專利名稱：治療和預防幽門螺桿菌感染的重組融合蛋白疫苗及減毒活菌載體疫苗的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物制藥領域，特別是一種治療和預防幽門螺桿菌感染的重組融合蛋 白疫苗及減毒活菌載體疫苗。
背景技術：
胃炎和消化性潰瘍是人類的常見病和多發病，胃癌也是發病率和死亡率較高 的惡性腫瘤之一。幽門螺桿菌(Helicobacter pylori, Hp)是慢性活動性胃炎、消化 性潰瘍的最主要病因，同時與胃腺癌和胃黏膜相關的淋巴樣組織淋巴瘤的發生密切相 關(Nomura A, Stemmermann GN, Chyou PH et al. Helicobacter pylori infection and gastric carcinoma among JapaneseAmericans in Hawaii. N-Engl-J-Med. 1991, 325(16) :1132-1136. ；Parsonnet J, Friedman GD, Vandersteen DP, et al.Helicobacter pylori infection and the risk of gastric carcinoma. N-Engl-J-Med. 1991, 325(16) :1127-1131. ；Dunn BE, Cohen H, Blaser MJ.Helicobater pylori. Clin-Microbiol-Rev. 1997,10 (4) 720-741. ；Parsonnet J, Shmuely H, Haggerty T. Fecal and oral shedding of Helicobacter pylori from healthy infected adults. J-Am-Med-Assoc. 1999,282(23) :2240_2245.)，世界衛生組織已將Hp列為I類致癌因子。 大量的流行病學研究資料表明，Hp感染呈全球分布。在發達國家，Hp感染率約為40 50 %，而在發展中國家可達 50 60 % (Lee A. Prevention of Helicobacter pylori infection. Scand-J-Gastroenterol. 1996. Suppl 215 :11-15.)。據統計，在中國平均感染 率為58.07% (王凱娟，王潤田.中國幽門螺桿菌感染流行病學Meta分析.中華流行病學 雜志.2003,24(6) :443-446.)。目前質子泵抑制劑加兩種抗生素的三聯療法是全球推薦的 Hp根除治療一線方案，但是隨著抗生素在Hp感染治療中的廣泛應用，Hp耐藥株的發生率不 斷上升，以致Hp根除的難度加大(胡伏蓮.幽門螺桿菌耐藥性及治療失敗原因分析.中國 消化內鏡.2009，3 (3) :1-8.)。且存在費用昂貴、根除率低、停藥后的復發與再感染、病人的 依從性差等問題。疫苗是控制感染性疾病最為經濟有效的辦法，通過疫苗刺激機體產生不同于自然 感染導致的特異性免疫應答，可以達到預防或者治療Hp感染的目的。國內外競相研究Hp 疫苗，迄今已有Hp全菌滅活疫苗、基因工程亞單位疫苗、減毒活菌載體疫苗、核酸疫苗等研 究，目前，僅有我們研制的“口服重組Hp疫苗”(國藥證字S20090002)獲得成功。尿素酶是一種能水解尿素的金屬酶，約占Hp菌體蛋白總量的8% -10%，與Hp 在胃內定植能力相關，并能引起炎癥細胞反應，損傷胃上皮細胞。尿素酶B亞基(UreB) 是目前疫苗Hp研究的首選保護性抗原(Lee A. Vaccination against Helicobacter pylori. J-Gastroenterol. 1996,31 Suppl 9:69-74·)。細胞毒素相關基因蛋白(CagA)， 是Hp重要的毒力因子之一，CagA陽性菌株感染比陰性菌株更易增加十二指腸潰瘍和胃 癌等嚴重胃腸疾病發生的危險性。空泡形成細胞毒素A(VacA)是一種Hp毒素，它可引
4起胃上皮細胞發生空泡樣變，誘導細胞凋亡，抑制T細胞增殖，是Hp長期定植感染的因 素之一 (Backert S, Meyer TF. Type IV secretion systems and their effectors in bacterial pathogenesis.Curr-Opin-Microbiol. 2006,9(2) :207_217. ；Amieva MR, El-Omar EM. Host-bacterialinteractions in Helicobacter pylori infection. Gastroenterology. 2008,134(1) :306-323.)。HpCagA、VacA 和 UreB 均具有良好的抗原 性，能夠通過粘膜免疫的方式顯著地降低Hp在胃組織中的定植水平，表現出一定的保護 作用。在細菌感染過程中，由于宿主與致病菌之間的復雜作用機制，單一的抗原組分的 疫苗難以產生完全而有效的保護作用。現有的研究表明，單一 Hp抗原的免疫保護率幾 乎均低于80%，2種及2種以上抗原組合可獲得理想的保護效果(Telford JL, Ghiara P. Prospects for the development of a vaccine against Helicobacterpylori. Drugs. 