一種融合蛋白及其疫苗組合物的制備與應用的制作方法
【專利摘要】本發明提供了一種融合蛋白及含該融合蛋白的豬支原體肺炎疫苗組合物與應用。所述融合蛋白包括綠膿桿菌外毒素A結構域I與II、豬肺炎支原體抗原性蛋白及羧基末端部分，所述豬肺炎支原體抗原性蛋白包括NrdF蛋白、P102蛋白、P97R1蛋白、P97R2蛋白、P97R1-NrdF蛋白、P97R2-NrdF蛋白中的任一蛋白。本發明還公開了含免疫量的融合蛋白的疫苗組合物及其在制備預防和/或治療豬支原體肺炎的藥物中的應用。所述疫苗組合物可通過基因工程手段對疫苗組合物的組分進行大量重組表達，不僅耗時短，還可便于大規模生產；所述疫苗組合物既能產生體液免疫，也能產生細胞免疫，能獲得較好的免疫效果。
【專利說明】一種融合蛋白及其疫苗組合物的制備與應用

【技術領域】
[0001] 本發明屬于獸用生物制品【技術領域】，具體涉及一種豬肺炎支原體融合蛋白及含該 融合蛋白的疫苗組合物的制備與應用。

【背景技術】
[0002] 豬支原體肺炎（Mycoplasmal pneumonia of swine, MPS)又稱豬氣喘病（李彥明， 張映.豬肺炎支原體生物學研究進展，動物醫學進展，2003, 24 (3) :25-27)或豬地方性流 行性肺炎，是由豬肺炎支原體（Mycoplasmahyopneumoniae，Mhp)所引起的一種豬接觸性慢 性呼吸道疾病，分布十分廣泛，以慢性、接觸性、高度傳染性、高發病率以及低死亡率等為特 點，主要表現為咳嗽和呼吸困難，解剖可見肺組織呈肉變或大理石樣病變。
[0003] 衣阿華大學Ross研究發現：Mhp感染后淋巴細胞產生抗體的能力下降，細胞免 疫力下降，肺泡巨噬細胞對病原的吞噬和清除能力亦下降，抑制性T細胞的活動增強，導 致呼吸道免疫力減弱，抗病力下降，從而使其他病原體更容易侵入，可繼發感染豬繁殖與 呼吸綜合征、豬圓環等，從而導致多種疫苗接種失敗。Mhp可經空氣傳播，易與其他細菌 性疾病如豬肺疫、傳染性胸膜肺炎等并發（王茂文，豬肺炎支原體病的特點及其防制措 施?畜禽業，2008 (2) : 16-17 ;Dee S, Otake S, Oliveira S, et al. Evidence of long distance airborne transport of porcine reproductive and respiratory syndrome virus and Mycoplasma hyopneumoniae. Veterinary research, 2009, 40(4) :39)，對養豬業造成重大的 經濟損失，是當前最常發生、最廣流行、最難凈化的重要疫病之一。
[0004] 豬支原體肺炎亞單位疫苗不含全菌疫苗的核酸，不僅不存在滅活不徹底造成 的安全隱患，而且由于其不含全菌的所有抗原，有利于疾病的凈化。但目前豬支原體肺 炎亞單位疫苗免疫效果不佳，不能給豬提供完全的保護（Fagan PK, Djordievic SP. Chin J, et al. Oral immunization of mice with attenuated Salmonella typhimurium aroA expressing a recombinant Mycoplasma hyopeumoniae antigen (NrdF). Infection and immunity, 1997, 65:2502-2507) 〇


【發明內容】

[0005] 為了解決現有技術的不足，本發明提供了一種融合蛋白，以及含該融合蛋白的疫 苗組合物與應用。該疫苗組合物既能產生細胞免疫，又能產生體液免疫，能獲得較好的免疫 保護。
[0006] 本發明的主要目的在于提供一種融合蛋白，所述融合蛋白包含：
[0007] (1)假單胞桿菌外毒素 A結構域I，
[0008] (2)假單胞桿菌外毒素 A結構域II，
[0009] (3)豬肺炎支原體抗原性蛋白，以及
[0010] (4)羧基末端部分。
[0011] 其中，所述豬肺炎支原體抗原性蛋白位于假單胞菌外毒素 A結構域II與羧基末端 部分之間，且假單胞桿菌外毒素 A結構域II位于假單胞桿菌外毒素 A結構域I與所述豬肺 炎支原體抗原性蛋白之間。
