1型禽腺病毒疫苗、蛋黃抗體的制備方法
【專利摘要】本發明公開了一種1型禽腺病毒疫苗、蛋黃抗體的制備方法，屬于獸用生物制品領域。本發明的1型禽腺病毒疫苗的制備方法包括1型禽腺病毒接種雞胚肝細胞制備抗原、測定抗原的病毒含量、含量合格的抗原經滅活劑滅活、滅活檢驗合格的抗原與佐劑混合乳化制備疫苗等步驟。本發明的1型禽腺病毒蛋黃抗體的制備方法包括疫苗免疫產蛋雞、收集高免蛋、提取抗體、測定效價等步驟。本發明制備的1型禽腺病毒疫苗具有抗原含量高、質量穩定等優點；本發明制備的1型禽腺病毒蛋黃抗體對1型禽腺病毒有很好的預防和治療效果。
【專利說明】
1型禽腺病毒疫苗、蛋黃抗體的制備方法
技術領域
[0001] 本發明涉及獸用生物制品領域，具體涉及1型禽腺病毒疫苗、蛋黃抗體的制備方 法。
【背景技術】
[0002] 全病毒滅活疫苗是一種常用的預防畜禽傳染病的獸用生物制品。生物組織繁殖病 毒，獲得的病毒經甲醛等滅活劑作用，使病毒失去復制、繁殖的能力，但保留免疫原性，此種 滅活后的全病毒可作為抗原與佐劑混合乳化制備滅活疫苗。制備的滅活疫苗經性狀檢驗、 安全檢驗、效力檢驗等，符合質量標準的疫苗可上市使用。
[0003] 獸用生物制品中常用的治療性抗體多為蛋黃抗體。蛋黃抗體是將抗原制成疫苗免 疫產蛋雞，采集針對該病具有中和能力的蛋黃，經過適當處理，接種易感動物，用于預防或 治療該病。所述蛋黃抗體有的經過簡單的稀釋、滅活后使用;有的經過了精制提純、濃縮提 高效價、冷凍干燥等深加工。商品化的蛋黃抗體是經過農業部批準的、具有生產文號的、經 過深加工的、有質量保障的有效廣品。

【發明內容】

[0004] 本發明的首要目的在于提供一種1型禽腺病毒疫苗的制備方法;本發明的另一目 的在于提供一種檢驗1型禽腺病毒疫苗效力的方法;本發明的再一目的在于提供一種1型禽 腺病毒蛋黃抗體的制備方法。
[0005] 本發明的目的通過以下技術方案實現：
[0006] -種1型禽腺病毒疫苗的制備方法，包括如下步驟：
[0007] (1)將1型禽腺病毒接種雞胚肝細胞進行培養，待50 % -70 %細胞出現細胞病變時 收獲細胞，即得到1型禽腺病毒抗原。
[0008] (2)測定1型禽腺病毒抗原的病毒含量，含量不低于107'5TCID 5Q/0.1mL的抗原用于 后續制備疫苗。
[0009] (3)1型禽腺病毒抗原經甲醛或二乙烯亞胺滅活后接種雞胚肝細胞，并盲傳若干 代，對1型禽腺病毒抗原進行滅活檢驗判定是否滅活完全。
[0010] (4)滅活完全的1型禽腺病毒抗原與礦物油佐劑混合，乳化制備疫苗;通過血清學 方法或攻毒法檢驗疫苗效力，檢驗合格的疫苗即為1型禽腺病毒疫苗。
[0011] 所述的血清學方法包括如下步驟:取3~4周齡SPF雞10-20只各頸部皮下注射疫苗 〇.3mL，另用5-10只雞不接種作為對照;接種后第21日，免疫雞連同對照雞，分別采血、分離 血清，用微量中和試驗法測定血清中和抗體效價;免疫雞血清中和抗體效價幾何平均值不 低于1:000-1:10000,對照雞血清中和抗體效價不高于1:100,則檢驗合格。其中微量中和試 驗法包括如下步驟：
[0012] 1)用細胞生長液(含6 % -10 %新生牛血清的DMEM培養液)懸浮雞胚肝細胞接種96 孔細胞培養板，用于接種的細胞量為個肝細胞/0.1 mL/孔，37 °C、5 % 0)2培養 箱培養24小時，備用。
[0013 ] 2)將被檢樣品用細胞維持液(含2 % -4 %新生牛血清的DMEM培養液)做IO倍系列稀 釋。
[0014] 3)1型禽腺病毒用細胞維持液稀釋至100-1000TCID5Q/0. lmL。
[0015] 4)向步驟2)不同稀釋度的樣品中加入等體積100-1000TCID5Q/0.1mL的1型禽腺病 毒，混勻，37°C孵育1小時。
[0016] 5)棄去96孔細胞培養板中的細胞生長液，用步驟(4)孵育得到的各混合液接種96 孔細胞培養板，〇. 2mL/孔，每個稀釋度6-8孔。
[0017] 6)接種后第7日，顯微鏡下觀察96孔細胞培養板，統計各稀釋度出現、不出現CPE孔 的數量，以Reed-Muench法計算被檢樣品中和效價。
