸去大部分上清，剩余約4ml;
[0127] 5)用5ml移液管反復吹打剩余的4ml病毒上清約10次，0.75ml/管進行分裝，放入-80 °C冰箱中保存備用。
[0128] 慢病毒轉染γδτ細胞
[0129] 1)取2x105-5x105激活的γ δΤ細胞，在室溫下將凍存的慢病毒顆粒融化，輕輕混 勻，將0.75ml慢病毒顆粒加入T細胞中；
[0130] 2)向24孔板中加入凝聚胺，用RPMI1640培養基調整至終濃度8μg/ml，將24孔板放 入離心機離心，2500rpm，1.5小時。離心后將24孔板放于37°C、5%C02培養箱中培養過夜； [0131] 3)離心過夜培養的24孔板，去掉大部分含慢病毒顆粒的上清培養液，加入新鮮的 RPMI-1640培養液，擴增T細胞；
[0132] 4)每2天計數T細胞，向RPMI-1640培養基中加入IL-2 400IU/ml，維持細胞密度為 0.5-lxl06/ml；
[0133] 5)2周后，使用抗人0)3,0)45,004,008,0)45肋，0)621^抗體以及？11'(：標記的羊抗鼠 F(ab'）2抗體，進行流式細胞儀分析；
[0134] 6)轉染成功 ΗΕΚ2αβΤα?-γδΤ 細胞。
[0135] HER2-c^TCR- γ δΤ細胞體外功能檢測（此步驟驗證HER2-1的抗腫瘤免疫應答以及 多肽識別特異性）
[0136] A:效應細胞與靶細胞共培養驗證HER2特異性（黑色素瘤細胞系SK-Mel 29表達 HER2/neu以及SA0S-2-LUC細胞作為靶細胞）
[0137] 1)用0.25%胰酶消化相應細胞后，加入RPMI-1640培養基中和胰酶，離心后調整細 胞密度為lxl〇6/ml，取100ul(lxl05)腫瘤細胞接種于U型96孔板中，設置3個復孔；
[0138] 2)HER2特異性T細胞在無 IL-2的RPMI-1640培養液中培養過夜，使T淋巴細胞靜息；
[0139] 3)收取靜息的T淋巴細胞，離心去掉上清，將細胞重懸于RPMI-1640培養液中，計 數，調整細胞密度為lxl〇6/ml，取100ul(lxl05)T細胞接種于U型96孔板中已經接種相應腫 瘤細胞的孔中，將96孔板放置于37°C、5%C02培養箱中培養過夜。只有T細胞的孔作為陰性 對照孔。
[0140] B: IFN- γ ELISA檢測HER2特異性
[0141] 1)包被:按說明書指導，將Capture抗體稀釋于IX包被緩沖液中，向試劑盒提供的 微孔板中的各反應孔中各加0.1 ml，塑料貼紙覆M微孔板，放置4 °C過夜。
[0142] 2)封閉：將過夜后的微孔板用自動ELISA洗板機洗漆4次后，拋干，用IX分析緩沖液 100UI封閉1小時。
[0143] 3)加樣:將微孔板再次洗漆4次后，拋干，向各反應孔加入待檢測的T細胞與腫瘤細 胞共培養的上清液IOOul，相應稀釋倍數的上清液及IFN- γ標準品（1000pg/ml，倍比稀釋至 15.6pg/ml)，室溫鮮育2小時。
[0144] 4)加檢測抗體:微孔板洗滌4次后，拋干，按說明書指定將Detect ion抗體用IX分析 緩沖液稀釋，取100UI加入各反應孔中，室溫孵育1小時。
[0145] 5)加辣根過氧化物酶標記的二抗:微孔板洗漆4次后，拋干，將HRP標記的抗體用IX 分析緩沖液稀釋，向各反應孔中各加100UI，室溫孵育0.5小時。
[0146] 6)微孔板洗漆4次后，拋干，向各反應孔中加入新鮮配制的TMB底物溶液IOOul，避 光孵育15分鐘。
[0147] 7)向各反應孔中加入IM硫酸IOOul終止反應。
[0148] 8)結果判定:在EUSA檢測儀上，以空白對照孔調零，檢測各孔450nm吸光值(0D值）， 計算IFN-γ濃度值。結果見圖4。
[0149] 6.ΗΕΚ2αβΤΟ?_γδΤ和骨肉瘤細胞的融合、純化。
[0150] SA0S-2-LUC人骨肉瘤細胞培養
[0151] SA0S-2-LUC細胞復蘇后在用含體積分數為10%的胎牛血清的RPMI1640培養基中 lOOU/mL青霉素和100g/mL鏈霉素的RPMI1640培養液，制成單細胞懸液，于37 °C、5 % CO2培養 箱培養常規培養，每3d換液1次。0.25%的胰蛋白酶消化傳代。換液后，在倒置顯微鏡下觀察 細胞形態及生長情況。
