專利名稱：融合鐵蛋白在疫苗和其他方面的應用的制作方法
技術領域：
本發明通常涉及融合鐵蛋白，特別是在鐵蛋白內部和外部的N端和/或C端融合其他蛋白或肽片段形成能夠自組裝的融合蛋白，以及該類融合蛋白在作為疫苗和其他方面的應用，包括運輸氧氣以及治療性導入藥物和其他治療藥劑。
背景技術：
鐵蛋白含有高度保守的24個亞基，這些亞基存在于所有的動物、細菌和植物中。鐵蛋白的主要生理作用是控制多核Fe(III)2O3形成的速度和定位。(見Theil，E.C.等人在《Adv.Enzymol.Relat.Areas Mol.Biol.》上發表的文章，1990，63421-449；Harrison，P.M.，Lilley，T.H.等人在Loehr T.M.編著的《WeinheimVCH》中的文章，1990，33-452)該控制作用是通過生物礦化作用，將水合鐵離子和質子運進和運出含無機物的內核實現的。通過這一機制使鐵蛋白積累的鐵離子強度大于生理狀態下可溶性的游離鐵離子強度。生物礦化作用的速度直接與每個鐵蛋白顆粒內的H亞基和L亞基(即所謂的輕鏈和重鏈)的比例相關，H亞基含量增加時表現出鐵離子儲存速度增加的趨勢。蛋白顆粒的組成差異具有組織特異性，并影響鐵的氧化代謝、核心形成和鐵循環的機制。比如，血清中的鐵蛋白主要由L鏈組成，來自于心臟的鐵蛋白H鏈含量較高。鐵蛋白礦化核心為不同的氧化酶提供鐵離子，而且起到還原的作用。
每個鐵蛋白由24個亞基組成，每個亞基含有432個對稱體，直徑125埃，顆粒厚度約為25埃，中空的內部核心直徑約為80埃(

圖1)。典型的鐵蛋白單體含有至少兩個異構體，由H鏈和L鏈組成，二者在氨基酸序列上不同。在許多脊椎動物包括人中已經確定H亞基和L亞基的長度，這兩種結構體通常存在于已經確證的鐵蛋白中。每個鐵蛋白亞基分子量大約為17道爾頓，具有束狀螺旋的拓撲結構，包含4個反向平行螺旋基序和一個短螺旋(C端螺旋)，該螺旋大致與第4個束狀螺旋的長軸垂直。依據慣例從N端開始分別將螺旋標記為“A，B，C，D和E”。N端序列與顆粒第3個折疊軸相鄰并明顯延伸到顆粒表面，而E螺旋與第4個折疊軸擠壓在一起，其C端延伸到顆粒核心。擠壓的結果是在蛋白顆粒表面形成2個孔。位于第四個折疊的孔大約有4-5埃，主要為疏水性；而位于第三個折疊的孔直徑略大，是6.0埃，主要為親水性。這兩個孔或其中一個可能是水合鐵離子擴散出入顆粒的通道。
以前關于鐵蛋白的研究工作，如5,248,589；5,358,722和5,304,382號美國專利，通過引證被并入本文均列在參考文獻中，主要集中在蛋白外殼和內核的生理作用方面，如除了含鐵水合物以外的物質可能定位于殼內。通過差示掃描量熱法研究顯示(見SP MartseV，AP Vlasov，P Arosio，等人在《Proterin Engineering》發表的文章，1998，11，377-381)重組人L和H鐵蛋白在pH2.0到2.8之間時解離成亞基單體。
其他方面的工作包括使用病毒樣顆粒作為疫苗的結構模型，在缺少佐劑的的情況下誘導產生抗體反應，保護免受病毒感染和過敏反應(見Lechner等人在《Intervirology》發表的文章，2002，212-217，45(4-6))，但該系統不包括以鐵蛋白為基礎的蛋白開發系統。在Marchenko等人在2003年《J.Mol.Microbiol Biotechnol》5(2)97-104頁發表的文章中，已知蛋白P1-380能夠形成病毒樣顆粒(VLP)。在該研究中，P1-380蛋白的C端和/或N端融合后不影響VLP的自組裝，具有雙功能的融合蛋白顆粒顯示出誘導更強免疫反應的能力。Douglas等人還進行了以下研究一種形成鐵離子核的蛋白與豇豆花葉病毒(CCMV)相連，具體參考發表在《Adv.Mater.》上的文章，2002，14(6)，415-418頁。其他的融合蛋白還有包含與乳頭瘤病毒非結構蛋白L2，一種次要結構蛋白，融合形成的病毒樣顆粒的嵌合蛋白，具體參考Greenstone等人在《PNAS USA》上發表的文章，1998，95(4)，1800-1805頁。但是以上所有的融合蛋白中都不包括鐵蛋白。
因此，以前的文獻均未對鐵蛋白的使用或分別對顆粒外表面和內表面的N端和C端的任何用途進行過研究(如圖2A和B顯示)，而且也沒有人利用該結構通過與鐵蛋白融合連接其他蛋白或肽以加強這些蛋白或肽的特性，產生能夠自組裝的的融合蛋白。
發明簡述因此，本發明的目標是提供包括與鐵蛋白N端和/或C端融合的蛋白或肽片段的融合鐵蛋白。
本發明的另一目標是除了提供融合鐵蛋白，還提供一種表達蛋白的方法，表達蛋白既可以與顆粒表面結合，也可以通過任一蛋白末端的延伸的內在化表達。