[0018] 所述的攻毒法包括如下步驟：取3~4周齡SPF雞10-20只各頸部皮下注射疫苗 〇.3mL，另用5-10只雞不接種作為對照;接種后第21日，免疫雞連同對照雞各肌肉注射或滴 鼻點眼接種濃度為l〇〇-l〇〇〇〇〇〇〇〇TCID 5Q/0.1mL的1型禽腺病毒液O.lmL;接種病毒后第5日 以棉拭子沾取泄殖腔內容物作為被檢樣品，采集的棉拭子放入裝有0.5-1.OmL含1000單位/ mL青霉素和1000單位/mL慶大霉素的細胞維持液的容器中，進行病毒分尚，對照雞病毒分尚 為80%-100%陽性，免疫雞病毒分離為80%-100%陰性；或接種病毒后10日內，對照雞 40 % -100 %死亡，免疫雞90 % -100 %健活，則檢驗合格。其中病毒分離的方法法包括如下步 驟：
[0019] 1)用細胞生長液懸浮雞胚肝細胞接種6孔細胞培養板，用于接種的細胞量為 1個肝細胞/2mL/孔，37°C、5%CO 2培養箱培養24小時，備用。
[0020] 2)棉拭子在細胞維持液中多次與容器壁擠壓，使病毒粒子釋放到細胞維持液中， 棄去棉拭子，含有病毒粒子的細胞維持液作為被檢樣品備用。
[0021 ] 3)棄去6孔細胞培養板中的細胞生長液，加入2-3mL細胞維持液，將0.3mL-0.5mL被 檢樣品加入6孔板的其中一孔，37 °C、5 % CO2培養箱培養。
[0022] 4)接種后第7日，顯微鏡下觀察6孔細胞培養板，統計各孔出現、不出現CPE的情況； 用間接免疫熒光法檢測6孔板中出現的CPE是否是由1型禽腺病毒感染引起的特異性CPE;出 現特異性CPE的孔所對應的被檢樣品病毒分離為陽性，不出現CPE的孔所對應的被檢樣品病 毒分尚為陰性。
[0023] 所述的1型禽腺病毒疫苗的制備方法的步驟（1)優選為：以14-17日齡雞胚的肝臟 為材料，用胰酶消化使雞胚肝細胞分散，分散的雞胚肝細胞懸浮于細胞生長液中，轉入細胞 培養瓶中37 °C培養;待雞胚肝細胞貼壁并生長至70 % -100 %鋪滿底壁時棄去細胞生長液， 加入細胞維持液，接種1型禽腺病毒，37 °C培養2-4天，待50 % -70 %細胞出現細胞病變時，收 集細胞維持液，即得到1型禽腺病毒抗原。
[0024] 步驟(2)中所述的病毒含量測定的方法優選包括如下步驟：
[0025] 1)用細胞生長液懸浮雞胚肝細胞接種96孔細胞培養板，用于接種的細胞量為 個肝細胞/0.1 mL/孔，37°C、5%CO2培養箱培養24小時，備用。
[0026] 2)將被檢樣品用細胞維持液做10倍系列稀釋。
[0027] 3)將96孔細胞培養板內的細胞生長液棄去，I(T6、1 〇Λ I(T8、I(T9稀釋的被檢樣品接 種96孔細胞培養板，0.1 mL/孔，每個稀釋度6-8個重復孔，置于37 °C、5 % CO2培養箱培養。
[0028] 4)接種后第7日，顯微鏡下觀察96孔細胞培養板，統計各稀釋度出現、不出現CPE孔 的數量，以Reed-Muench法計算被檢樣品TCID5q含量。
[0029]步驟（3)中所述的滅活的方法優選包括如下步驟：向抗原中加入終濃度0.05%_ 0.2 % (v/v)的甲醛或終濃度5mM的二乙烯亞胺，37°C滅活16-32小時，加入終濃度5mM的硫代 硫酸鈉終止滅活。
[0030] 步驟(3)中所述的滅活檢驗的方法優選包括如下步驟步驟(3)中所述的滅活檢驗 的方法包括如下步驟:取〇.2-2mL滅活后的抗原接種培養了 16-24小時的雞胚肝細胞，作為 Fl代;Fl代培養72小時如無細胞病變再接種培養了 16-24小時的雞胚肝細胞，作為F2代;F2 代培養168小時如無細胞病變說明為被檢抗原滅活完全。
[0031] -種1型禽腺病毒疫苗，通過上述方法制備得到。
[0032] -種檢驗1型禽腺病毒疫苗效力的方法，為血清學方法或攻毒法。
[0033]所述的血清學方法包括如下步驟:取3~4周齡SPF雞10-20只各頸部皮下注射疫苗 〇.3mL，另用5-10只雞不接種作為對照;接種后第21日，免疫雞連同對照雞，分別采血、分離 血清，用微量中和試驗法測定血清中和抗體效價;免疫雞血清中和抗體效價幾何平均值不 低于1:000-1:10000,對照雞血清中和抗體效價不高于1:100,則檢驗合格。其中微量中和試 驗法包括如下步驟：