[0152] 融合細胞制備
[0153] 將上述轉染的HER2-a0TCR- γ δΤ細胞與經80Gy射線照射后的SA0S-2-LUC細胞在融 合介質中洗滌、重懸，細胞濃度在5X106-15X106/ml，利用電融合儀進行融合。得到骨肉瘤 融合細胞。具體操作步驟如下：
[0154] 1)融合條件：融合電極3.2mm;AC 50V，5Sec;DC 250V，30ySec;2pulses(ECM 2001 型細胞融合儀:美國BTX公司）；
[0155] 2)HER2-c^TCR- γ δΤ細胞：SA0S-2-LUC = 5:1，用0.3M葡萄糖溶液洗一次，將總數為 5 X 106個的細胞懸浮在0.5ml葡萄糖溶液中；
[0156] 3)把細胞加到電極槽中，按上述條件設定融合儀參數，觸發融合按鈕放電融合；
[0157] 4)用吸管轉移細胞到培養瓶中加含10%FBS的RPMI-1640完全培養液。
[0158] MACS純化融合細胞
[0159] 利用MACS系統(MiniMACS磁性分離儀;德國Miltenyi Biotec GmbH公司）純化骨肉 瘤融合細胞操作步驟如下：
[0160] 1)融合后細胞在培養24h后用胰蛋白酶消化，收集107個細胞懸浮在80μ1 PBS中；
[0161] 2)加20μ1 1:10稀釋的0X62 mAb，工作濃度1:50,混勻后在4°C放置IOmin;
[0162] 3)加 Iml PBS，300g離心10min，共洗2次；
[0163] 4)細胞重懸在80μ1 PBS中，加20μ1已標記的磁微球，在4°C放置15min;
[0164] 5)用Iml的PBS洗細胞1次，300g離心10min收集細胞，重懸在500μ1 PBS中；
[0165] 6)細胞加到預先用500μ1 PBS洗過的分離柱中；
[0166] 7)收集流出液，再用500μ1 PBS洗3次柱子，流出液收集到一起；
[0167] 8)把分離柱從架子上取下來，然后加500μ1 roS，用針芯快速推出緩沖液，把細胞 洗脫下來；
[0168] 9)將分離純化后的細胞置瓶中繼續培養。
[0169] g.靶細胞的增值活性檢測
[0170] 1)將凍存的SA0S-2-LUC細胞進行復蘇，離心后，用含10%FBS的1640完全培養基進 行培養；
[0171 ] 2)待SA0S-2-LUC細胞長滿后進行傳代分盤，接于96孔板中進行CCK-8實驗；
[0172] 3)取處于對數生長期的3403-2-〇](：細胞，用0.25%胰酶消化后，接種5\105/1^細 胞于96孔板中，每孔加入200yL的培養液，于37°C，5%C0 2培養箱中培養；
[0173] 4)進行實驗分組：① SA0S-2-LUC control組、② γ ST+SA0S-2-LUC細胞組、③HER2a βΤΟ?-γδΤ+3Α03-2-Ι?(：細胞組、④骨肉瘤融合細胞+SA0S-2-LUC細胞組，每個組別設置3個 重復孔，37°C、5%C02培養；
[0174] 5)分別于24h、48h加入CCK-8試劑，每孔20yL，繼續于培養箱37°C，5 %⑶2培養3h 后，450nm波長進行檢測。結果見圖5 〇
[0175] H.靶細胞的毒性反應檢測
[0176] 1)取處于對數生長期的3403-2-〇](：細胞，用0.25%胰酶消化后，接種5\105/1^細 胞于96孔板中，每孔加入200yL的培養液，于37°C，5%C02
[0177] 培養箱中培養；
[0178] 2)進行實驗分組：① SA0S-2-LUC control組、② γ ST+SA0S-2-LUC細胞組、③HER2a βΤΟ?-γδΤ+3Α03-2-Ι?(：細胞組、④骨肉瘤融合細胞+SA0S-2-LUC細胞組，每個組別設置3個 重復孔，37°C、5%C02培養；
[0179] 3)24h后取上清，根據LDH ELISA檢測試劑盒的說明書步驟操作;結果見圖6。
