一種雞新城疫二聯體疫苗及其制備方法
【專利摘要】本發明屬于動物疫苗制備【技術領域】，具體涉及一種以HN蛋白和雞α干擾素為有效成分的二聯體疫苗及其制備方法。該二聯體疫苗，通過利用基因工程技術將HN基因和雞α干擾素基因轉化感染BHK-21細胞并充分表達獲得目的蛋白，將目的蛋白與佐劑混合制備而得疫苗。利用HN基因與雞α干擾素基因表達蛋白制備的二聯體疫苗注入雞體內時，HN蛋白和α干擾素在雞體內發揮各自生物學功能，在預防雞新城疫病毒感染同時，還具有積極的預防和治療其他種類病毒感染的效果，疫苗總體安全可靠，能夠長時間地、持續地誘導機體產生特異性抗體，提高雞的免疫力，較好的克服了傳統疫苗單一預防一種疾病的不足。
【專利說明】一種雞新城疫二聯體疫苗及其制備方法
【技術領域】[0001]本發明屬于動物疫苗制備【技術領域】，具體涉及一種以HN蛋白和雞α干擾素(a -1FN)為有效成分的二聯體疫苗及其制備方法。
【背景技術】
[0002]家禽養殖過程中，隨著病原菌新菌株、變異株的不斷出現，原來對某些畜禽疫病具有較好防治效果的藥物已逐漸難以達到較為滿意的治療效果。近年來，隨著家禽養殖過程中病毒性疾病危害的日益嚴重，我國在疾病預防控制的疫苗產品制備方面投入了巨大的人力、物力和財力，對控制疾病的大規模流行擴散起到了關鍵的預防作用。
[0003]雞新城疫(Newcastle disease, ND)疾病是一種由新城疫病毒引起的一種高度接觸性、急性敗血性傳染病，是目前危害養禽業發展最為嚴重的傳染病之一，因此又被稱亞洲雞瘟或偽雞瘟。目前對雞新城疫病主要以早期注射疫苗預防為主。
[0004]HN蛋白是雞新城疫病毒的主要結構蛋白，具有良好的免疫原性和反應原性，已被用于制備雞新城疫疾病預防的亞單位疫苗。雞α干擾素既具有抗病毒活性又具有免疫調節和疫苗佐劑的作用，在雞新城疫疾病的預防和治療過程中用途較為廣泛。
[0005]現有技術中，單獨利用HN蛋白制備預防雞新城疫疾病的亞單位疫苗已有較多研究，利用雞α干擾素(α-1FN)作為疫苗來提高雞免疫力或預防治療疾病也有很多報道，但尚未見到將兩者進行結合共同制備預防雞新城疫疾病的疫苗的相關報道。

【發明內容】

[0006]本發明目的在于通過基因工程手段將HN基因和雞α干擾素基因共同轉化入真核系統進行表達，將表達獲得的目的蛋白用于制備預防雞新城疫疾病的二聯體疫苗。
[0007]一種預防雞新城疫疾病的二聯體疫苗，通過以下方法制得:
(1)利用PCR技術擴增雞α干擾素基因，利用RT-PCR技術擴增雞新城疫病毒HN基因；
(2)將步驟(1)獲得的HN基因和雞α干擾素基因克隆到真核表達載體質粒pcDNA3.1中，構建重組真核雙表達載體質粒pcDNA3.1-1FN-HN ；
(3)將步驟(2)獲得的重組真核雙表達載體質粒pcDNA3.1-1FN-HN轉染ΒΗΚ-21細胞進行ZeocinTM抗性篩選；
(4)將步驟(3)篩選所得陽性細胞進行培養，使HN基因和雞α干擾素基因得到充分表
達；
(5)將步驟(4)HN基因和雞α干擾素基因所表達蛋白回收純化獲得目的蛋白；
(6)將步驟(5)所獲得的目的蛋白與佐劑混合制備預防雞新城疫疾病的二聯體疫苗。
[0008]所述預防雞新城疫疾病的二聯體疫苗，步驟(6)中所述目的蛋白與佐劑殼聚糖的質量比為1:1。
[0009]所述預防雞新城疫疾病的二聯體疫苗的制備方法，包括以下步驟:
(I)利用PCR技術擴增雞α干擾素基因，利用RT-PCR技術擴增雞新城疫病毒HN基因；(2)將步驟(1)獲得的HN基因和雞α干擾素基因克隆到真核表達載體質粒pcDNA3.1中，構建重組真核雙表達載體質粒pcDNA3.1-1FN-HN ；
(3)將步驟(2)獲得的重組真核雙表達載體質粒pcDNA3.1-1FN-HN轉染ΒΗΚ-21細胞進行ZeocinTM抗性篩選；
(4)將步驟(3)篩選所得陽性細胞進行培養，使HN基因和雞α干擾素基因得到充分表
達；