[0034] 1)用細胞生長液懸浮雞胚肝細胞接種96孔細胞培養板，用于接種的細胞量為 個肝細胞/0.1 mL/孔，37°C、5%CO2培養箱培養24小時，備用。
[0035] 2)將被檢樣品用細胞維持液做10倍系列稀釋。
[0036] 3)1型禽腺病毒以細胞維持液稀釋至100-1000TCID5Q/0. lmL。
[0037] 4)向步驟2)不同稀釋度的樣品中加入等體積100-1000TCID5Q/0.1mL的1型禽腺病 毒，混勻，37°C孵育1小時。
[0038] 5)棄去96孔細胞培養板中的細胞生長液，用步驟(4)孵育得到的各混合液接種96 孔細胞培養板，〇. 2mL/孔，每個稀釋度6-8孔。
[0039] 6)接種后第7日，顯微鏡下觀察96孔細胞培養板，統計各稀釋度出現、不出現CPE孔 的數量以Reed-Muench法計算被檢樣品中和效價。
[0040] 所述的攻毒法包括如下步驟：取3~4周齡SPF雞10-20只各頸部皮下注射疫苗 〇.3mL，另用5-10只雞不接種作為對照;接種后第21日，免疫雞連同對照雞各肌肉注射或滴 鼻點眼接種濃度為l〇〇-l〇〇〇〇〇〇〇〇TCID 5Q/0.1mL的1型禽腺病毒液O.lmL;接種病毒后第5日 以棉拭子沾取泄殖腔內容物作為被檢樣品，采集的棉拭子放入裝有0.5-1.OmL含1000單位/ mL青霉素和1000單位/mL慶大霉素的細胞維持液的容器中，進行病毒分尚，對照雞病毒分尚 為80%-100%陽性，免疫雞病毒分離為80%-100%陰性；或接種病毒后10日內，對照雞 40 % -100 %死亡，免疫雞90 % -100 %健活，則檢驗合格。其中病毒分離的方法法包括如下步 驟：
[0041] 1)用細胞生長液懸浮雞胚肝細胞接種6孔細胞培養板，用于接種的細胞量為 1個肝細胞/2mL/孔，37°C、5%CO 2培養箱培養24小時，備用。
[0042] 2)棉拭子在細胞維持液中多次與容器壁擠壓，使病毒粒子釋放到細胞維持液中， 棄去棉拭子，含有病毒粒子的細胞維持液作為被檢樣品備用。
[0043] 3)棄去6孔細胞培養板中的細胞生長液，加入2-3mL細胞維持液，將0.3mL-0.5mL被 檢樣品加入6孔板的其中一孔，37 °C、5 % CO2培養箱培養。
[0044] 4)接種后第7日，顯微鏡下觀察6孔細胞培養板，統計各孔出現、不出現CPE的情況； 用間接免疫熒光法檢測6孔板中出現的CPE是否是由1型禽腺病毒感染引起的特異性CPE;出 現特異性CPE的孔所對應的被檢樣品病毒分離為陽性，不出現CPE的孔所對應的被檢樣品病 毒分尚為陰性。
[0045] -種1型禽腺病毒蛋黃抗體的制備方法，包括如下步驟：
[0046] (1)將通過上述方法制備得到的1型禽腺病毒疫苗多次免疫產蛋雞，用微量中和試 驗法（同上述血清學方法中的微量中和試驗法）測定蛋黃抗體效價，效價達到1:1000-1: 10000以上時，收集雞蛋；
[0047] (2)分離蛋黃，提取蛋黃抗體，使用甲醛或二乙烯亞胺滅活蛋黃抗體；
[0048] (3)用微量中和試驗法測定蛋黃抗體效價，并將蛋黃抗體用PBS或生理鹽水稀釋使 其效價達到預防或治療劑量，得到1型禽腺病毒蛋黃抗體。
[0049] -種1型禽腺病毒蛋黃抗體，通過上述方法制備得到。
[0050] 與已有技術相比，本發明有益效果：
[0051] 1型禽腺病毒能在雞胚、雞胚肝細胞、雞胚腎細胞中繁殖，但經過系統比較，我們發 現以雞胚肝細胞制備抗原的效價高于其他生物材料制備的抗原，本方案選用雞胚肝細胞制 備抗原，進而制備的疫苗性能更優;疫苗免疫雞所產蛋的蛋黃抗體效價高;單獨使用疫苗同 樣具有較好的免疫保護效果。
[0052]有關攻毒法效力檢驗:攻毒法效力檢驗是評判某種疫苗效力的黃金標準、常用標 準，即根據對照雞死亡比例、免疫雞健活比例，評估疫苗的保護效果。本發明所提供的技術 方案，在此基礎上加入對照雞排毒率、免疫雞排毒率的指標，能進一步準確評估疫苗的保護 效果。本發明還提供了靈敏、準確的排毒檢測的技術方案。