1996,2 (6) 799-804. ；Ruggiero P, Peppoloni S, Berti D, et al.New strategies forthe prevention and treatment of Helicobacter pylori infection. Expert-Opin-Investig-Drugs. 2002，11 (8) : 1127-1138.)。用于 Hp 疫苗的保護性抗原相對 分子質量較大，構建完整的基因工程重組融合蛋白難以表達或表達率極低。選擇大分子蛋 白中具有免疫保護功能的蛋白片段來替代全長蛋白分子，仍可以發揮有效免疫應答作用， 且為基因工程重組疫苗的構建帶來便利。Hp特殊的定植環境決定了粘膜免疫是較好的疫苗免疫方式，粘膜免疫不僅能夠 激發強烈的體液免疫，同時還能較好的誘導局部的IgA抗體水平的升高。粘膜免疫系統是 機體免疫系統的重要組成部分，主要包括腸粘膜相關淋巴組織和支氣管粘膜相關淋巴組織 等，它在機體防御功能方面發揮著獨特的作用。由腸系膜淋巴結，以及分散在粘膜固有層和 腸上皮中的大量淋巴細胞組成免疫誘導部位和免疫效應部位。胃腸道等粘膜表面各種免疫 細胞通過攝取、加工和提呈抗原，產生并分泌針對該抗原的抗體(主要為slgA)，后者能與 攜帶此抗原的載體如細菌、病毒等發生特異性結合反應，阻止其定植粘膜表面或侵襲機體， 從而起到一定的免疫防御作用。但是，粘膜免疫的最大缺陷是易對抗原產生免疫耐受，即使 提高抗原量，機體或粘膜產生的抗原特異性slgA水平卻很低，對攜帶相應抗原的微生物的 感染幾乎沒有免疫防御能力或極弱、極易導致免疫耐受性的發生。鼠傷寒沙門菌是一種常見的侵襲性胞內菌，通過基因工程方法減毒后對宿主致 病性顯著降低，但仍保留良好的侵襲力，口服后可在腸道寄生繁殖，可以被小腸M細胞攝 取，穿過腸上皮屏障，因其細菌抗原也同時被APC細胞遞呈給免疫細胞而誘導特異性的 免疫應答反應(Sirard JC, Niedergang F，Kraehenbuhl JP. et al. Live attenuated Salmonella :aparadigm of mucosal vaccines. Immunol-Rev. 1999，171 :5_26.)， 被 認為是粘膜免疫的理想載體，是目前最常用的減毒活疫苗載體之一。減毒活載體疫 苗具有安全性高、可以口服給藥、保護時間長、副作用小、價格低廉、易于生產、儲存和 運輸等優點。目前已有多個重組減毒鼠傷寒沙門菌疫苗進入臨床研究(Konadu EY, Lin FY, et al. Phase 1 and phase 2 studies ofSalmonella enterica serovar paratyphi A 0-specific polysaccharide-tetanus toxoid conjugates inadults, teenagers，and 2_to 4-year-old children in Vietnam. Infect-Immun. 2000,68(3) 1529-1534. ；Tacket C0， Sztein MB， et al.Phase 2 clinical trial of attenuated Salmonella entericaserovar typhi oral live vector vaccine CVD 908—htrA in
5U. S. volunteers. Infect-Immun. 2000，68 (3) 1196-1201. ；Cunningham C，Nemunaitis J. A phase I trial of genetically modifiedSalmonella typhimurium expressing cytosine deaminase(TAPET-CD, VNP20029)administeredby intratumoral injection in combination with 5-fluorocytosine for patients with advanced ormetastatic cancer.Protocol no :CL_017.Version Apri1 9,2001.Hum-Gene-Ther. 2001， 12(12) :1594-1596. ；Toso JF, Gill VJ, et al· Phase I study of the intravenous administration of attenuatedSalmonella typhimurium to patients with metastatic melanoma. J-Clin-Oncol. 2002,20(1) :142_152.)。根據美國食品與藥物管理機構(FDA) 的規定，活疫苗中不能存在抗藥質粒，且在人和動物體內也無法以抗生素來維持重組質粒 的穩定性。為了在沒有抗生素存在條件下，外源保護性抗原能在減毒傷寒沙門菌中穩定 表達，目前已發展起來一種新型的質粒載體系統，即載體-宿主平衡致死系統。