疫苗組合物及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于獸用生物制品技術領域，具體涉及含豬偽狂犬病毒抗原的疫苗組合物 及其制備方法。
【背景技術】
[0002] 偽狂犬病，又稱Aujeszky氏病，是由皰瘆病毒科（Herpesviridae)a亞科中的豬 皰瘆病毒I型（Suidherpesviruslstrain)所引起的豬、牛、羊等多種家畜、家禽和野生動 物的一種以發熱、奇癢（除豬外）及腦脊髓炎為主癥的急性傳染病。豬的偽狂犬病在我國 廣泛存在，危害嚴重，是制約規模化豬場生產的主要疫病之一。它能引起妊娠母豬流產、死 胎或木乃伊胎和仔豬出現神經癥狀、麻痹，死亡率高。PRV具有較強的泛嗜性、神經嗜性及潛 伏感染特性，在外周神經系統可以長期潛伏感染，當潛伏病毒被激活變成有感染力的病毒， 被潛伏感染的宿主就會發病。
[0003] 最近的研宄報道稱豬偽狂犬病發生了新的特點，突出表現為任何年齡的豬都會 感染，可在豬群水平傳播，潛伏期短（1?2天），發病率在10 %?100%之間，發病豬死 亡率在10%?100 %之間（仔豬死亡率可高達100% )，感染后可引起豬只高熱（40? 42°C，持續3日以上），呼吸困難，腹瀉，喘，咳嗽，打噴嚏，后肢麻痹，犬坐，突然倒地，抽搐， 側臥不起，角弓反張，泳狀劃水，最后衰竭而死，并可引起種公豬精液質量下降，懷孕母豬 流產（高達35%)，早產，死胎，弱仔（弱仔14日齡前全部死亡）等繁殖障礙癥狀。現有 技術的疫苗免疫豬只后不能完全抵抗野毒攻擊，依然會出現高熱，精神沉郁，食欲下降或 廢絕等癥狀，感染率超過80%，發病率超過30%，死亡率在10 %?20%之間。（參見彭金 美等，豬偽狂犬病病毒新流行株的分離鑒定及抗原差異性分析，中國預防獸醫學報，2013， 35(1) :1-4;童武等，免疫后發病仔豬中偽狂犬病毒的分離和鑒定，中國動物傳染病學報， 2013, 21(3) :1-7；Yuetal.,PathogenicPseudorabiesVirus,China, 2012,Emerging infectiousDiseases,2014, 20(1):102-104；Anetal. ,Pseudorabiesvirusvariant inBartha-K61-vaccinatedpigs,China,EmerginginfectiousDiseases, 2013. 19(11)： 1749-1755)，現有技術還沒有疫苗能夠解決針對豬偽狂犬變異株引起的偽狂犬病。
[0004] 中國專利申請CN103923884A公開了一種豬偽狂犬病病毒基因缺失株、疫苗組合 物及其制備方法和應用公開了缺失gE基因的豬偽狂犬HN1201株（CCTCCN0.V201311)，其 攻毒能提供100%保護，但攻毒后還有2-3天的一過性發熱。
[0005] 目前商品化的豬偽狂犬滅活疫苗還存在有偶發性過敏情況（劉玉新等，仔豬偽狂 犬病免疫過敏反應的診治，河南畜牧獸醫，2002 (23) 2)
[0006] 目前存在的技術問題是需要更有效、更安全、更純凈的豬偽狂犬病疫苗，尤其需要 的是針對偽狂犬變異株的標記純化滅活疫苗。

【發明內容】

[0007] 為了解決現有技術的不足，本發明要解決的第一個問題是提供一種純化的豬偽狂 犬病毒抗原的方法，使用該方法可以制備更有效、更安全、更純凈的豬偽狂犬病疫苗組合 物。
[0008] 本發明的第一方面在于提供一種制備疫苗組合物的方法，其中，所述方法包括： (1)制備含有豬偽狂犬病毒的液體；(2)通過向所述步驟（1)的液體中加入非離子表面活 性劑或者含有非離子表面活性劑的溶液，增溶存在于豬偽狂犬病毒液體中的囊膜蛋白；（3) 除去所述步驟（2)中的非離子表面活性劑得到純化豬偽狂犬病毒抗原；以及（4)使用所述 步驟（3)中制備的抗原制備疫苗組合物。
[0009] 作為一種可選擇方式，上述"提供含有豬偽狂犬病毒的液體"是指通過將偽狂犬病 毒接種于易感的動物細胞進行增殖所獲得的液體培養物。
[0010] 作為本發明的一種實施方式，所述步驟（1)中含有豬偽狂犬病毒的液體為使用細 胞培養收獲的豬偽狂犬病毒培養液；所述細胞包括ST細胞系、PK-15細胞系、非洲綠猴腎 細胞Marc-145細胞系、牛腎細胞MDBK細胞系、牛睪丸傳代細胞BT細胞系、Vero細胞系、 BHK-21細胞系、豬腎傳代細胞系IBRS-2、兔腎傳代細胞系RK，或者雞胚成纖維細胞和豬腎 細胞的原代細胞。
