專利名稱：：C型產氣莢膜梭菌用于制備疫苗的用途的制作方法c型產氣莢膜梭菌用于制備疫苗的用途本發明涉及C型產氣莢膜梭菌(C7os"^f/咖/7er/V/z^e/7S)用于制備疫苗的用途。梭菌是形成孢子的革蘭氏陽性厭氧菌。梭菌被廣泛公認為是家畜與野生動物的病原體。Songer，J.G.inTheClostridia;Chapter10:ClostridialDiseasesofAnimals,MolecularbiologyandPathogenesis,ed.Rood,J.I.etal.，AcademicPressLtd(1997)ISBN0-12-595020-9綜述了各種梭菌和它們引起的動物疾病。在目前已知的梭菌種類中，產氣莢膜梭菌有時被認為是最廣泛存在的細菌病原體，而且在所有的梭菌種類中，它亳無疑問地是家畜中梭菌腸病最重要的原因。基于它們產生的主要毒素，產氣莢膜梭菌種被再劃分為五種型，A-E型。A和C型產氣莢膜梭菌，與難辨梭菌是豬的主要腸道梭菌病原體。Songer，J,G.和Uzal，F.A,(J.Vet.Diagn.Invest17:528-536(2005))具體描述了豬中的梭菌腸感染。C型產氣莢膜梭菌感染豬、牛、雞、人、綿羊、狗和馬。仔豬最容易受C型產氣莢膜梭菌感染。在l-2天大的仔豬中，這種感染導致了30%-50%的發病率，和引起50%-100%的死亡率。較大的仔豬(1-2周齡)可能具有較長的感染過程。母豬是感染的普遍來源。保護仔豬的常用方法是用C型產氣莢膜梭菌疫苗接種母豬，以誘導能通過初乳傳遞給它們的后代的抗體。這導致在仔豬最易受梭菌感染的時候，對仔豬高水平的保護。這種疫苗是基于類毒素。通常，它們是脫毒上清液疫苗，其中不存在細胞。Springer,S.和Selbitz，H.-J.(濯SImmum.andMedicalMicrobiol.24:333-336(1999))已經描述了類毒素疫苗。A型產氣莢膜梭菌感染羔羊、山羊、小牛、雞、豬、馬、狗和人。在充分發育的豬中，A型產氣莢膜梭菌是正常的腸菌群的成員。因此目前假設，充分發育的豬不受腸內A型產氣莢膜梭菌存在的不利影響。但是它可能在新生的和斷奶的豬中引起豬壞死性小腸結腸炎。用于保護豬對抗A型產氣莢膜梭菌的疫苗很少。目前僅僅有一種商業可獲得的(有條件地批準的)疫苗。這種情況的原因之一可能是，如上所述，A型產氣莢膜梭菌是正常菌群的成員的事實。因此，人們不會期望它觸發免疫系統。因此，人們不會期望誘導對抗A型產氣莢膜梭菌的抗體產生。如果誘導了抗體，A型產氣莢膜梭菌將不會存活于腸中，更別說是正常菌群的成員了。因此，更進一步地，人們當然不會期望母豬通過初乳傳遞任何保護給它們的后代了。無論由于什么原因，A型產氣莢膜梭菌似乎不能誘導足夠的免疫刺激。目前已經令人驚訝地發現，包含脫毒的培養物上清液的C型產氣莢膜梭菌疫苗非常能誘導對抗A型產氣莢膜梭菌感染的交叉保護。更令人驚訝的是，發現用C型產氣莢膜梭菌培養物上清液接種母豬導致對它們的仔豬對抗A型產氣莢膜梭菌感染的顯著保護。更加令人驚訝的是，發現甚至母豬在這種疫苗接種以后也表現較好。這是令人驚訝的，因為如上所述，一般假設，充分發育的豬如母豬不受A型產氣芙膜梭菌感染的不利影響。此發現第一次證明了相反的情況。因此，本發明的第一個實施方案涉及C型產氣莢膜梭菌用于制備疫苗的應用，該疫苗用于保護充分發育的豬對抗A型產氣莢膜梭菌感染。本發明的第二個實施方案涉及C型產氣莢膜梭菌用于制備疫苗的應用，該疫苗用于保護母豬對抗A型產氣莢膜梭菌感染。本發明的第三個實施方案涉及C型產氣莢膜梭菌用于制備用于母豬的疫苗的應用，該疫苗用于保護仔豬對抗A型產氣莢膜梭菌感染。