[0012] 本發明所用術語"假單胞桿菌外毒素 A結構域I"是指與假單胞桿菌外毒素 A (Pseudomonas exotoxin A，簡稱為PEA)的氨基末端細胞受體結構域具有相同序列或具有 功能相當片段的肽片段。
[0013] 本發明所用術語"假單胞桿菌外毒素 A結構域II"是指與假單胞桿菌外毒素 A的 中間易位結構域具有相同序列或具有功能相當片段的肽片段。
[0014] 本發明所用術語"豬肺炎支原體抗原性蛋白"包括任何豬肺炎支原體菌株中具 有免疫原性的蛋白。優選地，所述豬肺炎支原體抗原性蛋白選自豬肺炎支原體J株（NCBI 登錄號為：AE017243. 1)、232 株（NCBI 登錄號為：AE017332. 1)、7448 株（NCBI 登錄號為： AE017244. 1)、7422 株（NCBI 登錄號為：CP003802. 1)、168 株（NCBI 登錄號為：CP002274. 1)、 168-L株（NCBI登錄號為：CP003131. 1)、P株或HN0613株中的免疫原性蛋白。
[0015] 所述豬肺炎支原體抗原性蛋白包括NrdF蛋白、P102蛋白、P97R1蛋白、P97R2蛋 白、P97Rl-NrdF蛋白或P97R2-NrdF蛋白中的任一蛋白。
[0016] 本發明所用術語"NrdF蛋白"為NrdF全蛋白中的具有免疫原性的蛋白片段， 即 NrdF 全蛋白的 R2 亞基 C 端（Fagan PK, Djordjevic SP, Eamens GJ, et al. Molecular characterization of a ribonucleotide reductase (NrdF) gene fragment of Mycoplasma hyopneumoniae and assessment of the recombinant product as an experimental vaccine for enzootic pneumonia. Infection and immunity, 1996, 64:1060-1064) 〇
[0017] 本發明所用術語"P102蛋白"為P102全蛋白中的具有免疫原性的蛋白片段。 其中，所述P102全蛋白位于P97蛋白下游，并與P97蛋白相鄰，且具有細胞粘附作用或 輔助P97蛋白的細胞粘附作用；P102全蛋白分子量為102. 3kD，由2700bp左右編碼而 成(Hsu T1Artiushin S1Minion FC. Cloning and functional analysis of the P97swine cilium adhesion gene of Mycoplasma hyoneumoniae. Journal of Bacteriology,1997 ,179 (4) :1317-1323 ；Djordievic SP, Cordwell SJ, Djordjecic MA, et al.Proteolytic processing of the Mycoplasma hyopneumoniae cilium adhesin.Infection and immunity, 2004, 72(5):2791-2802)。
[0018] 本發明所用術語"P97R1蛋白"是Mhp纖毛粘附因子P97蛋白編碼的C端的 兩個重復序列區域之一，由15個連續的5AA (AAKPV/E)基元構成（Hsu T, Artiushin S, Minion FC. Cloning and functional analysis of the P97swine cilium adhesion gene of Mycoplasma hyoneumoniae. Journal of Bacteriology, 1997, 179 (4) : 1317-1323) 〇