[0011] 使用上述傳代細胞和原代細胞用于制備豬偽狂犬病毒的方法可以采用本技術領 域的常規方法進行。
[0012] 作為本發明的一種實施方式，所述制備含有豬偽狂犬病毒的液體使用細胞懸浮培 養方法制備豬偽狂犬病毒。
[0013] 作為本發明的一種實施方式，所述制備含有豬偽狂犬病毒的液體使用微載體作為 細胞載體以制備豬偽狂犬病毒。
[0014] 任何可以具有免疫活性的豬偽狂犬病毒均可以用于本發明，優選地，所述的偽狂 犬病毒為偽狂犬變異株。
[0015] 術語"豬偽狂犬變異株"也稱為高致病性豬偽狂犬毒株，是指：表現為任何年齡的 豬都會感染，可在豬群水平傳播，潛伏期短（1?2天），發病率在10%?100%之間，發病 豬死亡率在10%?100%之間（仔豬死亡率可高達100%)，感染后可引起豬只高熱（40? 42°C，持續3日以上），呼吸困難，腹瀉，喘，咳嗽，打噴嚏，后肢麻痹，犬坐，突然倒地，抽搐， 側臥不起，角弓反張，泳狀劃水，最后衰竭而死，并可引起種公豬精液質量下降，懷孕母豬流 產（高達35%)，早產，死胎，弱仔（弱仔14日齡前全部死亡）等繁殖障礙癥狀。
[0016] 作為本發明的一種實施方式，含有豬偽狂犬病毒的液體為使用傳代細胞培養收 獲的豬偽狂犬病毒變異株的培養液，所述豬偽狂犬病毒變異株為豬偽狂犬病毒HN1201株 以及豬偽狂犬HN1201株的gE基因缺失株、JS-2012株、豬偽狂犬HeNl、NVDC-PRV-BJ株、 NVDCPRV-HEB株和NVDC-PRV-SD株、豬偽狂犬病毒HN1202株、PRVTJstrain、豬偽狂犬病 毒變異株PRV-ZJ01。
[0017]豬偽狂犬病毒HN1201 株（Pseudorabiesvirus,strainHN1201)保藏號為CCTCC NO.V201311 ;保藏于中國典型培養物保藏中心；保藏地址為中國武漢?武漢大學，保藏日 期為2013年5月20日。JS-2012株公開信息為：童武，張青占，鄭浩等，免疫后發病仔豬中偽 狂犬病毒的分離和鑒定[J].中國動物傳染病學報2013, 21(3) : 1-7)。豬偽狂犬HeNl株保藏 在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其菌種保藏編號為CGMCCN0. 6656,公 開于專利申請CN102994458A。NVDC-PRV-BJ株、NVDCPRV-HEB株和NVDC-PRV-SD株公開信息 為：XiulingYu,ZhiZhou,DongmeiHu,etal.PathogenicPseudorabiesVirus,China, 201 2EmergingInfectiousDiseases,www.cdc.gov/eidol. 20,No. 1,January2014。豬偽狂犬 病毒HN1202 株（Pseudorabiesvirus,strainHN1202)保藏號為CCTCCNO.V201335;保藏 于中國典型培養物保藏中心；保藏地址為中國武漢?武漢大學，保藏日期為2013年8月26 日。PRVTJ(PRVTJ)株，公開于ChinaChun-HuaWangJinYuanl，Hua_YangQinl，etal，A novelgE-deletedpseudorabiesvirus(PRV)providesrapidandcompleteprotection fromlethalchallengewiththePRVvariantemerginginBartha-K61_vaccinated swinepopulationinChinaVaccine32(2014)3379 - 3385。豬偽狂犬病毒變異株 PRV-ZJ01，其保藏號為CGMCCNo. 8170 公開于CN103627678A。
[0018] 豬偽狂犬變異株的基因缺失株包括但不限于中國專利申請CN103923884A公開的 缺失gE基因的豬偽狂犬HN1201株，中國專利申請CN103756977A公開了豬偽狂犬病gE和 gl基因缺失病毒株PRV-ZJ011G株（保藏號為CGMCCNo. 7957)，中國專利申請CN102994458A 公開了豬偽狂犬病gE缺失株，保藏號為CGMCCNO. 6657。
[0019] 使用上述傳代細胞和原代細胞用于制備豬偽狂犬病毒變異株的方法可以采用本
技術領域的常規方法進行。<