菌株及其應用，以及疫苗及其制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及生物技術領域，特別設及菌株及其應用，W及疫苗及其制備方法。
【背景技術】
[0002] 毛皮動物主要指產品為制裘原料的動物。隨著經濟的發展、人們生活水平的提高 和需求的不斷增長，中國毛皮業呈現出強勁的發展趨勢。我國毛皮動物養殖業主要集中在 山東、河北、迂寧和黑龍江等地，養殖的品種主要有水貂、駱、狐、懶兔，年產水貂皮600萬張、 狐貍皮200萬張，其中狐貍皮占世界總產量的35%，水貂皮占世界總產量的12%。經過多年 的發展和積累，毛皮動物養殖已成為一項優勢產業，我國已成為世界上最大的毛皮產品生 產國和出口國，它的發展不僅為國家賺取了大量外匯，還直接帶動了農業結構的調整，促進 了農民增收，局部地區甚至已成為區域經濟的支柱性產業，對推動農"經濟發展起到了 重要的作用。
[0003] 水貂出血性肺炎是由銅綠假單胞菌引起水貂的一種急性傳染病，多發生于秋季溫 暖潮濕，W咳嗽、呼吸困難、吐血、鼻出血為臨床特癥、W肺大面積出血、肺肝樣變、肺水腫為 主要病變特征，發病率為20 %-50 %，死亡率為100%。病貂發病急，死亡快，常呈地方性暴發 性流行。近年來由于水貂養殖規模和集約化程度明顯提高，水貂出血性肺炎的發病率顯著 上升，該病危害程度逐年加深，已成為危害我國水貂養殖的主要傳染病之一。
[0004] 鑒于該病的發病特點及該菌易產生耐藥性問題，用藥物治療該病往往很困難，滅 活疫苗是預防該病的最有效方法，將水貂中流行的血清型的菌株滅活后制備成多價滅活疫 苗，可有效預防同類血清型菌株引起的該病，"水貂銅綠假單胞菌分離株的生物學特性比較 分析和血清型調查"（白雪，柴秀麗，國喜軍，高哈，張海玲，趙建軍，張蕾，邵西群，羅國良，王 長鳳'水貂出血性肺炎二價滅活疫苗及其制備方法"（專利號：ZL201010203879.1，國喜 軍、白雪、柴秀麗、羅國良、趙建軍、張海玲、邵西群、張蕾、高哈，）公開了我國引起水貂出血 性肺炎的銅綠假單胞菌的主要血清型為G型和B型，并利用運巧巾血清型菌株化15(國家菌種 保藏號CGMCC NO. 3811)和化08(國家菌種保藏號CGMCC NO. 3812)研制出了可用于預防水貂 出血性肺炎的二價滅活疫苗，2011年該產品獲得了農業部的臨床試驗批件，并同時進行了 臨床推廣應用。2016年獲得了國家新獸藥證書(=類）。
[0005] 水貂病毒性腸炎是水貂腸炎細小病毒(Mink enteritis parvovirus ,MEV)引起的 W劇烈腹瀉為主要臨床特癥的急性烈性、高度接觸性傳染病，其死亡率高達80% W上，該病 在世界范圍內廣泛流行，在自然條件下，不同品種和不同年齡的貂均有感染性，但幼貂的感 染性極強，隨著特種養殖業的發展，病毒性腸炎已經成為危害水貂養殖的=大疫病之一，給 養貂業帶來巨大的經濟損失，1947年由加拿大學者Schofield最早發現并報道了 MEV引起的 疾病。1981年姜廷秀等首先報道了我國發生水貂病毒性腸炎，此后該病逐漸蔓延全國，給養 貂業帶來巨大的經濟損失。我單位吳威等用單克隆抗體對我國分離的水貂腸炎細小病毒進 行系統分型，確定我國水貂腸炎細小病毒主要由B型細小病毒引起，在此基礎上選育出毒力 穩定、免疫原性良好的病毒株MEVB株，并研制出水貂細小病毒滅活疫苗，2010年獲得了國家 新獸藥證書(=類），并迅速在市場上應用。使該病得到較好的控制。
[0006] 目前國內還未有水貂細小病毒性腸炎、水貂出血性肺炎的二聯疫苗，市場上也無 該種二聯苗使用。而使用單苗需要對水貂進行多次免疫，免疫劑量大，免疫程序繁瑣，增加 了人力、物力和財力成本，同時還易引起水貂的應激反應。
[0007] 本項目在研究成功水貂細小病毒性腸炎和水貂出血性肺炎的基礎上開發"一針防 兩病"的水貂細小病毒性腸炎和出血性肺炎二聯滅活疫苗，技術上攻克了聯苗中的兩種成 分細小病毒和銅綠假單胞菌的抗原成分互相干擾、疫苗含量配比及生產工藝的問題。本研 究在水貂出血性肺炎二價滅活疫苗研制的基礎上，在疫苗株中新加入了近幾年出現的流行 株I型、C型和F型，制備為水貂出血性肺炎五價滅活疫苗(G型、B型、I型、C型和F型），能夠對 水貂出血性肺炎新的血清型菌株的流行起到很好的預防作用，可解決國內原有疫苗的對該 病只能提供部分保護的問題，更為有效預防水貂出血性肺炎的發生。
[0008] 通過對二聯疫苗的研制及關鍵技術創新，研制出一種高效、副作用小、市場推廣可 行的二聯苗，解決了單苗免疫程序上的復雜問題，滿足行業和養殖戶的迫切需求，具有廣闊 的市場應用前景。