平衡致死 系統是一種以營養選擇標志代替抗生素抗性標志為主要特征的質粒-染色體平衡致死系 統，也叫載體-宿主平衡致死系統(Tacket CO, Kelly SM，Schodel F. et al. Safety and immunogenicity in humans of an attenuated Salmonellatyphi vaccine vector strain expressing plasmid—encoded hepatitis B antigens stabilized by theAsd—balanced lethal vector system. Infect-Immun. 1997,65(8) :3381_3385· ；Chen H,M. SchifferliD. Mucosal and systemic immune responses to chimeric fimbriae expressed by Salmonellaenterica serovar typhimurium vaccine strains. Infect-Immun. 2000， 68(6) :3129-3139.)。減毒鼠傷寒沙門菌株x4550中的天冬氨酸β半醛脫氫酶基因(asd) 缺失，由于該asd基因編碼的天冬氨酸β半醛脫氫酶是二氨基庚二酸(DAP)生物合成途徑 中的必需酶，而DAP是革蘭陰性細菌細胞壁肽聚糖的基本組成成分，因此asd基因的突變引 起DAP合成的缺乏，導致該突變株成為營養缺陷型菌株。在無外源性DAP的培養條件下，溶 菌死亡。該菌株如被轉入含有asd基因的表達質粒，因載體與缺陷型宿主菌構成遺傳互補， 則該菌株可穩定攜帶質粒傳代表達。在這一條件下，重組質粒成為細菌生存所必需，一旦轉 化子質粒丟失，細菌則由于不能合成必需物質而無法在正常培養基上生長。因此，凡是能在 正常培養基上生長的細菌，必定包含重組質粒，從而構成了平衡致死系統。利用“載體_宿 主平衡致死系統”構建的減毒沙門菌活疫苗更是顯示出良好的應用前景。
綜上所述，充分綜合利用Hp CagA.VacA和UreB的抗原特性，使這幾種抗原特性協 同發揮出來，并克服其在粘膜免疫方面存在的易產生耐受性等問題，提供一種用于治療和 預防Hp感染的疫苗，將給胃炎和消化性潰瘍患者帶來莫大的福音，但目前并沒有這方面的 報道。

發明內容
本發明針對上述領域的空白，提供一種治療和預防幽門螺桿菌感染的重組融合蛋 白疫苗及活疫苗。一種治療和預防幽門螺桿菌感染的重組融合蛋白疫苗，包括一段重組融合蛋白， 其特征在于所述重組融合蛋白由來源于幽門螺桿菌的幽門螺桿菌細胞毒素相關基因蛋白 CagA,空泡形成細胞毒素VacA及尿素酶亞基UreB的具有免疫保護功能片段線性連接構成。所述幽門螺桿菌細胞毒素相關基因蛋白CagA的免疫保護功能片段CagA16tl的氨基
6酸序列如Seq ID No. 1所示；所述空泡形成細胞毒素VacA的免疫保護功能片段VacA62的氨 基酸序列如Seq ID No. 2所示；所述尿素酶亞基UreB的免疫保護功能片段UreB138的氨基 酸序列如Seq ID No. 3所示。所述重組融合蛋白疫苗具有CagA16tl-VacA62-UreB138的連接順序。所述重組融合蛋白疫苗的CagA16(1、VaCA62、UreB138之間的連接采用連接肽。所述重組融合蛋白疫苗具有如Seq ID No. 4所示的氨基酸序列編碼上述重組融合蛋白疫苗的基因。所述基因具有Seq ID No. 5所示核苷酸序列。一種重組質粒，包括骨架載體和外源基因，外源基因片段包括編碼上述重組融合 蛋白疫苗的基因。所述重組質粒的骨架載體為含有天冬氨酸β半醛脫氫酶基因片段的傷寒沙門氏 菌質粒ΡΥΑ3149。一種治療和預防幽門螺桿菌感染的減毒活菌載體疫苗，包括載體菌和表達免疫原 的外源質粒，所述載體菌為減毒活菌，所述外源質粒為上述重組質粒，所述減毒活菌指通過 基因工程方法減毒后對宿主的致病性顯著降低，且保留了對胃、腸的粘膜或細胞的侵染能 力的菌株。所述減毒活菌為減毒鼠傷寒沙門菌株。所述減毒鼠傷寒沙門菌株為缺失了天冬氨酸β半醛脫氫酶基因的菌株X 4550。上述治療和預防幽門螺桿菌感染的減毒活菌載體疫苗的制備方法，步驟如下(1)以幽門螺桿菌基因組為模板，分別擴增具有Seq ID No. 12,Seq ID No. 13,Seq ID No. 14所示核苷酸序列的基因片段。(2)連接擴增得到三個基因片段，并構建到含有天冬氨酸β半醛脫氫酶基因片段 的骨架載體ΡΥΑ3149上，篩選重組質粒；(3)重組質粒轉入宿主菌χ455°中，擴增Seq ID No. 12、Seq ID No. 13、Seq ID No. 14所示核苷酸序列的基因片段的 引物分別如下cagA160Pl/cagA160P2 5-gcg IgaattcI gaaacgctcaatcaagaac-3，5-gctacctcctccacttccgcctccttgtgagcctgtgagttggtcttc-3 ；VacA62P l/vacA62P2 5GGAGGCGGAAGTGGAGGAGGTAGCTTAGGCACTAACAGCATTAGTAATGT3，5GCTACCTCCTCCACTTCCGCCTCCGATAAGATACTTGTAATTGTCGGGGT3 ；ureB138Pl/ureB138P2 5GGAGGCGGAAGTGGAGGAGGTAGCGACACTTTGAATGAAGCTGGTTGTG3，5GCGAAGCTTAAAATTCTTTCTTGTTTTTGTCAG3。本發明的目的在于提供治療和預防幽門螺桿菌感染的疫苗，從Hp 26695中篩選 CagA, VacA和UreB蛋白具有免疫保護功能的片段，通過分子生物學方法克隆重組基因，構 建重組表達質粒，表達得到重組融合蛋白。從實施例4的結果可以看出，該重組融合蛋白 具有良好的免疫原性，能夠刺激實驗鼠產生抗HP的特異性免疫反應，而口服空質粒轉化菌