(5)將步驟(4)HN基因和雞α干擾素基因所表達蛋白回收純化獲得目的蛋白；
(6)將步驟(5)所獲得的目的蛋白與佐劑混合制備預防雞新城疫疾病的二聯體疫苗。
[0010]步驟(6)中所述目的蛋白與佐劑殼聚糖的質量比為1:1。
[0011]目前許多藥物對某些畜禽疫病已經難以顯示滿意的防治效果，尤其是病毒性疾病的危害日益嚴重，因此迫切需要找到一種有效的防治方法。干擾素(IFN)作為一組具有多種功能的活性蛋白質，在具有廣譜性的抗病毒作用的同時，還影響細胞的生長，以及分化、免疫功能調節的多種功能的發揮，因此在疫苗制備【技術領域】具有較為廣泛的用途。傳統的動物干擾素因其直接生產成本高、產品質量難控制、種間差異大和干擾素在動物體內不能長期穩定存在等原因，其應用范圍較為有限，而利用基因工程技術制備的重組干擾素，因其制備純度和效率遠高于傳統技術，因此具有較大的市場潛力和競爭力。
[0012]發明人利用基因工程技術創新性的將雞新城疫病毒HN基因與雞α干擾素基因同時轉入真核表達系統，通過誘導、表達、純化，可同時獲得大量的目的蛋白。利用HN基因與雞α干擾素基因表達蛋白制備的二聯體疫苗注入雞體內時，HN蛋白和a-1FN在雞體內發揮各自生物學功能，在預防雞新`城疫病毒感染同時，還具有積極的預防和治療其他種類病毒感染的效果，疫苗總體安全可靠，能夠長時間地、持續地誘導機體產生特異性抗體，提高雞的免疫力，較好的克服了傳統疫苗單一預防一種疾病的不足。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]圖1為雞α -干擾素基因PCR擴增產物；
圖2為雞HN基因RT-PCR擴增產物；
圖3為重組質粒pcDNA3.1-1FN-HN及其EcoR I和HindIII雙酶切鑒定結果；
圖4為重組質粒pcDNA3.1-1FN-HN及其BamHI和SalI雙酶切鑒定結果；
圖5為ZeocinTM抗性篩選下的細胞形態，其中A為轉染質粒pcDNA3.1-1FN-HN的BHK-21細胞，B為轉染質粒pcDNA3.1的BHK-21細胞，C為轉染PBS的BHK-21細胞空白對照，D為未轉染的BHK-21細胞空白對照；
圖6為轉染的BHK-21細胞中表達蛋白的IFA檢測結果，其中A為轉染質粒pcDNA3.1-1FN-HN的BHK-21細胞HN蛋白的IFA檢測結果，B為轉染質粒pcDNA3.1-1FN-HN的BHK-21細胞a -1FN的IFA檢測結果，C為轉染質粒pcDNA3.1的BHK-21細胞WA檢測結果，D為未轉染的BHK-21細胞IFA檢測結果；
圖7表達產物的Western-bloting鑒定，其中條帶I為pcDNA3.1-1FN-HN表達蛋白的Western-blotting檢測,條帶2為標準低分子量蛋白質。
【具體實施方式】[0014]下面結合實施例對本發明做進一步的解釋說明。
[0015]實施例1
本實施例著重描述雞新城疫二聯體疫苗的制備過程。
[0016]本發明的二聯體疫苗的制備過程大體上包括以下步驟:
(1)利用PCR、RT-PCR技術分別克隆雞a-1FN基因和雞新城疫病毒HN基因；
(2)將HN基因和雞a-1FN基因克隆到真核表達載體pcDNA3.1中，構建重組真核雙表達載體pcDNA3.1-1FN-HN, PCR及酶切鑒定篩選正向陽性克隆；
(3)重組質粒pcDNA3.1-1FN-HN轉染BHK-21細胞，然后進行ZeocinTM抗性篩選；
(4)針對篩選的陽性細胞進行間接免疫熒光(IFA)和利用Western-blotting技術檢測目的蛋白HN和a -1FN在ΒΗΚ-21細胞中的表達；
(5)利用蛋白純化技術純化目的蛋白；
(6)收獲目的蛋白，配合佐劑制備二聯體疫苗。
[0017]具體制備過程如下:
(I)利用PCR、RT-PCR技術分別克隆雞新城疫病毒HN基因和雞a -1FN基因 雞新城疫HN基因與雞a-1FN基因的引物設計` 根據已知的雞新城疫病毒的HN基因和雞a -1FN基因組序列，設計了雞HN基因Ρ1、Ρ2的PCR引物及雞α-1FN基因的Ρ3、Ρ4的PCR引物。
[0018]Pl 5' -ACA GAA TCC GTT CTA CCA CAT CAC C 一 3'
Ρ2 5' — GTC AAG CTT CCA ACC ATC CTA TGA T 一 3'
Ρ3 5' — ATA GGA TCC AAC ATG CCT GGG CCA TCA G — 3'
Ρ4 5' — TCC GTC GAC TTA GCG CAT GGT GCG G — 3'
引物Pl帶有EcoR I酶切位點，引物Ρ2帶有HindIII酶切位點，引物Ρ3帶有BamH I酶切位點，引物Ρ2帶有SalI酶切位點，Pl和Ρ2引物之間所擴增片斷長約1.8Κρ，Ρ3和Ρ4引物之間所擴增片斷長約582bp，引物由寶生物工程(大連)有限公司合成。
[0019]PCR擴增雞a-1FN基因
以Ρ3、Ρ4為引物，以重組質粒pMD-T-1FN-a為模板，進行PCR擴增。
[0020]PCR反應采用50 μ L反應體系，在50 μ L反應體系中加入:10 X PCR buffer 5 μ L，dNTP 2 μ L，模板I μ L，上、下游引物各I μ L，Taq酶0.5 μ L，滅菌水39.5 μ L，總體積50 μ L。混合均勻后蓋緊管口放入PCR儀內擴增反應。
[0021]PCR反應條件:95°C預變性8min后進入循環，94°C變性lmin，58°C退火lmin，72°C延伸Imin, 30個循環后，72°C再延伸lOmin。
[0022]用1%的瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產物，用tiangen凝膠回收試劑盒回收PCR產物，tiangen凝膠回收試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司，得到約582bp的PCR產物，見圖1。
[0023]RT-PCR擴增雞HN基因
按照TRIzoI法對其雞新城疫病毒基因組RNA進行提取。
[0024]以P1、P2為引物，以雞新城疫病毒基因組RNA為模板進行RT-PCR擴增。
[0025]RT-PCR反應采用50 μ L反應體系，在50 μ L反應體系中加入:10XPCR buffer5 μ L，dNTP 2 μ L，模板I μ L，上、下游引物各I μ L，Taq酶0.5 μ L，滅菌水39.5 μ L，總體積50 μ L。混合均勻后蓋緊管口放入PCR儀內擴增反應。
[0026]RT 反應條件如下:70°C，5min ；42°C，Ih ；95°C，5min ；4°C，5 min。
[0027]PCR反應條件:94°C預變性5min后進入循環，94°C變性lmin，58°C退火lmin，72°C延伸2.5min, 30個循環后，72°C再延伸lOmin。
[0028]用1%的瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產物，用tiangen凝膠回收試劑盒回收PCR產物，tiangen凝膠回收試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司，得到約1.SKp的PCR產物，見圖2。
[0029](2)將HN基因和雞a -1FN基因克隆到真核表達載體pcDNA3.1中，構建重組真核雙表達載體pcDNA3.1-1FN-HN, PCR及酶切鑒定篩選正向陽性克隆
用BamH I和SalI將PCR擴增回收的雞a -1FN基因及目的載體pcDNA3.1雙酶切，然后進行連接。將連接產物轉化至DH5a中，挑取克隆進行酶切鑒定。結果表明酶切片段與預期大小一致，重組質粒(pcDNA3.1-1FN)構建成功。