[0019] 本發明所用術語"P97R2蛋白"是Mhp纖毛粘附因子P97蛋白編碼的C端的 兩個重復序列區域之一，由4個連續的lOAA(GTPNQGKKAE)基元構成（Hsu T, Artiushin S, Minion FC. Cloning and functional analysis of the P97swine cilium adhesion gene of Mycoplasma hyoneumoniae. Journal of Bacteriology, 1997, 179 (4) : 1317-1323) 〇
[0020] 優選地，所述NrdF蛋白為SEQ ID No. 4編碼的蛋白，所述P102蛋白為SEQ ID No. 6 編碼的蛋白，所述P97R1蛋白為SEQ ID No. 8編碼的蛋白，所述P97R2蛋白為SEQ ID No. 10 編碼的蛋白。
[0021] 更優選地，所述NrdF蛋白的核苷酸序列為SEQ ID No. 3,所述P102蛋白的核苷酸 序列為SEQ ID No. 5,所述P97R1蛋白的核苷酸序列為SEQ ID No. 7,所述P97R2蛋白的核苷 酸序列為SEQ ID No. 9。
[0022] 所述羧基末端部分為含有氨基酸序列KDEL的多肽，其氨基酸序列為SEQ ID NO. 11、SEQ ID NO. 12、SEQ ID NO. 13、SEQ ID NO. 14 或 SEQ ID NO. 15。
[0023] 本發明所述羧基末端部分為KDEL家族蛋白中的成員。所用術語"KDEL家族蛋 白"是指一組蛋白質，其具有與細胞內質網膜結合的相似羧基端，并進一步具有可將該蛋 白質留存于內質網腔中以實現醣基化作用的能力，以便融合抗原更接近外源蛋白的肽片 段。通常，該羧基端的長度介于4-16個殘基之間。根據針對存在于不同分子中且執行特 定生物機能的相似序列所做的研究顯不：一種可在內質網中留存新形成蛋白的序列為Lys Asp Glu Leu(KDEL) (SEQ ID NO. 11)。從而說明：根據這一發明的融合抗原的羧基端上的序 列可作為某種類型的識別序列，協助融合抗原從內吞區室易位至內質網內，并將其留置于 內質網腔內。在一個較佳的實施方式中，該羧基末端部分包含KDEL的序列如SEQ ID NO. 11 所示。在一個更理想的實施方式中，該羧基末端部分包含KDEL-KDEL-KDEL(SEQ ID NO. 12) 或 KKDL-RDEL-KDEL 的序列（SEQ ID NO. 13)、KKDELRDELKDEL 的序列（SEQ ID NO. 14)或 KKDELRVELKDEL 的序列（SEQ ID NO. 15)，其中 R 為 D 或 V。
[0024] 本發明的另一目的在于提供一種制備所述豬肺炎支原體融合蛋白的方法，所述方 法包括：通過基因工程手段分別獲得所述PEA基因、所述豬肺炎支原體抗原性蛋白基因，將 其分別連接至克隆載體以獲得PEA克隆載體、豬肺炎支原體抗原性蛋白克隆載體；通過PCR 方法在構建的所述豬肺炎支原體抗原性蛋白基因羧基末端添加含KDEL的多肽序列，并連 接至克隆載體以獲得抗原性蛋白-KDEL克隆載體；將構建的所述抗原性蛋白-KDEL克隆載 體、所述PEA克隆載體通過酶切，構建同時包含PEA、抗原性蛋白-KDEL基因的克隆載體， 即豬肺炎支原體融合蛋白的克隆載體；將構建的所述豬肺炎支原體融合蛋白的克隆載體、 表達載體通過酶切，構建同時包含PEA、抗原性蛋白-KDEL基因的表達載體，即豬肺炎支原 體融合蛋白的表達載體；將所述豬肺炎支原體融合蛋白的表達載體導入受體菌進行誘導表 達，并對表達的豬肺炎支原體融合蛋白進行純化和鑒定以獲得豬肺炎支原體融合蛋白。
[0025] 優選地，所述基因工程手段是指運用分子生物學方法獲得所述PEA基因、所述豬 肺炎支原體抗原性蛋白基因，進一步優選為通過PCR方法擴增PEA基因、通過RT-PCR方法 擴增豬肺炎支原體抗原性蛋白基因；優選地，所述克隆載體為分子生物學可接受的克隆載 體，進一步優選為PMD18-T、pGEM-T、pUC18/19、pBR322 ;優選地，所述表達載體為pET，進一 步優選為pET-28a、pET-32a ;所述受體菌為大腸桿菌，進一步優選為Bal21。
[0026] 本發明的再一目的在于提供一種豬支原體肺炎疫苗組合物，包括免疫量的任一所 述融合蛋白和/或其組合以及獸醫學上可接受的佐劑。
