一種用于免疫治療的eb病毒lmp2a串聯表位肽及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于免疫學技術領域，尤其涉及一種用于免疫治療的EB病毒LMP2A串聯表 位肽及其應用。
【背景技術】
[0002] EB病毒（Epstein-BarrVirus，EBV)屬于皰疹病毒γ亞科嗜淋巴細胞病毒成員， 是人類發現的第一個與腫瘤發生有關的人類病毒。ΕΒ病毒感染的靶細胞主要為Β淋巴細 胞。最近的研究證實，ΕΒ病毒還可感染人體Τ細胞、ΝΚ細胞、單核巨噬細胞。ΕΒ病毒感染與 多種疾病有關，如與非洲兒童Burkit淋巴瘤、鼻咽癌、霍奇金淋巴瘤、成人Τ/ΝΚ細胞淋巴 瘤、各種免疫抑制劑治療患者和器官移植患者淋巴細胞增生紊亂引起的淋巴瘤及EBV相關 的噬血細胞增多癥等密切相關。EB病毒感染靶細胞后表達多種蛋白，包括6種核抗原EBN A1、2、3A、3B、3C、和LP，3種潛伏期膜蛋白LMP1、2A、2B)和2種基因EBER-1、2，其中LMP2 (LMP2A、2B)在噬血細胞綜合癥、淋巴瘤和淋巴細胞增殖病細胞中均有表達。EB病毒的這些 蛋白抗原可以誘發機體的細胞免疫反應。
[0003] 自1964年在鼻咽癌（nasopharyngealcarcinoma，NPC)組織中首先發現存在有EB 病毒DNA以來，大量的血清流行病學研究已證明EB病毒與鼻咽癌有關。鼻咽癌是上皮來源 的惡性腫瘤，高發于東南亞及我國華南地區。臨床上鼻咽癌通常不宜手術治療，放療、化療 后也不能完全有效清除腫瘤細胞，部分患者易復發和轉移，并且治療產生的副作用又影響 了自身的免疫系統。因此目前，在倡導鼻咽癌綜合治療的同時更加注重免疫治療。
[0004] T細胞只能識別由抗原遞呈細胞（APC)遞呈的抗原肽-MHC分子復合物。樹突狀細 胞（DC)是目前發現功能最強的APC，能激發初始型和記憶型T細胞，產生有效的CTL應答。 其以DC為基礎的免疫治療已在許多腫瘤的治療中取得了良好的效果，可對腫瘤細胞進行 有效的靶向性殺傷，而不傷害正常細胞，是當前抗腫瘤免疫治療研究的熱點之一。但是，目 前的殺瘤效率都還較低。

【發明內容】

[0005] 針對以上技術問題，本發明公開了一種用于免疫治療的EB病毒LMP2A串聯表位 肽及其應用，將所述EB病毒LMP2A(latentmembraneprotein2A，潛伏膜蛋白2A)串聯 表位肽負載人外周血來源的DCs，DCs可被有效地激活，誘導成熟并能夠將其遞呈到DCs (dendriticcells，樹突狀細胞)細胞表面，與CTL細胞共培養后可激活特異性的抗病毒CTL (cytotoxicTlymphocytes，細胞毒性T淋巴細胞)，并可分泌更多的細胞因子，促進淋巴細 胞的增殖，具有更顯著的腫瘤殺傷功能，更高的腫瘤細胞殺傷效率。
[0006] 對此，本發明采用的技術方案為： 一種用于免疫治療的EB病毒LMP2A串聯表位肽，所述用于免疫治療的EB病毒LMP2A串聯表位肽包括SEQIDNO: 1的氨基酸序列。
[0007] 采用此技術方案，將LMP2A356364和LMP2A 426434進行串聯，得到LMP2A串聯表位肽 LMP2A356 364/426 434?LMP2A356 364和LMP2A426 434的序列為： LMP2A356364：FLYALALLL； LMP2A426434：CLGGLLTMV； 兩者串聯后得到的串聯表位妝LMP2A356 364/426 434的序列為： 串聯表位肽LMP2A:FLYALALLLCLGGLLTMV。
[0008] 用體外構建質粒，包裝病毒轉染DCs的方法雖然可使目的蛋白在DCs內表達，但 病毒的安全性在臨床應用中仍受到一定限制，且不易被患者所接受。另外病毒對DCs的感 染效率和表達效率都與病毒包裝的滴度相關，操作重復性較差。而采用抗原表位肽對DCs 直接負載，操作簡便，可重復性高，而且經過實驗證實發現LMP2A的串聯肽與單個表位肽相 比，能更有效地誘導DCs成熟，促進特異性CTL的增殖，能夠更加有效地靶向性殺傷鼻咽癌 細胞系。
[0009] 所述LMP2A串聯表位肽356 364/426 434負載DCs后，能更加有效地促進DCs成熟和表 位肽遞呈能力，可以分泌更多的細胞因子。負載了該串聯表位肽的DCs與CTL共培養后，可 誘導出EB病毒特異性的CTL細胞，實驗證明，其在體外和體內均可有效地靶向性殺傷鼻咽 癌細胞系CNE1。
[0010] 通過體外細胞培養方法激活和大量增殖患者自身的DCs，有效負載病毒的抗原多 肽，并與大量增殖的CTL細胞聯合培養，再回輸患者體內，直接提高了患者的抗病毒能力， 打破機體的免疫耐受狀態。
[0011] 本發明還公開了所述用于免疫治療的EB病毒LMP2A串聯表位肽的應用，其用于EB 病毒相關的疾病的免疫細胞臨床治療中。進一步的，用于鼻咽癌的免疫細胞臨床治療中。
[0012] 鼻咽癌患者體內存在不同程度的免疫功能低下，其中DCs的數量和功能均有缺 陷，患者的抗原提呈細胞（AntigenPresentingCell,APC)往往不能正確地處理和提呈抗 原信號，直接影響了有效的CTL抗病毒反應。因此采用EB病毒LMP2A表位肽體外致敏DCs 再回輸給患者，可大大提高DCs對病毒抗原的提呈能力，激發特異性CTL的免疫應答反應。