[0053]本發明所提供的排毒檢測的技術方案：棉拭子沾取泄殖腔內容物，擠壓棉拭子使 泄殖腔內容物可能含有的目的病毒分散到細胞維持液中，培養于6孔細胞培養板中的雞胚 肝細胞檢測樣品中是否存在病毒，從而判定實驗雞是否排毒。此方案的靈敏性、準確性體現 在：1)使用方案中的棉拭子處理方法，使得加入6孔細胞培養板中的樣品不負面影響細胞生 長狀態，可以接入較大劑量，能夠最大限度、最為準確的檢測樣品中是否含有病毒，即檢測 機體是否排毒;2)通過反復研究我們發現雞胚肝細胞法是最為靈敏的檢測1型禽腺病毒的 方法;3)PCR、膠體金免疫層析法方法等檢測出陽性結果，僅說明被檢樣品含有病毒粒子，但 無法確定是否是活病毒（只有檢測出活病毒才能說明機體排毒），本方案檢測的是活病毒， 檢測出陽性結果能夠說明機體排毒;4)間接免疫熒光定性檢測雞胚肝細胞感染的是否是1 型禽腺病毒，避免雞胚肝細胞感染其他病毒造成的誤判。
[0054]有關血清學方法效力檢驗:減少攻毒實驗的數量是生物安全防范的基本原則、也 是降低生物安全風險的有效手段。1型禽腺病毒是體液免疫為主的疫病，通過研究我們發現 實驗雞血清中和抗體效價與攻毒保護有良好的平行關系。通過檢測實驗雞血清中和抗體效 價能夠評估疫苗的保護效果，是可以替代攻毒法的效力檢驗方法。
[0055]禽用疫苗抗原效價的標定、禽用疫苗滅活抗原的滅活檢驗、蛋黃(或血清）的中和 抗體效價，多使用雞胚為生物載體進行標定。1型禽腺病毒能引起雞胚感染，但感染胚的病 變不明顯，難以與健康胚區分。所以用雞胚法標定抗原效價、做滅活檢驗、測定蛋黃(或血 清）的中和抗體效價，存在技術問題，或無法實現或結果不準確。經研究，1型禽腺病毒能感 染雞胚肝細胞并產生CPE，通過優化實驗參數，確定了使用雞胚肝細胞為生物載體的疫苗抗 原效價的標定方法、抗原的滅活檢驗方法、蛋黃(或血清)的中和抗體效價測定方法。
[0056] 本發明制備的1型禽腺病毒疫苗具有抗原含量高、質量穩定等優點;本發明制備的 1型禽腺病毒蛋黃抗體對1型禽腺病毒有很好的預防和治療效果。
【附圖說明】
[0057] 圖1是顯微鏡下觀察的未被血清中和的病毒感染雞胚肝細胞產生的細胞病變形態 圖。
[0058]圖2是顯微鏡下觀察的被血清完全中和的病毒無法感染雞胚肝細胞的形態圖。
【具體實施方式】
[0059] 下面結合實施例及附圖對本發明作進一步說明。應當理解的是，這些實施例僅僅 是用于進一步解釋和說明本發明，其不應被理解為是對本發明保護范圍的限制。若未特別 指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。
[0060] 下述實施例中用到細胞生長液為含6 % -10 %新生牛血清的DMEM培養液，細胞維持 液為含2 % _4 %新生牛血清的DMEM培養液。
[0061] 實施例1 1型禽腺病毒疫苗的制備
[0062] (1)制備雞胚肝細胞
[0063]取20枚15日齡雞胚，采集肝臟，剪刀剪碎，使組織塊為2mm左右，PBS洗去組織塊表 面血水。向組織中加入0.25 %胰酶80mL，37 °C孵育1小時，棄去胰酶。向組織中加入80mL細胞 生長液，吸管吹打組織，使細胞分散。8層紗布過濾細胞液，向細胞液中補加細胞生長液使體 積為120mL。細胞液平均分裝于3個Tl 82細胞培養瓶。37 °C培養24小時。
[0064] (2)制備抗原
[0065]棄去T182細胞培養瓶中的細胞生長液，每瓶加入細胞維持液40mL，加入1型禽腺病 毒0.1 mL(含IO7TCID5q的1型禽腺病毒），37°C培養72小時，70%的細胞出現細胞病變，收獲細 胞液即為目的抗原。
[0066] (3)測定抗原的病毒含量(TCID5q含量）
[0067] 用細胞生長液懸浮雞胚肝細胞接種96孔細胞培養板，接種量IX IO5個細胞/ 0.1 mL/孔，37°C、5%C02培養箱培養24小時，備用。將被檢抗原用細胞維持液做10倍系列稀 釋。10'1〇Λ 10'HT9稀釋的被檢樣品接種96孔細胞培養板，0.1 mL/孔，每個稀釋度6-8個 重復孔，置于37°C、5%⑶2培養箱培養。接種后第7日，顯微鏡下觀察96孔細胞培養板，統計 各稀釋度出現、不出現CPE孔的數量，以Reed-Muench法計算被檢抗原病毒含量為 10 8.°TCID5〇/0.1mL。