[0030]用EcoR I和HindIII將PCR擴增回收的雞HN基因及目的載體pcDNA3.1進行雙酶切，然后進行連接。將連接產物轉化至DH5 α中，挑取克隆進行酶切鑒定。結果表明酶切片段與預期大小一致，重組質粒(pcDNA3.1-1FN-HN)構建成功。
[0031]重組載體質粒(pcDNA3.1-1FN-HN)轉化大腸桿菌感受態細胞后，第二天挑取陽性單個菌落過夜培養后，提取質粒進行EcoR I和HindIII雙酶切，得到約1.8kb和6.0Kp兩條片段與預期要求相符合，見圖3 ;再將提取的質粒進行BamHI和SalI雙酶切，得到約582bp和7.2Kp兩條片段與預期要求相符合，見圖4。
[0032](3)重組質粒pcDNA3.1-1FN-HN轉染ΒΗΚ-21細胞，然后進行ZeocinTM抗性篩選 重組質粒pcDNA3.1-1FN-HN轉染ΒΗΚ-21細胞
按LipofectamineTM 2000試劑盒(購自Invetrogen公司)說明書進行轉染,所用培養液均不含有抗生素和血清。
[0033]具體操作步驟如下:
取25 μ g載體質粒pcDNA3.1-1FN-HN和1 μ g雞HN基因組RNA (按照本領域常規方法從病雞的十二指腸中提取)，加入94 μ L DMEM培養液(購自美國英杰生命技術有限公司)中，輕輕混勻，室溫靜置15min備用。
[0034]另取1OyL 脂質體 2000 (LipofectamineTM 2000)加入 90yL DMEM 培養液中，輕輕混勻后室溫靜置15min備用。
[0035]將上述兩者混合得混合液a，室溫靜置30 — 45min。
[0036]將轉染用的BHK-21細胞棄去上清，取200 μ L混合液a加入已準備好的單層BHK-21細胞上，再加入800 μ LDMEM培養液，輕輕混勻后，置于37°C 5% CO2培養箱中培養4 — 5h。
[0037]吸出轉染混合液，加入含有10%胎牛血清和100U/mL青、鏈霉素的DMEM培養液繼
續培養。
[0038]ZeocinTM 抗性篩選
將未轉染BHK-21細胞傳代培養，用含O, 50，125，250，500，750和I 000 μ g / mL不同ZeocinTM濃度的選擇培養液代替含雙抗的細胞培養液培養，隔3—4 d換液傳代培養，并適時觀察細胞的存活比率，最終確定細胞正常生長的最高ZeocinTM濃度為SOyg /mL。[0039]將轉染pcDNA3.l-1FN-HN質粒的BHK-21細胞在含更高的ZeocinTM濃度培養基中(IOOyg / mL)培養5— 6代，直至培養液中無死亡細胞出現。將細胞轉入96孔板繼續培養并做10—1 —10_12的稀釋，得到一個由單細胞克隆擴大培養出的細胞系，命名為BHK-1FN.HN(圖5-A);轉染pcDNA3.1質粒的BHK-21細胞中也篩選出一株ZeocinTM抗性細胞(圖5-B);而轉染PBS和未轉染質粒的BHK-21對照細胞則在抗性壓力下逐漸脫落死亡(圖 5-C，D)。[0040](4)針對篩選的陽性細胞進行間接免疫熒光(IFA)和利用Western-blotting技術檢測目的蛋白HN和a -1FN在ΒΗΚ-21細胞中的表達
對篩選的陽性細胞進行間接免疫熒光 具體步驟如下:
用含4%的多聚甲醛固定篩選的朋1(-21細胞401^11，？851'洗滌后再用0.5%1'1^0凡/PBS冰上穿透10min，0.1%的BSA室溫封閉20 min。
[0041]抗HN蛋白單抗(1:500稀釋)和抗a-1FN的單抗(1:200稀釋)分別為一抗孵育30 min，FITC標記的羊抗小鼠IsG 二抗(I:1 000)孵育30 min，PBST洗滌后熒光顯微鏡下
觀察結果。
[0042]借助熒光顯微鏡可以看到轉染pcDNA3.1-1FNa-HN的BHK-21細胞中均散在大量的熒光(圖6-A，B)，而轉染pcDNA3.1空質粒和未轉染的細胞中則沒有熒光(圖6_C，D)。結果表明，pcDNA3.1-1FNa -HN重組質粒在BHK-21細胞中成功共表達了 HN和IFNa蛋白。