7菌的實驗鼠沒有產生抗HP的抗體。本領域技術人員基于現有文獻中對CagA、VaCA和UreB 三種蛋白的報道，可能選擇不同的有免疫功能的片段，然后根據本發明提供的技術方案構 建而得的載體所表達的重組融合蛋白疫苗都在本發明的保護范圍內。本發明中，對CagA、 VacA和UreB蛋白具有免疫保護功能的片段的最優選擇如下=CagA16tl蛋白的氨基酸序列 如 GenBank :NP_207343. 1 (231-390 位氨基酸，Seq ID No. 1) ；VacA62 蛋白的氨基酸序列 如 GenBank :NP_207680. 1 (744-805 位氨基酸 Seq ID No. 2) ；UreB138 蛋白的氨基酸序列如 GenBank :ΝΡ_206872· 1 (250-387 位氨基酸 Seq ID No. 3)。其中編碼CagA16Q、VacA62 和 UreB138 的核酸序列分別為cagA16(1、VacA62 和 ureB138。CagA160覆蓋了 GenBank公布的Hp 26695菌株HP0547基因的核酸序列688-1167 位(SeqID No. 12)，包含引入的上游酶切位點和下游Linker核酸序列全長513bp。VacA62覆蓋了 GenBank公布的Hp 26695菌株HP0887基因的核酸序列2230-2415 位(SeqID No. 13)，包含引入的上、下游Linker核酸序列全長234bp。UreB138覆蓋了 GenBank公布的Hp 26695菌株HP0072基因的核酸序列748-1161 位(SeqID No. 14)，包含引入的上游Linker和下游酶切位點核酸序列全長448bp。本發明構建的重組融合蛋白中，CagA16Q、VacA62和UreB13以線性排列連接，而以 CagA160-VacA62-UreB138的順序排列時其免疫效果最佳；本發明進一步優選在CagA16(1、 VacA62和UreB13三個元素的相互連接處加入(GGGS) 2 3，(GGGGS) 2 3，(RSIAT) 2 3或 RPACKIPNDLKQKVMNH肽鏈為柔性Linker，本領域技術人員可根據Linker的常規要求設計 其它多種連接肽，都能到達本發明的目的。本發明優選氨基酸序列為GGGSGGGS(Ge0rgeRA， Heringa J. An analysis of protein domain linkers :their classification and role inprotein folding. Protein Engineering, 2002,15(11) :871_879.)的肽鏈為連接肽。本發明還提供了編碼上述重組融合蛋白的基因序列，其中一種如Seq ID No. 5所 示。本領域技術人員根據本發明提供基因序列，能夠構建出表達重組融合蛋白疫苗的重組 質粒、工程菌，用于生產本發明要求保護的重組融合蛋白疫苗。本發明構建的一種重組質粒的骨架載體采用含有天冬氨酸β半醛脫氫酶基因片 段的傷寒沙門氏菌質粒ΡΥΑ3149，該重組質粒可用于轉入到缺失天冬氨酸β半醛脫氫酶基 因的減毒菌中構建一種具有載體-宿主平衡致死系統的工程菌，以適宜作為人或動物的疫
田ο本發明的一個重要貢獻是提供一種治療和預防幽門螺桿菌感染的減毒活菌載體 疫苗，是采用減毒活菌作為載體菌，以上述表達重組融合蛋白的質粒為外源質粒構建的工 程菌。采用的減毒活菌指通過人工的如基因工程方法敲除其致病基因使其對人的致病性大 大降低即減毒，并保留了對人或動物的腸胃組織、粘膜、細胞的侵染力的細菌。這樣的工程 菌作為疫苗，能夠攜帶表達免疫原的外源基因定植于人或動物的胃腸道而不致病，刺激胃 腸道組織發生免疫應答反應而合成針對免疫原的特異性抗體，保護機體免受具有相同免疫 原的細菌侵襲而致病，由于活疫苗長期定植于胃腸道組織，能夠刺激機體保持長期的抗體 合成能力，因此比滅活疫苗的一次性免疫具有更好的保護作用，特別適合于預防和治療幽 門螺桿菌引起的胃炎、腸炎這種易反復感染發作的病。本發明優選采用減毒的沙門氏傷寒桿菌作為載體菌，轉入本發明構建的重組質粒 后得到減毒活菌載體疫苗。減毒鼠傷寒沙門菌是一種常見的侵襲性胞內菌，通過基因工程方法減毒后對宿主致病性顯著降低仍保留良好的侵襲力，且能穩定表達外源基因，可直接 用于免疫保護試驗，不需純化所表達的靶抗原，免去了蛋白質后處理的復雜工序，口服后經 口、鼻、直腸等粘膜途徑免疫能誘導強大而特異的免疫反應，可以被小腸M細胞攝取，穿過 腸上皮屏障，因其細菌抗原也同時被APC細胞遞呈給免疫細胞而誘導特異性的免疫應答反 應，被認為是粘膜免疫的理想載體，是目前最常用的減毒活疫苗載體之一。由于本發明提供的減毒活菌載體疫苗主要用于預防和治療HP感染，考慮到用 于人體或動物的活疫苗不能含有抗性基因，因此無法采用抗生素來篩選構建的陽性工 程菌，因此本發明優選采用沙門氏傷寒桿菌菌株(Salmonella typhimurium χ 4550/ AsdXya-NalrCrp-)作為載體菌，由于其突變缺失了天冬氨酸β半醛脫氫酶基因(asd)，需 提供外源的二氨基庚二酸(DAP)，否則因無法正常合成細胞壁而發生溶菌死亡，需要轉入攜 帶有asd基因的外源質粒才可在正常培養基上生長，因此是一種理想的營養缺陷型篩選菌 株。