[0068] (4)滅活抗原
[0069] 向120mL抗原中加入終濃度5mM的二乙烯亞胺(BEI)，37°C孵育24小時，加入終濃度 5mM的硫代硫酸鈉終止滅活。
[0070] (5)滅活檢驗
[0071 ]如（1)方法制備雞胚肝細胞，6mL細胞液裝于T25細胞培養瓶中，培養24小時左右， 棄去細胞生長液，加入6mL細胞維持液，取0.2mL滅活后的抗原接種T25細胞培養瓶，作為Fl 代;Fl代37°C培養72小時未見細胞病變，取ImL細胞培養瓶中的細胞維持液接種另一瓶T25 細胞培養瓶中培養至24小時左右的雞胚肝細胞，作為F2代;F2代37°C培養168小時未見細胞 病變。說明為被檢抗原被滅活完全。
[0072] (6)乳化制苗
[0073] 滅活的抗原中加入吐溫80使吐溫80占總體積的4%，混勻即為水相；白油中加入司 本80和硬脂酸鋁，使司本80占總體積的6%、硬脂酸鋁與白油的質量體積比為1.5%，混合加 熱溶解，滅菌后即為油相。水相:油相(體積比）=1:2的比例以剪切機高速剪切，使成為油乳 劑疫苗。如此得到獲得含32 %抗原(滅活病毒液)的疫苗。
[0074]實施例2血清學方法檢驗疫苗效力
[0075] 1)取3~4周齡SPF雞10只各頸部皮下注射實施例1制備的疫苗0.3mL，另用10只雞 不接種作為對照;接種后第21日，免疫雞連同對照雞，分別采血、分離血清，備用。
[0076] 2)用細胞生長液懸浮雞胚肝細胞接種96孔細胞培養板，用于接種的細胞量為IO5 個肝細胞/〇. ImL/孔，37°C、5%CO2培養箱培養24小時，備用。
[0077] 3)將被檢血清樣品用細胞維持液做10倍系列稀釋，獲得1〇Λ 10'10'10'10 一6 稀釋的被檢血清備用。
[0078] 4)1型禽腺病毒用細胞維持液稀釋至1000TCID5Q/0. lmL。
[0079] 5)向步驟2)稀釋的樣品中加入等體積1000TCID5Q/0.1 mL的1型禽腺病毒，混勻，37 °C孵育1小時。
[0080] 6)棄去96孔細胞培養板中的細胞生長液，用步驟(4)孵育得到的各混合液接種96 孔細胞培養板，〇. 2mL/孔，每個稀釋度6-8孔。
[0081] 7)接種后第7日，顯微鏡下觀察96孔細胞培養板，未被血清中和的病毒感染雞胚肝 細胞產生細胞病變(圖1);被血清完全中和的病毒無法感染雞胚肝細胞（圖2)，無細胞病變。 統計各稀釋度出現、不出現CPE孔的數量，以Reed-Muench法計算被檢樣品中和效價。
[0082] 8)經計算免疫雞血清中和抗體分別為25119、25119、3981、10000、31623、10000、 31623、3162、25119、3981，效價幾何平均值為16973，對照雞血清中和抗體效價均不高于1: 31。疫苗效力通過血清學方法檢驗合格。
[0083]實施例3攻毒法檢驗疫苗效力
[0084] 1)取3~4周齡SPF雞10只各頸部皮下注射實施例1制備的疫苗0.3mL，另用10只雞 不接種作為對照；接種后第21日，免疫雞連同對照雞各肌肉注射或滴鼻點眼接種濃度為 100TCID5Q/0.1 mL的1型禽腺病毒液0.1 mL;接種病毒后第5日以棉拭子沾取泄殖腔內容物作 為被檢樣品，采集的棉拭子放入裝有ImL含1000單位/mL青霉素和1000單位/mL慶大霉素的 細胞維持液的容器中。棉拭子在細胞維持液中多次與容器壁擠壓，使病毒粒子釋放到細胞 維持液中，棄去棉拭子，含有病毒粒子的細胞維持液作為被檢樣品備用。
[0085] 2)用細胞生長液懸浮雞胚肝細胞接種6孔細胞培養板，用于接種的細胞量為3 X IO6個肝細胞/2mL/孔，37°C、5 %CO2培養箱培養24小時，備用。
[0086] 3)棄去6孔細胞培養板中的細胞生長液，加入2mL細胞維持液，將0.5mL被檢樣品加 入6孔板的其中一孔，37 °C、5 % CO2培養箱培養。