[0043]Western-blotting 檢測
重懸篩選出的陽性BHK-21細胞，離心后用PBS (pH7.4)緩沖液漂洗菌體沉淀2次，后重懸于100 μ L PBS中，加入2 X蛋白電泳上樣緩沖液100 μ L。
[0044]將100 μ L細胞培養液上清進行相同的處理后，分別于100°C煮沸5 min，經12
000r / min離心15 min后取上清液10 μ L進行SDS — PAGE蛋白電泳，然后轉移至NC膜上進行Western-blotting分析。所用一抗為抗6xHis標簽單抗(1:500稀釋),二抗為HRP標記的羊抗小鼠IgG(l:1 000稀釋)，用DAB作為底物進行顯色反應。
[0045]Western-blotting檢測目的蛋白反應原性的具體步驟如下:
A.轉印剪8塊濾紙與I塊硝酸纖維素膜(NC)，大小與凝膠相等，在轉移緩沖液中浸泡5min，在正極板上按4層濾紙、NC膜、凝膠、4層濾紙的順序疊放整齊，確定無氣泡后蓋上負極板，按膠體積0.65mA/cm2轉移2h。
[0046]B.封閉轉移完成后，取下NC膜，切下標準分子量Marker，置氨基黑染色液中浸染20min，取出后用漂洗脫色，直至背景藍色脫盡。其余NC膜用PBS沖洗，加入IOml封閉液，室溫輕輕振搖l_2h。
[0047]C.與抗體的結合封閉結束后，用PBS沖洗NC膜4~5次，加入PBST按照
1: 1000倍稀釋的偽狂犬陽性血清10mL，37°C結合3 h，用PBST沖洗4~5次，每次在搖床緩慢搖動。加入1: 500倍稀釋的兔抗豬IgG(二抗)，室溫下輕搖孵育lh，取出用PBST沖洗3~4次，每次IOmin0
[0048]D.底物顯色將NC膜轉移到IOmL底物溶液中，室溫避光輕搖3min觀察顯色情況，等出現明顯條帶時，立即轉入PBST緩沖液中終止顯色，室溫保存。
[0049]Western blotting檢測結果顯示,在BHK-21細胞條帶中，74.6KD及19 ku附近出現2條陽性條帶，大小與表達HN和α-1FN蛋白的預期相一致，表明兩種蛋白在BHK-21細胞中得到了很好的表達，但細胞上清中未見表達蛋白條帶，見圖7。
[0050]( 5 )利用蛋白純化技術純化目的蛋白；
將重組菌IOyL接種至3mL、2XYT培養液(100 μ g/mLKan+)中，37°C培養過夜。取過夜培養物2mL接種于500mL 2 X YT培養液中，劇烈振搖至0D600為0.6~1.0時，加入IPTG至終濃度0.8mmol/L, 37°C誘導表達4h以上。
[0051]包涵體的制備與蛋白質的變性溶解:(1)將上述誘導后的重組菌5000r/min離心15min，棄上清，用蒸餾水洗2次，再用1/10原培養體積的TEl緩沖液重懸細菌沉淀。
(2)裂解細菌在細菌懸液中加入溶菌酶至終濃度為200mg/L (約40 μ L、50mg/mL的貯液)和1/10體積的1% TritonX-100，30°C作用15~30min后，于冰浴中超聲裂解細菌(80W、作用3s、間隔9s、99次)，此時溶液由粘稠變為清亮。4°C下10000r/min離心lOmin，收集包涵體沉淀。(3)洗滌分別用TE2、TE3緩沖液各洗滌包涵體沉淀2次(重懸包涵體，分別作用lOmin)，4°C，10 000r/min離心lOmin，收集沉淀。(4)變性加IOmL變性液溶解沉淀，室溫放置Ih以上。4°C下12000r/min離心lOmin，收集變性溶解的上清液，去除不溶性雜質。
[0052]HN蛋白的復性及純化:利用分光光度計測定變性溶解的重組菌HN蛋白濃度，分別在變性液中加入相應體積的稀釋液，調整其蛋白終濃度在100mg/L以下，并使溶液中尿素濃度保持在lmol/L。然后加入還原型谷胱苷肽(GSH)和氧化型谷胱苷肽(GSSG)，使其終濃度分別達到0.9mmol/L和0.lmmol/L，4°C放置20h以上對HN蛋白進行復性。復性后用緩沖液透析48h,每隔6h換液I次。透析完全后溶液中應不含尿素,再用PEG-20000濃縮透析液。將復性后的蛋白過濾除菌。