[0013] 本發明的有益效果為： 本發明的技術方案采用將EB病毒潛伏膜蛋白不同抗原多肽串聯在一起，體外合成串 聯表位肽，負載人外周血來源的DCs，發現其可以更加有效地促進DCs增殖和成熟，使其可 以分泌更多的細胞因子，負載了該串聯表位肽的DCs與CTL共培養后，可激活特異性的抗病 毒CTL，誘導出EB病毒特異性的CTL細胞，促進淋巴細胞的增殖，在體外和體內均可有效地 靶向性殺傷鼻咽癌細胞系CNE1，且效果比單獨應用LMP2A356 364或LMP2A426 434或兩種表位肽 混合物更好。
[0014] 實驗結果表明，與現有技術相比，采用本發明的技術方案能達到更高的誘導效率 和體外體內實驗的有效性，其誘導效率比現有技術高10-20%。由此可見，本發明技術方案 的LMP2A串聯表位肽在治療鼻咽癌及EB病毒相關的其它疾病的免疫細胞臨床治療方面具 有巨大的應用潛力。
【附圖說明】
[0015] 圖1是本發明一種實施例串聯表位肽負載DCs的負載效率熒光檢測結果圖，從左 到右依次為放大100倍，200倍和400倍的圖。
[0016]圖2是本發明一種實施例采用流式細胞儀檢測表位肽負載后DCs表型的檢測分 析圖。圖中，LMP2A356-364/426-434DC為LMP2A串聯表位肽負載DCs，LMP2Amix為混合 LMP2A356 364和LMP2A426 434表位肽負載DCs，LMP2A356-364DC為LMP2A356 364表位肽負載DCs， LMP2A426-434DC為LMP2A426 434表位肽負載DCs，下同。
[0017] 圖3是本發明一種實施例負載了表位肽的DCs與T細胞的混合淋巴細胞反應六天 后流式細胞術檢測PBL的增殖曲線圖。
[0018] 圖4是本發明一種實施例負載了串聯表位肽的DCs活化T細胞分泌細胞因子的檢 測圖，其中A為IL-2分泌檢測；B為IFN- γ分泌檢測；C為TNF- α分泌檢測。
[0019] 圖5是本發明一種實施例負載了串聯表位肽的DC-CTL體外的殺瘤效率檢測分析 圖。
[0020] 圖6是本發明一種實施例負載了串聯表位肽的DC-CTL治療腫瘤模型動物的腫瘤 體積變化分析圖。
【具體實施方式】
[0021] 下面結合附圖，對本發明的較優的實施例作進一步的詳細說明。
[0022] 1、體外合成ΕΒ病毒串聯表位肽 本發明中采用串聯兩個HLA*02:01型LMP2A表位肽，LMP2A356 364和LMP2A426 434的序列 為： LMP2A356364：flyalalll； LMP2A426434：clgglltmv； 將兩者串聯得到串聯表位妝LMP2A356 364/426 434，得到的LMP2A串聯表位妝的序列為：LMP2A串聯表位肽：FLYALALLLCLGGLLTMV。
[0023] 將LMP2A串聯表位肽負載DC細胞。
[0024] 按照現有技術的方法合成上述三種表位肽，本例的串聯表位肽按照現有技術的常 規方法合成。經高效液相色譜和質譜分析鑒定證明合成的表位肽的序列和分子量均正確， 且純度達到95%以上，符合實驗要求。
[0025] 根據表位肽的溶解性，將其溶解在水或二甲基亞砜（DMS0)中，表位肽的儲存液濃 度為10mg/ml，用0. 22μm的針筒濾器過濾除菌，分裝后于-20°C保存。采用現有技術的方 法，進行表位肽負載DCs;表位肽負載DCs時表位肽的終濃度為40μg/ml。
[0026] 2、DCs和CTL的分離培養 (1)無菌條件下取正常人外周靜脈血60ml，離心后取下層細胞層，加入PBS(Phosphate BufferedSaline，磷酸鹽緩沖液）以1:1的比例進行稀釋后，緩慢加入到淋巴細胞分離液 上，1000g室溫水平離心25min，取中間白膜層細胞，用PBS洗兩遍。
[0027] (2)DCs的體外培養和表位肽負載 加入RPMI1640培養基，調整細胞密度為2X106/ml，在10cm培養皿中加入5ml細胞懸 液，并放置于37°C，5%體積濃度的C02培養箱中貼壁培養2h。然后將其中的懸浮細胞作為 T細胞進行培養，貼壁細胞加入DCs培養基中，所述DCs培養基為含有100ng/mlGM-CSF和 50ng/mlIL-4的RPMI1640培養基。在37°C，5%體積濃度的C02培養箱中繼續培養，每兩 天半量換液。第六天，在不同培養皿中分別加入LMP2A串聯表位肽、LMP2A356 364和LMP2A426 434 表位肽的混合物(兩者濃度比例為1:1 )、表位肽LMP2A356 364、表位肽LMP2A426 434，終濃度均為 40μg/ml。第七天，分別加入50ng/mlTNF-α，培養48小時后檢測DCs的表型。
[0028] (3)T淋巴細胞的培養和DC-CTL的體外誘導 將步驟（2)中的懸浮細胞作為T細胞進行培養。細胞濃度調整為107/ml，與步驟（2)中 負載了不同表位肽的DCs分別進行混合培養，DCs與CTL的比例為1:10。