本發明的第四個實施方案涉及c型產氣莢膜梭菌用于制備疫苗的應用，該疫苗用于保護仔豬對抗A型產氣莢膜梭菌感染。因為本領域技術人員將理解，實際上，C型產氣莢膜梭菌用于制備疫苗的應用是一個兩步的過程C型產氣莢膜梭菌用于在培養基中生長，以獲得培養物上清液，其是用于制備本發明的疫苗的基礎。因此，本發明的另一個實施方案涉及C型產氣莢膜梭菌培養物上清液用于制備疫苗的應用，該疫苗用于保護充分發育的豬對抗A型產氣莢膜梭菌感染。仍然是本發明的另一個實施方案，涉及C型產氣莢膜梭菌培養物上清液用于制備疫苗的應用，該疫苗用于保護母豬對抗A型產氣莢膜梭菌感染。又是本發明的另一個實施方案，涉及C型產氣莢膜梭菌培養物上清液用于制備用于母豬的疫苗的應用，該疫苗用于保護仔豬對抗A型產氣莢膜梭菌感染。還是本發明的一個實施方案，涉及C型產氣莢膜梭菌培養物上清液用于制備疫苗的應用，該疫苗用于保護仔豬對抗A型產氣莢膜梭菌感染。在C型產氣莢膜梭菌毒素類型之間，可以在產生P刁毒素的那些菌林與不產生P-2毒素的那些菌林之間進行區分。所有的C型產氣莢膜梭菌菌株中大約40%產生這種毒素。發現產生e_2毒素的C型產氣莢膜梭菌比不產生P-2毒素的C型產氣莢膜梭菌更適合。Fisher，D.J.等人(Inf.&Immun.74:5200-5210(2006))描述了這種菌抹和它們的鑒定。因此，該實施方案的一個優選形式涉及一種應用，其中使用產生0-2毒素的C型產氣莢膜梭菌。如上所述制備的疫苗決不是在工業的豬飼養過程中施用給豬的唯一疫苗。經常在大約與對抗其他的豬病原生物和病毒的疫苗同時提供梭菌的疫苗。因此，在另一個優選的實施方案中，如本發明中所述制備的疫苗另外包括一種或多種來源于豬病原生物或病毒的抗原，抗那些抗原的抗體或編碼這種抗原的遺傳信息。這種生物體或病毒優選地選自偽狂犬病病毒，PRRS病毒，豬流感病毒，豬細小病毒，豬傳染性胃腸炎病毒，輪狀病毒，大腸桿菌，紅斑丹毒絲菌，支氣管炎博德特氏菌，鼠傷寒沙門氏桿菌，豬霍亂沙門氏菌，副豬嗜血桿菌，多殺性巴氏桿菌，豬鏈球菌，豬肺炎霉形體，豬痢疾短螺旋體和胸膜肺炎放線桿菌。因此，這個實施方案的一種更優選的形式涉及一種如本發明中所迷制備的疫苗，其另外包括一種或多種來源于豬病原生物或病毒的抗原，其中這些生物體或病毒選自偽狂犬病病毒，PRRS病毒，豬流感病毒，豬細小病毒，豬傳染性胃腸炎病毒，輪狀病毒，大腸桿菌，紅斑丹毒絲菌，支氣管炎博德特氏菌，鼠傷寒沙門氏桿菌，豬霍亂沙門氏菌，副豬嗜血桿菌，多殺性巴氏桿菌，豬鏈球菌，豬肺炎霉形體，豬痢疾短螺旋體和胸膜肺炎放線桿菌。緊接著產氣莢膜梭菌感染以后，仔豬經常遭受大腸桿菌感染。大腸桿菌是仔豬中另一種嚴重的腸道疾病的原因。因此，經常用大腸桿菌疫苗接種仔豬或妊娠母豬。大腸桿菌疫苗通常用于本領域，而且它們是市場上可買到的。因此，一種包括C型產氣莢膜梭菌培養物上清液與大腸桿菌疫苗組分的組合疫苗是非常合乎需要的，因為它能防止C型產氣莢膜梭菌，A型產氣莢膜梭菌和大腸桿菌感染。因此，這個實施方案的一種最優選的形式涉及一種如本發明中所述制備的疫苗，其另外包括來源于豬病原生物大腸桿菌的一種或多種抗原。在下面的實施例中以非限制性方式對本發明進行舉例說明。實施例C型產氣莢膜梭菌抗原的產生將一抹標準的C型產氣莢膜梭菌菌林，菌林587(也稱為CWC1/S，來自WeybridgeU.K.Collection)培養于發酵罐中直到靜止生長期開始。離心培養物，丟棄包含細菌細胞的沉淀。添加甲醛到上清液中至O.5%v/v的終濃度，以滅活毒素，接著通過超濾和0.2jjm過濾來進行濃縮。疫苗制備通過混合C型產氣莢膜梭菌抗原與基于生育酚的佐劑來配制疫苗。每個疫苗劑量(2ml)包括20p117倍濃縮的C型產氣莢膜梭菌抗原類毒素培養物上清液濃縮物。