[0087] 4)接種后第7日，顯微鏡下觀察6孔細胞培養板，統計各孔出現、不出現CPE的情況。 用常規間接免疫熒光法檢測6孔板中出現的CPE是否是由1型禽腺病毒感染引起的特異性 CPE;出現特異性CPE的孔所對應的被檢樣品病毒分離為陽性，不出現CPE的孔所對應的被檢 樣品病毒分離為陰性。
[0088] 5)對照雞病毒分咼為9/10陽性，免疫雞病毒分咼為9/10陰性;接種病毒后10日內， 對照雞4/10死亡，免疫雞10/10健活。疫苗效力通過攻毒法檢驗合格。
[0089] 實施例4 1型禽腺病毒蛋黃抗體的制備
[0090] 將實施例1制備的1型禽腺病毒疫苗免疫產蛋雞100只，頸部皮下注射，ImL/只；間 隔2周進行第二次免疫，頸部皮下注射，ImL/只；間隔2周進行第三次免疫，頸部皮下注射， ImL/只。再間隔2周取當日所產10枚雞蛋，分離蛋黃、混合蛋黃、取樣，用微量中和試驗法測 定樣品抗體效價為1:10000。
[0091 ]收取隨后1周所產雞蛋560枚;蛋黃分離器分離蛋黃，將蛋黃攪拌成均勻膏狀，加入 與蛋黃等體積的注射用水，65°C保溫30分鐘，再加入原蛋黃體積4倍的注射用水，攪拌均勻； 用lmol/L鹽酸調pH值至5.4,4°C靜置12小時;6000r/min離心15分鐘，取上清；向上清液中加 入終濃度0.2 % (v/v)的辛酸，攪拌均勻，4°C放置6小時，濾布過濾去除渣滓，加終濃度0.1 % 的甲醛(v/v)37°C滅活16小時得到蛋黃抗體。以微量中和試驗法測定蛋黃抗體效價為1: 10000ο
[0092]實施例5蛋黃抗體的應用
[0093] (1)6周齡SPF雞60只，分6組，每組10只，飼養于不同隔離器中（見表1)。其中第5組 腿部肌肉接種實施例4制備的蛋黃抗體lmL，6小時后1組、3組、5組腿部肌肉接種1型禽腺病 毒 lOOOTCIDso/O.lmL/只。
[0094] (2)接種后3日，部分病毒接種雞發病，表現為米食量降低、被毛逆立。此時，1號隔 離器中的20只雞各接種實施例4制備的蛋黃抗體ImL。
[0095] (3)各組再觀察21天，各組雞發病、死亡情況見表1。
[0096]表1發病、死亡情況統計表
[0098] (5)各組發病、死亡情況分析
[0099] 比較分析1組、3組數據，說明蛋黃抗體對發病雞或感染雞有治療效果；比較分析2 組、4組數據，說明蛋黃抗體對同居感染雞有預防、治療效果;比較分析3組、5組數據，說明蛋 黃抗體對該病有預防效果。
[0100] 上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式并不受上述實施例的 限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化， 均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護范圍之內。
【主權項】
1. 一種1型禽腺病毒疫苗的制備方法，其特征在于包括如下步驟： (1) 將1型禽腺病毒接種雞胚肝細胞進行培養，待50%-70%細胞出現細胞病變時收獲細 胞，即得到1型禽腺病毒抗原； (2) 測定1型禽腺病毒抗原的病毒含量，含量不低于107'5TCID5Q/0.1mL的抗原用于后續 制備疫苗； (3) 1型禽腺病毒抗原經甲醛或二乙烯亞胺滅活后接種雞胚肝細胞，并盲傳若干代，對1 型禽腺病毒抗原進行滅活檢驗判定是否滅活完全； (4) 滅活完全的1型禽腺病毒抗原與礦物油佐劑混合，乳化制備疫苗;通過血清學方法 或攻毒法檢驗疫苗效力，檢驗合格的疫苗即為1型禽腺病毒疫苗； 所述的血清學方法包括如下步驟：取3~4周齡SPF雞10-20只各頸部皮下注射疫苗 〇.3mL，另用5-10只雞不接種作為對照;接種后第21日，免疫雞連同對照雞，分別采血、分離 血清，用微量中和試驗法測定血清中和抗體效價;免疫雞血清中和抗體效價幾何平均值不 低于1:000-1:10000，對照雞血清中和抗體效價不高于1:100，則檢驗合格;其中微量中和試 驗法包括如下步驟： 1) 用細胞生長液懸浮雞胚肝細胞接種96孔細胞培養板，用于接種的細胞量為個肝細胞/0. lmL/孔，37°C、5% C02培養箱培養24小時，備用； 2) 