[0027] 本發明所用術語"豬支原體肺炎"在臨床上的癥狀包括（但不限于）：呼吸癥狀 (嚴重急性臨床肺炎、咳嗽、呼吸困難、呼吸速迫）、發熱、高度傳染性、高發病率、低死亡率、 壞死性細胞支氣管炎及繼發性細菌性呼吸道感染增加。
[0028] 本發明所用術語"豬支原體肺炎疫苗組合物"是指能夠用于預防和/或治療由豬 肺炎支原體感染所知病癥或疾病的疫苗，該疫苗組合物可包括任何能夠有效預防和/或治 療豬受豬肺炎支原體感染的疫苗，能夠用于豬支原體肺炎疫苗組合物包括（但不限于）完 全或部分豬支原體肺炎細胞制劑、滅活或改良活體疫苗、亞單位疫苗。
[0029] 本發明所述的豬支原體肺炎疫苗組合物優選為亞單位疫苗，所述"亞單位疫苗"包 含一個或多個豬肺炎支原體衍生的多肽或蛋白質，或所述多肽或蛋白質的免疫原性片段， 或編碼所述一個或多個豬肺炎支原體衍生多肽或蛋白質，或所述多肽或蛋白質免疫原性片 段的一個或多個豬肺炎支原體基因或核酸，且所述基因或核酸能在豬體內進行表達。豬肺 炎支原體多肽、蛋白質、所述多肽和蛋白質的免疫原性片段、或豬肺炎支原體基因或核酸可 用于本領域公知技術合成或重組制備。
[0030] 本發明所用術語"預防和/或治療"在涉及豬肺炎支原體感染時是指抑制豬肺炎 支原體細菌的復制、抑制豬肺炎支原體的傳播或防止豬肺炎支原體在其宿主體內定居，以 及減輕豬肺炎支原體感染所之疾病或病癥的癥狀。若細菌荷載量減少、肺部感染減輕和/ 或攝食量和/或生長增加，那么就可以認為所述治療達到了治療效果。
[0031] 本發明所用術語"豬"是指任何屬于豬科（Suidae)成員的動物，如豬。
[0032] 本發明所用術語"免疫量"是指提供針對豬支原體肺炎疫苗組合物的免疫劑量，主 要取決于以下因素：被免疫動物的物種、品種、年齡、重量大小、健康狀態以及動物之前是否 接受過對抗同樣病毒的疫苗。
[0033] 在本發明的一種優選實施方式中，所述疫苗組合物，包括免疫量的所述融合蛋白 至少任意兩種的組合及獸醫學上可接受的佐劑。
[0034] 本發明所用術語"佐劑"可包括鋁膠佐劑；皂苷（saponin)，如Quil A、 QS-21(Cambridge Biotech Incorporation, Cambridge MA)、GPI-0100 (Galenica Pharmaceuticals Incorporation，Birmingham AL);油包水乳劑；水包油乳劑；水包油包水 乳劑；丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物；順丁烯二酸酐和鏈烯基（alkenyl)衍生物的共聚物 選出的化合物。
[0035] 本發明所用術語"乳劑"可尤其基于輕液體石錯油（^European Pharmacopea類 型）；因烯經寡聚產生的類異戊二烯油（isoprenoidoil)，如角S燒（squalane)或角S烯 油（squalene oil),尤其異丁烯或葵烯；酸或醇的含線性燒基的酯，更尤其植物油、油酸乙 酯、丙二醇二_(辛酸酯/葵酸酯）、甘油三_(辛酸酯/葵酸酯）或丙二醇二油酸酯；支鏈 脂肪酸或醇的酯，尤其異硬脂酸酯。油與乳化劑組合使用以便形成乳劑。乳化劑優選非離 子表面活性劑，尤其山梨聚糖的酯、二縮甘露醇（mannide)的酯（如無水甘露醇油酸酯）、 脂肪族二元醇（glycol)的酯、聚甘油（polyglycerol)的酯、丙二醇的酯以及油酸的酯、異 硬脂酸的酯、蓖麻油酸的酯或羥基硬脂酸的酯，它們任選乙氧基化，還有聚氧丙烯-聚氧乙 烯嵌段共聚物，尤其Pluronic產品，特別是L121。參見Hunter等編寫的《The theory and practical application of adjuvants)) (Ed. by DES Stewart-Tull, John Wiley and Sons, New York, 1995:51-94)和 Todd 等編寫的《Vaccine》（1997, 15:564-570)。例如，可使用 Powell M 和 Newman M 編寫的〈〈Vaccine design, the Subunit and adiuvant approach〉〉（Plenum Press, 1995)第147頁描述的SPT乳劑及第183頁描述的MF59乳劑。