`[0053]復性的HN蛋白經濃縮后，經紫外分光光度計測定樣品在A260nm和A280nm波長的光吸收值，按照公式計算樣品中蛋白質濃度:蛋白質濃度(mg/mL) = (l.45XA280 一
0.74XA260)X稀釋倍數。蛋白質純度測定用SDS-PAGE電泳檢測純化的蛋白，用薄層掃描儀掃描分析目的蛋白的純度。
[0054]( 6 )收獲目的蛋白，配合佐劑制備二聯體疫苗。
[0055]將收獲的目的蛋白與佐劑殼聚糖按1:1比例混合制成二聯體疫苗。
[0056]實施例2
為進一步檢驗本發明所制備的二聯體疫苗的針對新城疫病毒的預防效果，發明人做了進一步的動物學實驗。
[0057]選取血清學為ND陰性的5日齡健康雛雞80只，隨機分成4組，分別為:空白對照組(用常規菌體苗0.5ml/只)、二聯體疫苗低劑量組(0.3ml/只)、中劑量組(0.5ml/只)、高劑量組(0.8ml/只)，每組20只。
[0058]利用實施例1所提供的制備雞新城疫HN和a -1FN 二聯體疫苗的方法，制備二聯體疫苗，于雛雞頸部皮下接種，具體的對比處理如下表所示
表1試驗雞分組與處理 miI劑量/ (mi/只)I試驗雞數/只I給藥途徑
空白對照組_05_20_頸部皮下接種
而和IFN-α亞單位疫苗低劑量組 0.320頸部皮下接種.涵和IFN-α亞單位疫苗中劑量組 |θ.5|20I頸部皮下接種
【權利要求】
1.一種預防雞新城疫疾病的二聯體疫苗，其特征在于，該疫苗通過以下方法制得:(1)利用PCR技術擴增雞α干擾素基因，利用RT-PCR技術擴增雞新城疫病毒HN基因； (2)將步驟(1)獲得的HN基因和雞α干擾素基因克隆到真核表達載體質粒pcDNA3.1中，構建重組真核雙表達載體質粒pcDNA3.1-1FN-HN ； (3)將步驟(2)獲得的重組真核雙表達載體質粒pcDNA3.1-1FN-HN轉染ΒΗΚ-21細胞進行ZeocinTM抗性篩選；(4)將步驟(3)篩選所得陽性細胞進行培養，使HN基因和雞α干擾素基因得到充分表達；(5)將步驟(4)HN基因和雞α干擾素基因所表達蛋白回收純化獲得目的蛋白；(6)將步驟(5)所獲得的目的蛋白與佐劑混合制備預防雞新城疫疾病的二聯體疫苗。
2.如權利要求1所述預防雞新城疫疾病的二聯體疫苗，其特征在于，步驟(6)中所述目的蛋白與佐劑殼聚糖的質量比為1:1。
3.權利要求1所述預防雞新城疫疾病的二聯體疫苗的制備方法，包括以下步驟:(1)利用PCR技術擴增雞α干擾素基因，利用RT-PCR技術擴增雞新城疫病毒HN基因； (2)將步驟(1)獲得的HN基因和雞α干擾素基因克隆到真核表達載體質粒pcDNA3.1中，構建重組真核雙表達載體質粒pcDNA3.1-1FN-HN ； (3)將步驟(2)獲得的重組真核雙表達載體質粒pcDNA3.1-1FN-HN轉染ΒΗΚ-21細胞進行ZeocinTM抗性篩選；(4)將步驟(3)篩選所得陽性細胞進行培養，使HN基因和雞α干擾素基因得到充分表達；(5)將步驟(4)HN基因和雞α干擾素基因所表達蛋白回收純化獲得目的蛋白；(6)將步驟(5)所獲得的目的蛋白與佐劑混合制備預防雞新城疫疾病的二聯體疫苗。
4.如權利要求3所述預防雞新城疫疾病的二聯體疫苗的制備方法，其特征在于，步驟(6)中所述目的蛋白與佐劑殼聚糖的質量比為1:1。
【文檔編號】A61K48/00GK103495182SQ201310453688
【公開日】2014年1月8日 申請日期:2013年9月29日 優先權日:2013年9月29日
【發明者】郭芳茹, 楊慧敏, 張遂平, 楊果, 王菊萍, 董戰杰, 王黎明 申請人:河南亞衛動物藥業有限公司