將被檢樣品用細胞維持液做10倍系列稀釋； 3) 1型禽腺病毒用細胞維持液稀釋至100-1000TCID5Q/0.1mL; 4) 向步驟2)不同稀釋度的樣品中加入等體積100-1000TCID5Q/0. lmL的1型禽腺病毒，混 勻，37 °C孵育1小時； 5) 棄去96孔細胞培養板中的細胞生長液，用步驟(4)孵育得到的各混合液接種96孔細 胞培養板，〇. 2mL/孔，每個稀釋度6-8孔； 6) 接種后第7日，顯微鏡下觀察96孔細胞培養板，統計各稀釋度出現、不出現CPE孔的數 量，以Reed-Muench法計算被檢樣品中和效價； 所述的攻毒法包括如下步驟:取3~4周齡SPF雞10-20只各頸部皮下注射疫苗0.3mL，另 用5-10只雞不接種作為對照;接種后第21日，免疫雞連同對照雞各肌肉注射或滴鼻點眼接 種濃度為l〇〇-l〇〇〇〇〇〇〇〇TCID 5Q/0.1mL的1型禽腺病毒液O.lmL;接種病毒后第5日以棉拭子 沾取泄殖腔內容物作為被檢樣品，采集的棉拭子放入裝有0.5-1.OmL含1000單位/mL青霉素 和1000單位/mL慶大霉素的細胞維持液的容器中，進行病毒分尚，對照雞病毒分尚為80%-100%陽性，免疫雞病毒分離為80%-100%陰性;或接種病毒后10日內，對照雞40%-100%死亡， 免疫雞90%-100%健活，則檢驗合格;其中病毒分離的方法包括如下步驟： 1) 用細胞生長液懸浮雞胚肝細胞接種6孔細胞培養板，用于接種的細胞量為1個肝細胞/2mL/孔，37°C、5% C02培養箱培養24小時，備用； 2) 棉拭子在細胞維持液中多次與容器壁擠壓，使病毒粒子釋放到細胞維持液中，棄去 棉拭子，含有病毒粒子的細胞維持液作為被檢樣品備用； 3) 棄去6孔細胞培養板中的細胞生長液，加入2-3mL細胞維持液，將0.3mL-0.5mL被檢樣 品加入6孔板的其中一孔，37°C、5% C02培養箱培養； 4) 接種后第7日，顯微鏡下觀察6孔細胞培養板，統計各孔出現、不出現CPE的情況;用間 接免疫熒光法檢測6孔板中出現的CPE是否是由1型禽腺病毒感染引起的特異性CPE;出現特 異性CPE的孔所對應的被檢樣品病毒分離為陽性，不出現CPE的孔所對應的被檢樣品病毒分 離為陰性。2. 根據權利要求1所述的1型禽腺病毒疫苗的制備方法，其特征在于:步驟（1)為：以14-17日齡雞胚的肝臟為材料，用胰酶消化使雞胚肝細胞分散，分散的雞胚肝細胞懸浮于細胞 生長液中，轉入細胞培養瓶中37°C培養;待雞胚肝細胞貼壁并生長至70%-100%鋪滿底壁時 棄去細胞生長液，加入細胞維持液，接種1型禽腺病毒，37 °C培養2-4天，待50%-70%細胞出現 細胞病變時，收集細胞維持液，即得到1型禽腺病毒抗原。3. 根據權利要求1所述的1型禽腺病毒疫苗的制備方法，其特征在于:步驟(2)中所述的 病毒含量測定的方法包括如下步驟： 1) 用細胞生長液懸浮雞胚肝細胞接種96孔細胞培養板，用于接種的細胞量為個肝細胞/0. lmL/孔，37°C、5% C02培養箱培養24小時，備用； 2) 將被檢樣品用細胞維持液做10倍系列稀釋； 3) 將96孔細胞培養板內的細胞生長液棄去，10-6、10-7、10-8、ΚΓ 9稀釋的被檢樣品接種96 孔細胞培養板，〇. lmL/孔，每個稀釋度6-8個重復孔，置于37 °C、5% C02培養箱培養； 4) 接種后第7日，顯微鏡下觀察96孔細胞培養板，統計各稀釋度出現、不出現CPE孔的數 量，以Reed-Muench法計算被檢樣品TCID 5Q含量。4. 根據權利要求1所述的1型禽腺病毒疫苗的制備方法，其特征在于:步驟(3)中所述的 滅活的方法包括如下步驟：向抗原中加入終濃度〇 . 〇5%-〇 . 2%的甲醛或終濃度5mM的二乙烯 亞胺，37°C滅活16-32小時，加入終濃度5mM的硫代硫酸鈉終止滅活。5. 根據權利要求1所述的1型禽腺病毒疫苗的制備方法，其特征在于:步驟(3)中所述的 滅活檢驗的方法包括如下步驟:取0.2-2mL滅活后的抗原接種培養了 16-24小時的雞胚肝細 胞，作為F1代;F1代培養72小時如無細胞病變再接種培養了 16-24小時的雞胚肝細胞，作為 F2代;F2代培養168小時如無細胞病變說明為被檢抗原滅活完全。