[0036] 本發明所用術語"丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物"優選為交聯的丙烯酸或甲基 丙烯酸聚合物，尤其是與糖（sugar)的聚鏈烯基醚或聚醇交聯，這些化合物已知被稱為 卡波姆（Carbomer，商品名Carbopol) (Phameuropa, 1996, 8(2))。本領域技術人員還可 參見美國專利US2909462,其描述了這類丙烯酸聚合物，其與聚羥基化的化合物交聯，所 述化合物具有至少3個羥基，優選不超過8個，其中至少3個羥基的氫原子被具有至少2 個碳原子的不飽和脂烴基（aliphatic radical)取代。優選的基團是那些含有2-4個碳 原子的基團，例如乙烯基、烯丙基和其它烯屬不飽和基團（ethylenically unsaturated group)。所述不飽和基團自身可包含其它取代基，如甲基。這些產品以卡波普的名義出 售，（BF Goodrich, Ohio, USA)特別合適。它們與烯丙基鹿糖或與烯丙基季戊四醇（allyl pentaerythritol)交聯。這其中可提及卡波普974P、934P和971P，最優選使用卡波普971P。
[0037] 本發明所用術語"順丁烯二酸酐和鏈烯基衍生物的共聚物"也可考慮順丁烯二酸 酐與乙烯的共聚物EMA(Monsanto)，這些聚合物在水中溶解產生酸性溶液，經中和，優選中 和至生理pH，以便產生佐劑溶液，能向其中摻入免疫原性、致免疫性或疫苗性組合物本身。
[0038] 本發明所用術語"佐劑"還包括，但不限于，RIBI佐劑系統（Ribi Incorporation)、 Block c〇-polymer(CytRx，Atlanta GA)、SAF_M(Chiron，Emeryville CA)、單憐醜脂質 A(monophosphoryl lipid A)、Avridine脂質-胺佐劑、大腸桿菌不耐熱腸毒素（重組或其 它）、霍亂毒素、MS1314、胞壁酰二肽、Gel佐劑等。
[0039] 優選地，所述佐劑為鋁膠佐劑、皂苷、油包水乳劑、水包油乳劑、水包油包水乳劑、 丙烯酸、甲基丙烯酸的聚合物、順丁烯二酸酐和鏈烯基（alkenyl)衍生物的共聚物、RIBI佐 劑系統、Block c〇-polymer、SAF-M、單磷酰脂質A、Avridine脂質-胺佐劑、大腸桿菌不耐熱 腸毒素、霍亂毒素、IMS1314、胞壁酰二肽或Gel佐劑中的一種或幾種。
[0040] 更優選地，所述佐劑在所述疫苗組合物中的體積比為5 % -30 %。
[0041] 優選地，所述疫苗組合物還包括其他抗原，所述其他抗原包括豬圓環病毒抗原、豬 繁殖與呼吸綜合征病毒抗原、副豬嗜血桿菌抗原、豬細小病毒抗原、大葉性肺炎放線桿菌抗 原、大腸桿菌抗原、豬萎縮性鼻炎抗原、豬偽狂犬病病毒抗原、豬霍亂病原抗原、豬流感病毒 抗原中的一種或多種；進一步優選地，所述其他抗原為豬圓環病毒抗原。
[0042] 本發明又一目的在于提供所述疫苗組合物在制備預防和/或治療豬支原體肺炎 的藥物中的應用。
[0043] 本發明所用術語"豬肺炎支原體"與"Mhp"在本發明中可互換使用。
[0044] 本發明所用術語"開放閱讀框"或"0RF"是指編碼不含插入的終止密碼子的特定 Mhp蛋白質所需的最小核苷酸序列。
[0045] 本發明所用縮略語為：AA，氨基酸；bp，堿基對；kD，千道爾頓。
[0046] 本發明具有以下突出的優點：
[0047] (1)所述疫苗組合物可通過基因工程手段對其組分進行大量重組表達，不僅耗時 短，還可便于大規模生產；
[0048] (2)所述疫苗組合物既能產生細胞免疫，又能產生體液免疫，能獲得較好的免疫保 護。
[0049] 序列表中：
[0050] 序列1為假單胞桿菌外毒素 A結構域I與II的核苷酸序列；
[0051] 序列2為假單胞桿菌外毒素 A結構域I與II的氨基酸序列；
[0052] 序列3為NrdF蛋白的核苷酸序列；