本發明中轉入了含有asd基因的重組質粒，如以pYA3149為骨架載體的重組質粒，得到 一種具載體-宿主平衡死亡系統的工程菌，符合口服活疫苗的標準，可廣泛用于治療和預 防HP的感染。實驗數據表明該疫苗具有很多優點①可以穩定表達Hp融合蛋白基因；② 免疫后可誘導粘膜和系統免疫應答；③安全有效，方法簡便，成本低，具有顯著的經濟效益。 以這種菌株免疫Hp感染的小鼠，小鼠能生成抗Hp的特異性抗體(圖8)，并能清除小鼠胃 內Hp或降低小鼠胃內Hp定植量(表1，表2)，因此本發明可以作為治療和預防Hp感染的 候選疫苗。本發明還提供上述活疫苗的制備方法，其主要包括以下步驟(1)通過 PCR 方法，分別從 Hp 26695 基因組 DNA 中克隆 CagA16(1、VacA62 和 UreB138 的DNA片段；(2)采用重疊PCR的方法，將步驟(1)中克隆得到的DNA片段連接成融合基因；(3)將融合基因構建到載體質粒上，測序鑒定；(4)將融合基因構建到表達載體上，轉化宿主菌株χ 4550 (Salmonella typhimurium χ 4550/AsdXya-NarCrp-)，得到重組減毒鼠傷寒沙門菌活疫苗；


圖1. cagA160、vacA62和ureB138核酸瓊脂糖凝膠電泳圖。其中泳道1 為核酸(DNA)分子量標準(TaKaRa，IOObp DNA Ladder Marker, D505A)，泳道 2 為 cagA160PCR 擴增產物(513bp)，泳道 3 為 vacA62PCR 擴增產物(234bp)， 泳道4為ureB138PCR擴增產物(448bp)。圖2.為CagA160-VaCA62的瓊脂糖凝膠電泳圖其中泳道1 為核酸(DNA)分子量標準(TaKaRa，IOObp DNA Ladder Marker, D505A)，泳道2為cagA160-vacA62融合基因的PCR擴增產物(723bp)。圖3. cagA160-vacA62-ureB138 的瓊脂糖凝膠電泳圖，其中泳道1 為核酸(DNA)分子量標準(TaKaRa，IOObp DNA Ladder Marker, D505A)，泳道 2 為 cagA160-vacA62-ureB138 融合基因的 PCR 擴增產物(1147bp)。圖4.為重組質粒pET 22b (+) -cagA160-vacA62-ureB138的酶切鑒定瓊脂糖凝膠電泳 圖
其中泳道1 為核酸(DNA)分子量標準(TaKaRa, Wide Range DNA Marker (100 6，000)，D518A)，泳道 2 為重組質粒 pET 22b (+) -cagA160-vacA62-ureB138EcoR I 和 Hind III 雙酶切(5474bp+1135bp)產物。圖5.為重組質粒pYA3149-CagA16(1-VaCA62-ureB138的酶切鑒定瓊脂糖凝膠電泳圖。其中泳道1 為核酸(DNA)分子量標準(TaKaRa, Wide Range DNA Marker (100 6，000)，D518A)，泳道 2 為重組質粒 pYA3149-cagA16(l-vacA62-ureB138EcoR I 和 Hind III 雙 酶切(3681bp+1135bp)產物。 圖6.為SDS-PAGE電泳檢測重組蛋白的表達。其中泳道1為蛋白質分子量標準(Fermentas，#SM0671)，泳道2為空載體菌 (X 4550 (PYA3149))誘導24h對照，泳道3為重組減毒傷寒沙門菌疫苗株x 4550 (pYA3149_ cagA160-vacA62-ureB138)誘導24h，泳道4為重組減毒傷寒沙門菌疫苗株x 4550 (pYA3149_c agA160-vacA62-ureB138)誘導12h，泳道5為重組減毒傷寒沙門菌疫苗株χ 4550 (pYA3149_ca gA160-vacA62-ureB138)誘導8h，泳道6為重組減毒傷寒沙門菌疫苗株x 4550 (PYASHQ-CagA1 60-vacA62-ureB138) i胃帛 4h。圖7.為Western檢測重組蛋白的免疫反應性。其中泳道1為蛋白質分子量標準(Fermentas，#SM0671)，泳道2為空載體菌 (X 4550 (PYA3149))誘導24h對照，泳道3為重組減毒傷寒沙門菌疫苗株x 4550 (pYA3149_ cagA160-vacA62-ureB138)誘導 24h。圖8.為重組減毒鼠傷寒沙門菌活疫苗口服免疫BALB/c小鼠，ELISA方法檢測免 疫后Hp特異性血清IgG和胃粘膜IgA抗體結果縱坐標表示450nm處吸光值。圖9融合基因cagA16Q-VacA62-ureB138構建示意10pYA3149-cagA16Q-vacA62-ureB138 質粒構建示意圖
