專利名稱：一種泥鰍霍亂弧菌疫苗的制備方法
技術領域：
本發明涉及一種泥鰍抗病疫苗的制備方法，特別是涉及一種泥鰍霍亂弧菌疫苗的 制備方法；本發明還涉及該疫苗的免疫使用方法。
背景技術：
隨著人民生活水平的提高，有“水中人參”美譽的泥鰍的需求量不斷提高，尤其是 由于韓國、日本等周邊市場對我國泥鰍的大量需求，泥鰍已經成為我國出口創匯水產品的 重要組成部分，我國每年出口產值達數十億元。江蘇連云港地區已形成了泥鰍大規模人工 集約化養殖，但由病原細菌引起的疾病，給泥鰍養殖生產造成了很大的經濟損失。近年來 我們在對泥鰍細菌性疾病調研中，發現霍亂弧菌可引起泥鰍感染發病，并嚴重危害泥鰍養 殖生產，該菌廣泛分布于水環境，已知有不少血清型株能引起水產動物感染發病，可引起人 散發胃腸炎，在特殊條件下也可引起敗血癥、腦膜炎、傷口感染等腸道外感染，是人和水產 養殖動物共染的病原菌。在泥鰍細菌性疾病防控方面，大多使用化學合成藥物或抗生素類 藥物控制疾病的發生與流行，但在長期的藥物使用中，藥物在動物體中殘留，危害到人類的 健康，且長期用藥帶來環境污染，并導致耐藥性微生物大量出現，同時已成為出口創匯的壁 壘，嚴重影響了養殖業的發展。因此，應用免疫學技術預防泥鰍細菌性疾病的發生已迫在眉 睫。現有技術中尚未有泥鰍抗病疫苗方面的研究，目前養殖戶大多使用化學合成藥物 或抗生素類藥物控制疾病的發生與流行，市場上沒有一種適用于泥鰍的針對霍亂弧菌的疫苗。

發明內容
本發明所要解決的技術問題的是針對現有技術的不足，提供一種提高泥鰍免疫 力、降低泥鰍養殖生產中由病原霍亂弧菌所造成的危害、以滿足泥鰍養殖生產上的抗病需 求的泥鰍霍亂弧菌疫苗的制備方法。本發明所要解決的另一個技術是提供了幾種如上所述的泥鰍霍亂弧菌疫苗的免 疫使用方法。本發明所要解決的技術問題是通過以下的技術方案來實現的。本發明是一種 泥鰍霍亂弧菌疫苗的制備方法，其特點是它以泥鰍病原霍亂弧菌LD081008B-1 (Vibrio cholerae LD081008B-1)為免疫原，以黃芪浸出液為佐劑；其制備方法步驟如下(1)將霍亂弧菌LD081008B-1菌株接種在普通營養肉湯培養基上，28_30°C培養 18-24h后，加入體積終濃度0. 3%的甲醛28-30°C滅活48h，得滅活菌體；(2)取黃芪用蒸餾水浸泡30-60min后煎煮，過濾，濃縮至終濃度為原藥lg/mL，得 黃芪浸出液；(3)將滅活菌體與黃芪浸出液混合，制得水劑型黃芪佐劑泥鰍霍亂弧菌疫苗；二 者的混合比例為每毫升黃芪浸出液中加入的滅活菌體為3. 2X108cells。
以上所述的制備方法所制得的泥鰍霍亂弧菌疫苗的一種免疫使用方法是它采用 浸泡免疫的方法，先將受免泥鰍在充氣條件下用質量濃度為8%的NaCl溶液浸泡5min，然 后按體積比1 5用水稀釋泥鰍霍亂弧菌疫苗得泥鰍霍亂弧菌疫苗溶液，再將受免泥鰍放 于泥鰍霍亂弧菌疫苗溶液中充氣浸泡lh，一周后按前述方法加強免疫1次。以上所述的制備方法所制得的泥鰍霍亂弧菌疫苗的又一種免疫使用方法是它采 用注射免疫的方法，取體長為8-12cm的泥鰍按0. ImL/尾的免疫劑量進行初次注射免疫，后 每隔一周按前述免疫劑量加強免疫1次，共免疫4次。