[0053] 序列4為NrdF蛋白的氨基酸序列；
[0054] 序列5為P102蛋白的核苷酸序列；
[0055] 序列6為P102蛋白的氨基酸序列；
[0056] 序列7為P97R1蛋白的核苷酸序列；
[0057] 序列8為P97R1蛋白的氨基酸序列；
[0058] 序列9為P97R2蛋白的核苷酸序列；
[0059] 序列10為P97R2蛋白的氨基酸序列；
[0060] 序列11為羧基末端部分的氨基酸序列1 ;
[0061] 序列12為羧基末端部分的氨基酸序列2 ;
[0062] 序列13為羧基末端部分的氨基酸序列3 ;
[0063] 序列14為羧基末端部分的氨基酸序列4 ;
[0064] 序列15為羧基末端部分的氨基酸序列5 ;
[0065] 序列16為羧基末端部分的核苷酸序列。

【具體實施方式】
[0066] 下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述更 為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發明的范圍構成任何限制。本領域技術人 員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和范圍下可以對本發明技術方案的細節和形式進 行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護范圍內。
[0067] 本發明實施例中所用的豬肺炎支原體NrdF蛋白、P102蛋白、P97R1蛋白、P97R2蛋 白的序列，來源于已報道的國際標準株J株，在NCBI中的登錄號為AE017243. 1。
[0068] 本發明實施例中，以大腸桿菌表達載體為例進行表達，通過基因工程手段獲得豬 肺炎支原體NrdF蛋白、P102蛋白、P97R1蛋白、P97R2蛋白，但該實施方式無論在任何情況 下均不構成對本發明的限定。
[0069] 本發明實施例以Montanide?Gel01 (法國SEPPIC公司）作為佐劑，并以體積比為 10 %的佐劑，制備豬支原體肺炎疫苗組合物為例進行闡述，但該實施方式無論在任何情況 下均不構成對本發明的限定。
[0070] 本發明實施例中豬支原體肺炎疫苗組合物所含組分分別以：
[0071] (I)PEA-NrdF-KDEL ；
[0072] (2)PEA-P102-KDEL ；
[0073] (3)PEA-P97R1-KDEL ；
[0074] (4)PEA-P97R2-KDEL ；
[0075] (5)PEA-P97Rl-NrdF-KDEL ；
[0076] (6) PEA-P97R2-NrdF-KDEL ；
[0077] (7) PEA-NrdF-KDEL、PEA-P102-KDEL ;
[0078] (8) PEA-P102-KDEL、PEA-P97R1-KDEL ;
[0079] (9) PEA-P102-KDEL、PEA-P97R2-KDEL ;
[0080] (10) PEA-NrdF-KDEL、PEA-P102-KDEL、PEA-P97R1-KDEL ;
[0081] (I I) PEA-NrdF-KDEL、PEA-P102-KDEL、PEA-P97R2-KDEL ;
[0082] (12) PEA-NrdF-KDEL、PEA-P102-KDEL、PEA-P97R1-KDEL、PEA-P97R2-KDEL ;
[0083] (13) PEA-NrdF-KDEU PEA-P102-KDEL、PEA-P97R1-KDEL、PEA-P97R2-KDEL、 PEA-P97Rl-NrdF-KDEL ;和
[0084] (14) PEA-NrdF-KDEU PEA-P102-KDEL、PEA-P97R1-KDEL、PEA-P97R2-KDEL、 PEA-P97Rl-NrdF-KDEL、PEA-P97R2-NrdF-KDEL為例進行闡述，但該實施方式無論在任何情 況下均不構成對本發明的限定。
[0085] 本發明實施例中所采用的攻毒毒株為豬肺炎支原體CVCC354株，該毒株的保藏號 為CVCC354,保藏單位為國家獸醫微生物菌種保藏管理中心。