6. -種1型禽腺病毒疫苗，其特征在于:通過權利要求1-5任一項所述的方法制備得到。7. -種檢驗1型禽腺病毒疫苗效力的方法，其特征在于:為血清學方法或攻毒法； 所述的血清學方法包括如下步驟：取3~4周齡SPF雞10-20只各頸部皮下注射疫苗 〇.3mL，另用5-10只雞不接種作為對照;接種后第21日，免疫雞連同對照雞，分別采血、分離 血清，用微量中和試驗法測定血清中和抗體效價;免疫雞血清中和抗體效價幾何平均值不 低于1:000-1:10000，對照雞血清中和抗體效價不高于1:100，則檢驗合格;其中微量中和試 驗法包括如下步驟： 1) 用細胞生長液懸浮雞胚肝細胞接種96孔細胞培養板，用于接種的細胞量為個肝細胞/0. lmL/孔，37°C、5% C02培養箱培養24小時，備用； 2) 將被檢樣品用細胞維持液做10倍系列稀釋； 3) 1型禽腺病毒以細胞維持液稀釋至100-1000TCID5Q/0.1mL; 4) 向步驟2)不同稀釋度的樣品中加入等體積100-1000TCID5Q/0. lmL的1型禽腺病毒，混 勻，37 °C孵育1小時； 5) 棄去96孔細胞培養板中的細胞生長液，用步驟(4)孵育得到的各混合液接種96孔細 胞培養板，〇. 2mL/孔，每個稀釋度6-8孔； 6) 接種后第7日，顯微鏡下觀察96孔細胞培養板，統計各稀釋度出現、不出現CPE孔的數 量，以Reed-Muench法計算被檢樣品中和效價； 所述的攻毒法包括如下步驟:取3~4周齡SPF雞10-20只各頸部皮下注射疫苗0.3mL，另 用5-10只雞不接種作為對照;接種后第21日，免疫雞連同對照雞各肌肉注射或滴鼻點眼接 種濃度為l〇〇-l〇〇〇〇〇〇〇〇TCID 5Q/0.1mL的1型禽腺病毒液O.lmL;接種病毒后第5日以棉拭子 沾取泄殖腔內容物作為被檢樣品，采集的棉拭子放入裝有0.5-1.OmL含1000單位/mL青霉素 和1000單位/mL慶大霉素的細胞維持液的容器中，進行病毒分尚，對照雞病毒分尚為80%-100%陽性，免疫雞病毒分離為80%-100%陰性;或接種病毒后10日內，對照雞40%-100%死亡， 免疫雞90%-100%健活，則檢驗合格;其中病毒分離的方法包括如下步驟： 1) 用細胞生長液懸浮雞胚肝細胞接種6孔細胞培養板，用于接種的細胞量為1個肝細胞/2mL/孔，37°C、5% C02培養箱培養24小時，備用； 2) 棉拭子在細胞維持液中多次與容器壁擠壓，使病毒粒子釋放到細胞維持液中，棄去 棉拭子，含有病毒粒子的細胞維持液作為被檢樣品備用； 3) 棄去6孔細胞培養板中的細胞生長液，加入2-3mL細胞維持液，將0.3mL-0.5mL被檢樣 品加入6孔板的其中一孔，37°C、5% C02培養箱培養； 4) 接種后第7日，顯微鏡下觀察6孔細胞培養板，統計各孔出現、不出現CPE的情況;用間 接免疫熒光法檢測6孔板中出現的CPE是否是由1型禽腺病毒感染引起的特異性CPE;出現特 異性CPE的孔所對應的被檢樣品病毒分離為陽性，不出現CPE的孔所對應的被檢樣品病毒分 離為陰性。8. -種1型禽腺病毒蛋黃抗體的制備方法，其特征在于包括如下步驟： (1) 將通過權利要求1-5任一項所述的方法制備得到的1型禽腺病毒疫苗多次免疫產蛋 雞，以微量中和試驗法測定蛋黃抗體效價，效價達到1:1000-1:10000以上時，收集雞蛋； (2) 分離蛋黃，提取蛋黃抗體，使用甲醛或二乙烯亞胺滅活蛋黃抗體； (3) 用微量中和試驗法測定蛋黃抗體效價，并將蛋黃抗體用PBS或生理鹽水稀釋使其效 價達到預防或治療劑量，得到1型禽腺病毒蛋黃抗體。9. 一種1型禽腺病毒蛋黃抗體，其特征在于:通過權利要求8所述的方法制備得到。
【文檔編號】C07K16/02GK106075427SQ201610506517
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月30日
【發明人】李晶梅, 漆世華, 謝紅玲, 溫文生, 朱薇, 秦紅剛, 馮釗, 王煥君, 王碧群, 靖志強, 李婷婷
【申請人】武漢中博生物股份有限公司