[0009] 現有技術是用轉瓶通氣的培養技術將運兩株銅綠假單胞菌用PYG培養基增菌培 養，37°C 18化/m搖床培養12h后收菌，用細菌平板計數法測定兩株菌的菌量分別達到40X IO8CFlVml，將G型菌株和B型菌株按2:1的比例混合；（1)用終濃度為0.15%的甲醒溶液對銅 綠假單胞菌進行滅活，于37°C滅活2地，期間振搖2~3次；（2)將滅活后的菌液加20%比例的 氨氧化侶膠，混勻后即可得到水貂銅綠假單胞菌多價滅活疫苗。原有的培養基:PYG培養基 成份:蛋白腺2%，葡萄糖1 %，氯化鋼0.5%，酵母粉0.3%，用去離子水配制，配完調pH值7.2 ~7.4,116°C 30min。但是使用轉瓶通氣培養菌體，接種比例為3%~4%，通氣培養12~ 15h，由于疫苗的轉瓶生產工藝落后，轉瓶數目較多接菌時易于污染，培養時間長，生產菌數 少，在20~40億CRJ/ml之間，只適用于疫苗研制前期的小批量生產。
[0010] 選用銅綠假單胞菌的當前主要流行血清型G、B型和肺炎克雷伯菌Kl型3種菌株制 備成滅活疫苗。免疫了 WlO%滅活肺炎克雷伯困為佐劑的疫苗，保護率為83% ;免疫了 W 10%A1(0H)3佐劑的疫苗，保護率為71%;而作為空白對照組，僅注射了生理鹽水的第6組小 鼠的存活率為33%。相對于傳統的A1(0H)3佐劑，肺炎克雷伯菌本身可W作為疫苗成分，保 護機體免于該病原菌的感染，同時又兼有良好的免疫調節活性，加強了機體對銅綠假單胞 菌的免疫應答，產生了更高的抗體水平和提供了更好的免疫保護，獸醫臨床具有一定的應 用價值。
[0011] W上幾種研制的水貂出血性肺炎中使用的疫苗株血清型主要包含2種或3種，即G 型，B型，或G型、C型、I型，根據本單位進行的水貂出血性肺炎流行病學調查，2010年至2015 年的流行血清型新出現了F型、I型和C型，而由于各種流行血清型之間的交叉保護率低，大 約為20%-30%。所W有必要加入所有可能的流行血清型。

【發明內容】

[0012] 有鑒于此，本發明提供了菌株及其應用，W及疫苗及其制備方法。該疫苗免疫期為 6個月，免疫保護率80% W上，可同時用于預防水貂細小病毒性腸炎和水貂出血性肺炎的， 減少了養殖戶的免疫工作量和水貂應激反應，市場應用前景較好。
[0013] 為了實現上述發明目的，本發明提供W下技術方案：
[0014] 本發明提供了 一種銅綠假單胞菌株，其保藏編號為CGMCC No. 11988。
[0015] 本發明還提供了一種銅綠假單胞菌株，其保藏編號為CGMCC No. 11990。
[0016] 本發明還提供了一種銅綠假單胞菌株，其保藏編號為CGMCC No. 11989。
[0017] 本發明還提供了保藏編號為CGMCC No. 11988、CGMCC No. 11990和CGMCC No. 11989 的銅綠假單胞菌株在制備水貂出血性肺炎疫苗中的應用。
[001 引本發明還提供了保藏編號為CGMCC No. 11988、CGMCC No. 11990和CGMCC No. 11989 的銅綠假單胞菌株在制備水貂細小病毒性腸炎、出血性肺炎二聯滅活疫苗中的應用。
[0019]本發明提供了一種水貂出血性肺炎疫苗，由本發明保藏編號為CGMCC No. 11988、 CGMCC No. 11990和CGMCC No. 11989的銅綠假單胞菌株W及水貂銅綠假單胞菌G型化15株、B 型化08株制得。
[0020] 本發明還提供了一種水貂細小病毒性腸炎、出血性肺炎的二聯滅活疫苗，由本發 明保藏編號為CGMCC No. 11988、CGMCC No. 11990和CGMCC No. 11989的銅綠假單胞菌株W及 水貂銅綠假單胞菌G型化15株、B型化08株和水貂細小病毒毒株MEVB株制得。
[0021] 在本發明的一些具體實施方案中，二聯滅活疫苗的制備方法包括如下步驟：
[0022] 步驟 1:取本發明保藏編號為CGMCC No.11988、CGMCC No.11990和CGMCC No.11989 的銅綠假單胞菌株W及水貂銅綠假單胞菌G型DL15株、B型化08株分別接種于培養基培養后 混合、滅活后制得滅活后銅綠假單胞菌五價苗半成品菌液；
[0023] 步驟2:取水貂細小病毒毒株MEVB株接種細胞，收獲、滅活制得細小病毒半成品；
[0024] 步驟3:取步驟1制得的滅活后銅綠假單胞菌五價苗半成品菌液與步驟2制得的細 小病毒半成品混合制得混合液；
[0025] 步驟4:取步驟3制得的混合液與佐劑混合。
[0026] 在本發明的一些具體實施方案中，