具體實施例方式實施例1 獲得 HpDNA 片段 CagA16tl、VacA62 和 UreB1381.引物設計及合成以GenBank公布的Hp 26695基因組(NC_000915)中核酸序列設計引物，上游引 物5’端引入EcoR I酶切位點，下游引物5’端引入Hind III酶切位點，中間引物引入柔性 Linker (GGGSGGGS)序列(圖 9)。引物設計如下 引物由上海生工生物技術有限公司合成。2. PCR 擴增目的 DNA1)模板的制備用“細菌基因組DNA提取試劑盒” (TIANGEN，DP302)抽提Hp 26695(購自美國標準 菌種收藏所American Type Culture Collection，ATCC，本單位有保存，可向公眾發放作為 驗證試驗使用)基因組，操作按說明書進行。2) PCR 擴增以Hp 26695 基因組 DNA 為模板，分別用 CagA16tlPl 和 cagA16(1P2 擴增 cagA16(1， VacA62Pl 和 vacA62P2 擴增 VacA62，UreB138Pl 和 ureB138P2 擴增 UreB138。采用寶生物工程 (大連)有限公司(RaKaRa)高保真 DNA 聚合酶(PrimeSTAR HS DNA Polymerase, Code DROlOA)進行PCR擴增，反應體系如下反應物體積
5xPrimeSTAR Buffer (Mg2+plus)20μ1
dNTP Mixture (各 2.5mM)8μ1
Pl (ΙΟμΜ)2μ1
Ρ2 (ΙΟμΜ)2μ1
Hp 26695 基因組Ιμ DNA (lOOng/μΙ)
PrimeSTAR HSΙμ
DNA Polymerase (2.5 U/μΙ)
滅菌蒸餾水_66μ1PCR 反應條件為94°C預變性 5min ；94°C變性 30s，58°C退火 30s，72°C延伸 45s，30 個循環；72°C完全延伸lOmin。反應完畢后取3 μ 1 PCR反應產物，2. 0%瓊脂糖凝膠電泳檢 測(圖1)。瓊脂糖凝膠電泳后，回收目的片段，得到cagA16(1、VacA62和UreB138DNA片段。
實施例 2 構建 cagA16Q-VacA62-ureB138 融合基因1.重疊延伸PCR獲得CagA16Q-VaCA62融合基因以回收的CagA16tl和VacA62基因片段為模板，CagA160Pl和vacA62P2為引物進行PCR 擴增，反應體系如下
反應物體積
5xPrimeSTAR Buffer (Mg2+plus)20μ1
dNTP Mixture (各 2.5mM)8μ1
回收的 cagA160 (25ng^l)2μ1
回收的 vacA62 (lOng/μΙ)2μ1
PrimeSTAR HSΙμ DNA Polymerase (2.5 U/μΙ)
滅菌蒸餾水63μ1PCR 反應條件為94°C預變性 5min ；94°C變性 30s，56°C退火 30s，72°C延伸 lmin， 10個循環；加入 CagA16tlPl (10 μ Μ)和 vacA62P2 (10 μ Μ)各 2 μ 1 ；94°C變性 30s，56°C退火30s， 72°C延伸2min，30個循環；72°C完全延伸lOmin。反應完畢后取3 μ 1 PCR反應產物，2.0% 瓊脂糖凝膠電泳檢測。圖2中顯示融合基因片段大小與預計一致，表明重疊延伸得到融合 基因。瓊脂糖凝膠電泳后，回收目的片段，得到CagA16trvacA62融合基因。2.重疊延伸 PCR 獲得 cagA16Q-vacA62-ureB138 融合基因以回收的CagA16Q-VaCA62融合基因和UreB138基因片段為模板，CagA160Pl和
12ureB138P2為引物進行PCR擴增，反應體系如下
反應物體積
5xPrimeSTAR Buffer (Mg2+plus)20μ1
dNTP Mixture (各 2.5mM)8μ1
回收的 cagA160-vacA62 (25ng/W)2μ1
回收的 UreBu8 (15ng^l)2μ1
PrimeSTAR HSΙμ DNAPolymerase (2.5 U/μΙ)
滅菌蒸餾水63μ1PCR 反應條件為94°C預變性 5min ；94°C變性 30s，56°C退火 30s，72°C延伸 lmin， 10 個循環；加入 CagA160Pl(IOyM)和 ureB138P2 (10 μ M)各 2μ 1 ；94°C 變性 30s，56°C 退火 30s，72°C延伸2min，30個循環；72°C完全延伸lOmin。反應完畢后取3 μ 1 PCR反應產物， 2. 0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。圖3中顯示融合基因片段大小與預計一致，表明重疊延伸得 到融合基因。瓊脂糖凝膠電泳后，回收目的片段，得到CagA16crvacA62-UreB138融合基因。實施例3 重組質粒 pET 22b (+) -cagA160-vacA62-ureB138 的構建1.酶切將獲得的CagA16(1-VaCA62-ureB138融合基因與pET 22b (+)質粒，分別用寶生物工程 (大連)有限公司限制性內切酶EcoR I和Hind III做雙酶切，按照說明書操作。酶切鑒定結 果如圖4所示。瓊脂糖凝膠電泳，分別回收5. 5kb載體片段和1. Ikb cagA160-vacA62-ureB138 融合基因片段。2.連接通過紫外分光光度計檢測目的DNA片段和載體片段的濃度，根據外源片段與載體 摩爾數比一般為1 2 10的原則，進行連接反應(使用寶生物工程(大連)有限公司連 接試劑盒)，連接反應體系如下cagA160-vacA62-ureB138 酶切回收產物 4 μ 1 ；pET 22b (+)質粒載體 1 μ 1 ；連接溶液 5μ1。總體積10μ 1，16°C連接反應2小時。3.轉化將連接產物，轉化Ecoli DH5a，氨芐抗性篩選陽性重組子。4.鑒定重組質粒挑取氨芐抗性篩選平板上的單個菌落，抽提質粒，用EcoR I和Hind III做雙酶切 鑒定，鑒定正確后回收基因片段(圖4)。質粒送上海生工生物技術有限公司測序，融合基因 片編碼的蛋白序列與預計完全一致(見序列表)。實施例4重組質粒pYA3149-cagA16(1-vacA62-ureB138的構建及融合蛋白在重組減毒 沙門菌中的表達及抗原性檢測1.質粒抽提抽提質粒pYA3149(美國Washington大學Roy Curtiss III博士惠贈，本單位有