該疫苗遵照關于C型疫苗的安全和效力的歐洲藥典專題論文0363(產氣莢膜梭菌疫苗用于獸醫應用)。另外，在這個實驗中，添加純化的大腸桿菌抗原(F4ab，F4ac，F5和F6纖毛和不耐熱的毒素)，以抑制可能的大腸桿菌感染。這些組分是本領域已知的，而且本領域技術人員將知道如何制備基于這些組分的疫苗。作為選擇，但是本領域技術人員能使用市場上可買到的而且現成即可4吏用的大腸桿菌疫苗，如PorcilisPorcoliDF(可通過IntervetInt.B.V.，WimdeKorverstraat35，Boxmeer，TheNetherlands獲得)。對照疫苗包括相同的組分，除C型產氣莢膜梭菌抗原之外，其不存在于對照組中。母豬的保護一個荷蘭豬生產農場，其中曾有一次臨床的A型產氣莢膜梭菌爆發，被選擇用于隨機化雙盲實地藥效研究。發現分離自該農場的A型產氣莢膜梭菌產生ct-毒素與P2-毒素。懷孕期間，產仔之前大約6到2周，母豬用僅僅包含大腸桿菌抗原的疫苗(對照組)或用包含大腸桿菌抗原和C型產氣莢膜梭菌抗原的疫苗(測試組)IM接種。疫苗用不同的顏色標記(2x測試疫苗，lx對照疫苗)，以保證雙盲，兩組中母豬的分配為大約2:1(表l)。表l.組大小<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>從第一次疫苗接種當天直到仔豬斷奶時(產仔以后3-4周)，每3天觀察母豬的總體健康，采食量和腹瀉。為了便于統計學分析，使用了臨床打分系統(表2)。在生活的第一周期間，每天觀察生來就接種的母豬的仔豬，從一周直到斷奶每三天一次，此后每周一次直到看護期結束。記錄總體健康，釆食量，腹瀉和死亡率(表2)。表2用于母豬和仔豬的打分系統<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>結果表3.母豬的臨床觀察<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>表3顯示了相較于用不含C型產氣莢膜梭菌抗原的疫苗接種，用包含C型產氣莢膜梭菌抗原的疫苗接種的影響。如從表3清楚得出的，用包含C型產氣莢膜梭菌抗原的疫苗接種導致母豬健康狀況非常顯著的改善。接種母豬的后代的保護同樣，將用包含C型產氣莢膜梭菌抗原的疫苗接種的母豬的同窩仔中的死亡率與用不含C型產氣莢膜梭菌抗原的疫苗接種的母豬的同窩仔中的死亡率進行比較。如從表4清楚得出的，用包含C型產氣莢膜梭菌抗原的疫苗接種的母豬的同窩仔中的死亡率顯著低于對照組。此外，表5表明來自用包含C型產氣莢膜梭菌抗原的疫苗接種的母豬的仔豬具有顯著低于對照組的臨床分數。表4.對照和測試同窩仔中的每周死亡率<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>表5.仔豬的臨床觀察<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>結論:數據表明,用包含C型產氣莢膜梭菌抗原的疫苗接種母豬導致在面臨A型產氣莢膜梭菌爆發時，接種的母豬和它們的后代健康狀況顯著的改善。權利要求1)C型產氣莢膜梭菌用于制備疫苗的應用，該疫苗用于保護充分發育的豬抗A型產氣莢膜梭菌感染。全文摘要本發明涉及C型產氣莢膜梭菌用于制備疫苗的應用。文檔編號A61K39/08GK101541343SQ200780042707公開日2009年9月23日申請日期2007年11月19日優先權日2006年11月20日發明者J·F·M·斯密特斯,K·利德黑德,M·H·維特維利特申請人:英特威國際有限公司