[0086] 本發明實施例中肺病變指數采用28分法進行評判。所述28分法是根據豬支原體 肺炎的典型肺部眼觀病變，對發病程度進行量化判定，包括肺尖葉、心葉、膈葉、中間葉出現 的實質樣病變，如"肉樣變"、"胰樣變"。肺炎病變評分標準為：2個尖葉、2個心葉、2個膈 葉、1個中間葉共計7個肺葉，每個肺葉滿分為4分，共計28分。根據發生實質病變的肺葉 面積所占該葉的比例，分別對每個肺葉進行打分。無肺炎病變記為〇分；病變面積比例為 1% -25%，記為1分；病變面積比例26% -50%，記為2分；病變面積比例為51% -75%，記 為3分；病變面積比例為76% -100%，記為4分。如肺葉正反兩面均有病變，以病變面積大 的一面進行記分。各個肺葉打分總和即為該發病株的肺炎病變得分。分別對免疫組豬和對 照組豬進行記分后，按照以下公式計算免疫組豬的肺葉病變減少率：
[0087]

【權利要求】
1. 一種融合蛋白，所述融合蛋白包含： (1) 假單胞桿菌外毒素 A結構域I， (2) 假單胞桿菌外毒素 A結構域II， ⑶豬肺炎支原體抗原性蛋白，以及 (4)羧基末端部分。
2. 根據權利要求1所述融合蛋白，其特征在于，所述豬肺炎支原體抗原性蛋白包括 NrdF蛋白、P102蛋白、P97R1蛋白、P97R2蛋白、P97Rl-NrdF蛋白或P97R2-NrdF蛋白中的任 一蛋白。
3. 根據權利要求2所述融合蛋白，其特征在于，所述NrdF蛋白為SEQ ID No. 4編碼的 蛋白，所述P102蛋白為SEQIDNO.6編碼的蛋白，所述P97Rl蛋白為SEQIDN O.8編碼的蛋 白，所述P97R2蛋白為SEQ IDNo. 10編碼的蛋白。
4. 根據權利要求1所述融合蛋白，其特征在于，所述羧基末端部分為含有氨基酸序列 KDEL 的多肽，其氨基酸序列為 SEQ ID NO. 11、SEQ ID NO. 12、SEQ ID NO. 13、SEQ ID NO. 14 或 SEQ IDNO. 15。
5. 根據權利要求1所述融合蛋白，其特征在于，所述豬肺炎支原體抗原性蛋白位于假 單胞菌外毒素 A結構域II與羧基末端部分之間，且假單胞桿菌外毒素 A結構域II位于假 單胞桿菌外毒素 A結構域I與所述豬肺炎支原體抗原性蛋白之間。
6. -種制備如權利要求1所述融合蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括：通過基因 工程手段，依次構建所述融合蛋白的克隆載體、表達載體，并對所述融合蛋白進行表達、純 化及鑒定。
7. -種豬支原體肺炎疫苗組合物，其特征在于，所述疫苗組合物包括免疫量的如權利 要求1-2任一項所述融合蛋白和/或其組合以及獸醫學上可接受的佐劑。
8. 根據權利要求7所述疫苗組合物，其特征在于，所述佐劑為鋁膠佐劑、皂苷、油包水 乳劑、水包油乳劑、水包油包水乳劑、丙烯酸、甲基丙烯酸的聚合物、順丁烯二酸酐和鏈烯 基（alkenyl)衍生物的共聚物、RIBI佐劑系統、Block co-polymer、SAF-M、單磷酰脂質A、 Avridine脂質-胺佐劑、大腸桿菌不耐熱腸毒素、霍亂毒素、IMS1314、胞壁酰二肽或Gel佐 劑中的一種或幾種；優選地，所述佐劑為Gel佐劑。
9. 根據權利要求7-8任一項所述疫苗組合物，其特征在于，所述疫苗組合物還包括其 他抗原，所述其他抗原包括豬圓環病毒抗原、豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗原、副豬嗜血桿菌 抗原、豬細小病毒抗原、大葉性肺炎放線桿菌抗原、大腸桿菌抗原、豬萎縮性鼻炎抗原、豬偽 狂犬病病毒抗原、豬霍亂病原抗原、豬流感病毒抗原中的一種或多種；優選地，所述其他抗 原為豬圓環病毒抗原。
10. 權利要求7-9任一項所述疫苗組合物在制備預防和/或治療豬支原體肺炎的藥物 中的應用。
【文檔編號】A61K39/295GK104277115SQ201410188776
【公開日】2015年1月14日 申請日期:2014年5月5日 優先權日:2014年5月5日
【發明者】張許科, 孫進忠, 王瑩, 田克恭 申請人:普萊柯生物工程股份有限公司