13保存，可向公眾發放作為驗證試驗使用)以及PET 22b(+)-cagA16(1-vacA62-ureB138。2.酶切反應載體pYA3149 以及 pET 22b (+)-cagA16(|-vacA62-ureB138p 均用 EcoR I 和 Hind III 雙酶切。瓊脂糖凝膠電泳，回收后酶切目的片段。3.連接反應通過紫外分光光度計檢測目的DNA片段和載體片段的濃度，根據外源片段與載體 摩爾數比一般為1 2 10的原則，進行連接反應(使用寶生物工程(大連)有限公司連 接試劑盒)，連接反應體系如下cagA160-vacA62-ureB138 酶切回收產物 4μ 1 ；ρΥΑ3149 質粒載體 1μ 1 ；連接溶液 5 μ 1。總體積 10 μ 1，16°C連接反應 2 小時得至IJ pYA3149-cagA16Q-vacA62-ureB138 (見圖 3)。4.轉化將連接產物，電轉減毒鼠傷寒沙門菌株X 4550 (美國Washington大學Roy Curtiss III博士惠贈，本單位有保存，可向公眾發放作為驗證試驗使用)，電轉條件為電 壓2500V,電容25uF,電阻200 Ω，電轉杯2mm，放電時間3 5ms。LB平板篩選陽性重組子。5.鑒定重組表達質粒挑取LB平板上的單個菌落，抽提質粒，用EcoR I和Hind III做雙酶切鑒定，鑒定 正確(圖5)。質粒pYA3149-cagA16(1-vacA62-ureB138構建成功(圖10)，并得到重組減毒傷 寒沙門菌疫苗株 χ 4550 (pYA3149-cagA160-vacA62-ureB138)。6.表達鑒定1)重組工程菌的誘導取鑒定正確的重組工程菌接種于5ml LB培養液中，37°C搖床培養(200r/min)過 夜。次日將過夜培養的重組工程菌按的比例轉種于20ml LB培養液中，37°C搖床培 養(200r/min)待0D600 = 0. 8時，加入IPTG至終濃度為lmmol/L誘導，于誘導24小時 SDS-PAGE檢測重組蛋白的表達，同時作空載體菌(χ 4550 (pYA3149))誘導對照。2) SDS-PAGE檢測重組蛋白的表達取Iml誘導24小時的菌液，離心，100μ 1雙蒸水重懸沉淀，加入100μ 1 2χ SDS-PAGE上樣緩沖液，混勻，沸水浴10分鐘。SDS-PAGE電泳(4%濃縮膠10%分離膠)，考 馬斯亮藍染色，與預染Marker (Fermentas，#SM0671)對照分析電泳結果，有與設計的重組 融合蛋白理論分子量(41kd)相符的蛋白表達(圖6)。7.抗原性檢測1) Western檢測重組蛋白的免疫反應性以兔抗Hp全菌抗血清鑒定重組蛋白的免疫反應性，結果表明重組蛋白與兔抗Hp 全菌抗血清有很好的免疫反應性(圖7)。2)動物實驗檢測重組蛋白的免疫原性將2. OX IO8Cfu (菌落形成數)重組減毒鼠傷寒沙門菌活疫苗口服免疫BALB/c小 鼠，經ELISA檢測(圖8，*:p< 0.01)，經統計學分析(t檢驗)，口服疫苗組與PBS (磷酸 鹽緩沖液，PH7. 0)組比較，免疫后Hp特異性血清IgG和胃粘膜IgA抗體均有顯著差異，ρ < 0. 01 ；空質粒菌組與PBS組比較差異不顯著，ρ > 0. 05。
結果表明，該疫苗可誘生BALB/c小鼠產生高效價的抗Hp的血清IgG抗體和胃粘 膜分泌型IgA抗體，而口服免疫等量空質粒菌(x4550(pYA3149))不會誘生抗Hp的抗體， 證實重組減毒鼠傷寒沙門菌活疫苗具有良好的免疫原性。實施例5重組減毒鼠傷寒沙門菌活疫苗治療及預防Hp感染動物實驗1.預防Hp感染動物實驗按動物實驗檢測重組蛋白的免疫原性方法免疫小鼠，各組小鼠于免疫后4周同時 灌喂制備好的Hp菌液。所有實驗動物提前24小時斷食、斷水，每次每只灌喂菌液0. 2ml，約 2. OX IO8CfuHp菌液；上、下午各一次，間隔6小時，術次灌喂后2小時供食水。分別灌喂等 量空質粒菌(χ 4550 (pYA3149))和PBS作為對照。攻毒后第4周所有實驗動物均處死并采集標本，處死前24小時斷食水。解剖小 鼠，取出鼠胃，沿胃大彎剖開，用生理鹽水輕輕沖掉胃內殘留物，將一半胃粘膜組織涂布Hp 培養基，三線法劃線接種，微需氧培養，觀察Hp攻毒后小鼠Hp的定植情況(表1)。表1重組減毒鼠傷寒沙門菌活疫苗預防Hp感染效果 經統計學分析(χ 2檢驗)，疫苗組與空質粒菌組和PBS組比較，Hp感染動物數均 有顯著差異，P <0.01 ；空質粒菌組與PBS組比較差異不顯著，ρ > 0. 05。結果顯示疫苗免疫組小鼠胃內Hp感染率顯著低于空質粒菌對照組和PBS對照 組，保護率為83. 3%，且感染的小鼠胃內Hp定植量顯著低于空質粒菌對照組和PBS對照組。結論該重組減毒鼠傷寒沙門菌活疫苗口服免疫小鼠，與空質粒菌免疫和未免疫 組相比，可產生針對Hp活菌攻擊的抵抗力，有預防Hp感染的作用。