以上所述的制備方法所制得的泥鰍霍亂弧菌疫苗的再一種免疫使用方法是采用 口服免疫方法，將硬顆粒飼料用泥鰍霍亂弧菌疫苗浸泡后投喂，每天魚體攝入滅活菌體量 為3. 2X 106cells/g體重，連續投喂一周，隔周后再按前述方法進行加強免疫一周。本發明中所述的霍亂弧菌LD081008B-1 (Vibrio choleraeLD081008B_l)已經在 《泥鰍病原霍亂弧菌的表型與分子鑒定》中公開，該公開文獻的發表刊物為《海洋與湖沼》， 2009，40 (6) =692-698.該菌株的分離菌DNA序列長度及登錄號如下表分離菌DNA序列長度及登錄號
權利要求
1.一種泥鰍霍亂弧菌疫苗的制備方法，其特征在于它以泥鰍病原霍亂弧菌 LD081008B-1 (Vibrio cholerae LD081008B-1)為免疫原，以黃芪浸出液為佐劑；其制備方 法步驟如下(1)將霍亂弧菌LD081008B-1菌株接種在普通營養肉湯培養基上，28_30°C培養18_24h 后，加入體積終濃度0. 3%的甲醛28-30°C滅活48h，得滅活菌體；(2)取黃芪用蒸餾水浸泡30-60min后煎煮，過濾，濃縮至終濃度為原藥lg/mL，得黃芪 浸出液；(3)將滅活菌體與黃芪浸出液混合，制得水劑型黃芪佐劑泥鰍霍亂弧菌疫苗；二者的 混合比例為每毫升黃芪浸出液中加入的滅活菌體為3. 2X108cells。
2.一種如權利要求1所述的制備方法所制得的泥鰍霍亂弧菌疫苗的使用方法，其特征 在于它采用浸泡免疫的方法，先將受免泥鰍在充氣條件下用質量濃度為8%的NaCl溶液 浸泡5min，然后按體積比1 5用水稀釋泥鰍霍亂弧菌疫苗得泥鰍霍亂弧菌疫苗溶液，再將 受免泥鰍放于泥鰍霍亂弧菌疫苗溶液中充氣浸泡lh，一周后按前述方法加強免疫1次。
3.—種如權利要求1所述的制備方法所制得的泥鰍霍亂弧菌疫苗的使用方法，其特征 在于它采用注射免疫的方法，取體長為8-12cm的泥鰍按0. ImL/尾的免疫劑量進行初次注 射免疫，后每隔一周按前述免疫劑量加強免疫1次，共免疫4次。
4.一種如權利要求1所述的制備方法所制得的泥鰍霍亂弧菌疫苗的使用方法，其特征 在于采用口服免疫方法，將硬顆粒飼料用泥鰍霍亂弧菌疫苗浸泡后投喂，每天魚體攝入滅 活菌體量為3. 2X106cells/g體重，連續投喂一周，隔周后再按前述方法進行加強免疫一 周。
全文摘要
本發明是一種泥鰍霍亂弧菌疫苗的制備方法，其特征在于它以泥鰍病原霍亂弧菌LD081008B-1為免疫原，以黃芪浸出液為佐劑；制備時將霍亂弧菌LD081008B-1菌株接種在普通營養肉湯培養基上培養后加入甲醛滅活得滅活菌體；取黃芪用蒸餾水浸泡后煎煮，過濾，濃縮至終濃度為原藥1g/ml，得黃芪浸出液；將滅活菌體與黃芪浸出液混合制得疫苗。采用本發明方法制備的疫苗進行泥鰍免疫，能顯著提高泥鰍抗霍亂弧菌感染的能力，增強泥鰍對病原霍亂弧菌的免疫保護力，提高泥鰍養殖的成活率，增加泥鰍養殖的產量，避免因藥物殘留導致的出口障礙，保證泥鰍養殖生產的健康和可持續發展，提高泥鰍養殖生產的經濟效益。
文檔編號A61K39/39GK102100909SQ20101029013
公開日2011年6月22日 申請日期2010年9月21日 優先權日2010年9月21日
發明者姚東瑞, 張曉君, 秦國民 申請人:淮海工學院