[0180] i靶細胞凋亡檢測
[0181] 共培養48h后，利用Annexin V和PI雙染靶細胞，流式細胞儀檢測細胞凋亡
[0182] 1)從正常人血液中分離PBMC細胞，進行誘導分離，收獲γ δΤ細胞；
[0183] 2)進行實驗分組：① SA0S-2-LUC control組、② γ ST+SA0S-2-LUC細胞組、③HER2a CTCR+SAOSHUC細胞組、④骨肉瘤融合細胞+SA0S-2-LUC細
[0184] 胞組，37°C、5%C02 培養 48h;
[0185] 3)PBS洗滌細胞兩次，收集細胞1~5X105細胞；
[0186] 4)加入500yL的AnnexinV Binding Buffer懸浮細胞；
[0187] 5)加入5yL AnnexinV-FITC混勾后，加入5yLPropidium Iodide(周期檢測只加5yL Propidium Iodide)，混勾；
[0188] 7)用流式細胞儀檢測(Ex = 488nm; Em = 530nm)凋亡情況。結果見圖7 〇
【主權項】
1. 一種腫瘤融合細胞疫苗的制備方法，其特征在于，通過以下步驟實現： (1) 取外周血單核細胞，加入唑來膦酸ΙμΜ和人重組IL-2400IU/mL并分離出γ δτ細胞； 將HER2369與β2-微球蛋白加入到細胞中，37°C，放置2h;每20min輕輕點到混勻使其充分結 合，用與HER2369結合的T2細胞刺激與外周血HLA-A2-T細胞，刺激7-14天后，對細胞進行稀 釋得到HER2特異性T細胞； (2) 提取HER2特異性T細胞RNA，用提取的RNA產物進行下一步逆轉錄反應，將反轉錄的 cDNA置于-80度冰箱保存，備用，以反轉錄得到的cDNA為模板PCR合成TCRa-以及TCRi3目的片 段，合成的目的片段帶有Not I、EcoR I酶切位點，提取的RNA產物行PCR反應，凝膠電泳檢測 PCR產物，參照說明書用凝膠回收試劑盒回收PCR產物，或者用PCR純化試劑盒對PCR產物進 行純化，純化后的目的片段與載體進行酶切反應，Not I和EcoR I雙酶切目的片段以及載體 PMP71，比例5:1，之后進行連接，16°C連接16h，65°C加熱lOmin使酶滅活，連接產物轉化至 T0P10感受態細胞，以堿裂法提取得到ρΜΡ71/ΤΟ?αβ質粒； (3) 用脂質體Lipofectamine2000將穿梭質粒pMP71-a0TCR和骨架質粒共轉染293Τ細 胞，質粒與脂質體2000的比率為lyg: 1.5μ1，取2x105-5x105激活的γ δΤ細胞，在室溫下將凍 存的慢病毒顆粒融化，輕輕混勻，將〇. 75ml慢病毒顆粒加入Τ細胞中，2周后，使用抗人⑶3， ⑶45，⑶4，⑶8，⑶45R0，⑶62L抗體以及FITC標記的羊抗鼠 F(ab '）2抗體，進行流式細胞儀分 析，轉染成功HEI^aOTCR- γ δΤ細胞； (4) 采用電融合技術融合γδΤ細胞及腫瘤細胞制成疫苗，將上述轉染的HER2-c^TCR-y δΤ細胞與經80Gy射線照射后的SA0S-2-LUC細胞在融合介質中洗滌、重懸，細胞濃度在5X 106-15 X 106/ml，利用電融合儀進行融合得到融合細胞。2. 根據權利要求1所述的一種腫瘤融合細胞疫苗的制備方法，其特征在于，步驟(2)逆 轉錄反應條件：室溫l〇min，42°Clh，99°C5min滅活AMV Reverse Transcriptase。3. 根據權利要求1所述的一種腫瘤融合細胞疫苗的制備方法，其特征在于，步驟(2)PCR 反應程序如下：預熱95°C，2min;95°C變性30s，65°C退火30s，70°C延伸2min，（35個循環）70 °C10min，4°C 停止。4. 根據權利要求1所述的制備方法在制備腫瘤融合細胞疫苗中的應用。
【文檔編號】A61K39/00GK106075417SQ201610539799
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年7月6日
【發明人】朱健, 陶惠民, 梁成振
【申請人】浙江大學