2.治療Hp感染動物實驗按預防Hp感染動物實驗中的方法，建立Hp感染小鼠動物模型。感染后8周，將 2. 0 X IO8Cfu重組減毒鼠傷寒沙門菌活疫苗經口灌入小鼠胃免疫。分別灌喂等量空質粒菌 (Χ 4550 (pYA3149))和PBS (磷酸鹽緩沖液，pH7. 0)作為對照。免疫后6周，按預防Hp感染 動物實驗中的方法，觀察免疫治療后小鼠Hp的定植情況(表2)。表2重組減毒鼠傷寒沙門菌活疫苗治療Hp感染效果 經統計學分析(X 2檢驗)，疫苗組與空質粒菌組和PBS組比較，治療后未檢測到 Hp動物數及治療后Hp定植量明顯減少動物數均有顯著差異，ρ <0.01 ；空質粒菌組與PBS 組比較差異不顯著，P >0. 05。結果顯示疫苗免疫組小鼠胃內Hp定植量比空質粒菌對照組和PBS對照組均顯著 下降，保護率為76. 7% ；部分小鼠胃內Hp甚至得到清除，Hp清除率為43. 3%。結論該重組減毒鼠傷寒沙門菌活疫苗口服免疫Hp感染的小鼠，與空質粒菌免疫 和未免疫組相比，可對小鼠胃內定植的Hp活菌產生免疫治療效果，有治療np感染的作用。
權利要求
一種治療和預防幽門螺桿菌感染的重組融合蛋白疫苗，包括一段重組融合蛋白，其特征在于所述重組融合蛋白由來源于幽門螺桿菌的幽門螺桿菌細胞毒素相關基因蛋白CagA、空泡形成細胞毒素VacA及尿素酶亞基UreB的具有免疫保護功能片段線性連接構成。
2.根據權利要求1所述的重組融合蛋白疫苗，所述幽門螺桿菌細胞毒素相關基因蛋白 CagA的免疫保護功能片段CagA16tl的氨基酸序列如Seq ID No. 1所示；所述空泡形成細胞 毒素VacA的免疫保護功能片段VacA62W氨基酸序列如Seq ID No. 2所示；所述尿素酶亞基 UreB的免疫保護功能片段UreB138的氨基酸序列如Seq ID No. 3所示。
3.根據權利要求2所述的重組融合蛋白疫苗，具有CagA16ci-VacA62-UreB138的連接順序。
4.根據權利要求2或3所述的重組融合蛋白疫苗，所述CagA16(1、VacA62、UreB138之間采 用連接肽。
5.根據權利要求4所述的重組融合蛋白疫苗，所述重組融合蛋白具有如SeqID No. 4 所示的氨基酸序列。
6 一種重組質粒，包括骨架載體和外源基因，所述外源基因包括編碼權利要求1 5任 一所述重組融合蛋白疫苗的基因。
7.根據權利要求6所述的重組質粒，所述骨架載體為含有天冬氨酸β半醛脫氫酶基因 片段的傷寒沙門氏菌質粒ΡΥΑ3149。
8.一種治療和預防幽門螺桿菌感染的減毒活菌載體疫苗，包括載體菌和表達免疫原的 外源質粒，所述載體菌為減毒活菌，所述外源質粒為上述重組質粒，所述減毒活菌指通過基 因工程方法減毒后對宿主的致病性顯著降低，且保留了對胃、腸的粘膜或細胞的侵染能力 的菌株。
9.根據權利要求8所述的減毒活菌載體疫苗，所述減毒活菌為減毒鼠傷寒沙門菌株。
10.根據權利要求9所述的減毒活菌載體疫苗，所述減毒鼠傷寒沙門菌株為缺失了天 冬氨酸β半醛脫氫酶基因的菌株χ 4550。
11.權利要求10所述減毒活菌載體疫苗的制備方法，步驟如下(1)以幽門螺桿菌基因組為模板，分別擴增具有SeqID No. 12, Seq ID No. 13, Seq ID No. 14所示核苷酸序列的基因片段。(2)連接擴增得到三個基因片段，并構建到含有天冬氨酸β半醛脫氫酶基因片段的骨 架載體ρΥΑ3149上，篩選重組質粒；(3)重組質粒轉入宿主菌χ4550中，擴增Seq ID No. 12、Seq ID No. 13、Seq ID No. 14所示核苷酸序列的基因片段的引物 分別如下CagA160 Pl/cagA160 P2 5-gcg IgaattcI gaaacgctcaatcaagaac-3 ,5-gctacctcctccacttccgcctccttgtgagcctgtgagttggtcttc-3 ；VacA62 Pl/VacA62 P2 5GGAGGCGGAAGTGGAGGAGGTAGCTTAGGCACTAACAGCATTAGTAATGT3,5GCTACCTCCTCCACTTCCGCCTCCGATAAGATACTTGTAATTGTCGGGGT3 ；UreB138 Pl/ureB138 P2 5GGAGGCGGAAGTGGAGGAGGTAGCGACACTTTGAATGAAGCTGGTTGTG3，5GCGAAGCTTAAAATTCTTTCTTGTTTTTGTCAG3。
全文摘要
本發明“治療和預防幽門螺桿菌感染的重組融合蛋白疫苗及減毒活菌載體疫苗”，屬于生物制藥領域。本發明提供的重組融合蛋白疫苗及表達該重組融合蛋白的減毒活菌載體疫苗，其特征在于所述重組融合蛋白由來源于幽門螺桿菌的幽門螺桿菌細胞毒素相關基因蛋白CagA、空泡形成細胞毒素VacA及尿素酶亞基UreB的具有免疫保護功能片段線性連接構成，通過動物實驗驗證其免疫原性及免疫保護性。該活疫苗具有以下優點，①可以穩定表達Hp融合蛋白基因；②免疫后可誘導粘膜和系統免疫應答；③方法簡便，成本低，具有顯著的經濟效益。可以作為治療和預防Hp感染的候選疫苗。
文檔編號A61P31/04GK101905018SQ20101013964
公開日2010年12月8日 申請日期2010年4月6日 優先權日2010年4月6日
發明者余抒, 劉開云, 吳超, 毛旭虎, 石云, 解慶華, 鄒全明, 郭剛, 陳立 申請人:中國人民解放軍第三軍醫大學