本發明的又一目標是提供融合蛋白產品，可應用于疫苗、治療、圖象襯比試劑、新的金屬鰲合系統、膠凝劑、蛋白純化平臺、治療性受體結合蛋白和其他適當的應用。
本發明的再一目標是提供可以在醫人和醫獸中應用及其他許多非治療方面中應用的融合鐵蛋白。
本發明的另一目標是提供能延長動脈停留時間的融合鐵蛋白，這樣可以促進免疫反應的發生，使藥物和其他治療藥劑發揮更長時間的治療作用。
本發明的其它目標是提供重組融合鐵蛋白在疫苗、藥物導入和其他許多治療方面的應用，重組融合鐵蛋白包括能融合到鐵蛋白上的蛋白和肽且不影響蛋白的自組裝或形成高級聚合結構的能力如形成顆粒結構或聚合體的片段。
本發明的這些目標及其它目標是提供包含外源蛋白或肽的融合鐵蛋白，并能形成聚合結構如鐵蛋白顆粒或其他聚合體，外源蛋白或肽與鐵蛋白N或C末端連接。所融合的外源蛋白或肽不會限制融合蛋白形成具有功能的高級結構如顆粒結構，但也可能形成其他的聚合結構如半球形，柱狀等。依照本發明，融合鐵蛋白提供了一種表達蛋白的方法，可以與鐵蛋白外部如顆粒表面連接，或通過蛋白末端延伸融合表達在蛋白內部。本發明的融合蛋白有多種形式，病毒包膜和衣殼蛋白與鐵蛋白融合可以作為病毒疫苗使用。此外因為本發明的方法還可以融合表達多種蛋白和肽，可以構建多價融合蛋白，如來自同一生物體的不同蛋白或來自不同生物體的相同蛋白作為多價疫苗。
此外，形成鐵蛋白顆粒結構時，C端位于鐵蛋白內部核心位置，N端位于蛋白外表面，因此可以構建這樣的疫苗與鐵蛋白表面連接的第一種蛋白或肽抗原能快速誘導產生抗體，而第二種所需抗原與內部C端連接，從而在開始的免疫反應中受到屏蔽達到延長反應時間的目的。因此該類疫苗的第一部分能誘導產生最初的抗體，疫苗的第二部分只有在經過一定時間后降解與鐵蛋白核心解離暴露第二種抗原才具有免疫原性。這種內部屏蔽作用為導入非水溶性抗原提供了方法。而且，因為與鐵蛋白連接，還能增強融合蛋白或肽在降解前的有效作用時間，有利于治療性蛋白或肽發揮作用。本發明中融合蛋白的其他優點還有當不希望偶聯表達的多肽或蛋白引起免疫反應時可以使用人源顆粒(或在獸醫中使用動物來源的顆粒)避免產生免疫相關問題。另一個應用是使用鐵蛋白顆粒組裝人血紅蛋白聚合體作為運輸血液中氧的替代品。最后這類融合蛋白在其他方面也有作用，如清除金屬，包裹有用的蛋白或小分子，或儲存與抗體相連、針對特定組織或細胞的具有放射活性的物質。
對于讀過本說明書和/或引入本文作為參考的此領域的普通技術人員來說，在本發明的公開范圍內的實施方案和其選擇方案和修改是顯而易見的，所有這樣的方案引入本文作為參考。
圖示簡介圖1是鐵蛋白顆粒的連續剖面圖，從四個折疊軸(中心)的角度觀察，亞基以醒目的顏色表示。
圖2A-2B顯示鐵蛋白顆粒下部四個折疊軸(中心)的1/3圖形立體圖.清晰標出外部N端和內部C端，說明可以利用末端構建重組融合蛋白或肽。圖2A顯示顆粒內部的結構，圖2B顯示外表面結構。
圖3為質粒示意圖，質粒編碼根據本發明構建的人血紅蛋白α鏈與人鐵蛋白C端融合的蛋白。
圖4為在第四個折疊軸周圍組裝的亞基立體結構圖。箭頭所示是亞基假定的旋轉方向，通過旋轉可容納較大的C端融合蛋白。
圖5為(FL.G.Hα)的正則直方圖。
圖6為馬心臟天然鐵蛋白的正則直方圖。
圖7為(FL.GG.Ag4)的正則直方圖。
圖8為(FL.GG.Ag4)特有顆粒構像的透射電鏡圖。
圖9為質粒示意圖，質粒編碼根據本發明構建的HIV Tat蛋白(84個氨基酸)與人鐵蛋白N端連接的融合蛋白。
圖10為使用針對Tat的多克隆抗體進行的免疫印跡分析圖，確證了本發明中鐵蛋白-Tat蛋白成功構建。
圖11為(Tat.6G.FL)的正則直方圖。
圖12A為質粒示意圖，質粒編碼根據本發明構建的HIV Tat小肽與人鐵蛋白輕鏈N端連接的融合蛋白。
圖12B為質粒示意圖，質粒編碼根據本發明構建的HIV P24蛋白與人鐵蛋白輕鏈N端連接的融合蛋白。
本發明的詳細描述根據本發明，融合鐵蛋白是指至少在鐵蛋白的一個鏈如H或L鏈融合有外源蛋白，這些蛋白或肽能夠與鐵蛋白的N端或C端結合且不影響融合蛋白形成聚合結構如顆粒、聚合體或其他功能性結構的能力。鐵蛋白含有高度保守的24個蛋白亞基，這些亞基存在于所有動物、細菌和植物中，主要作用是通過從礦化核心運進和運出水合鐵離子和質子來控制多核Fe(III)2O3形成的速度和定位。通過這一機制，鐵蛋白積累了一定濃度的鐵離子，其濃度在生理狀態下高于可溶性游離鐵離子。生物礦物化作用的速度直接與鐵蛋白顆粒內的H亞基和L亞基(即所謂的輕鏈和重鏈)的比例相關，隨著H鏈含量增高其儲存鐵的速度也隨著增高。這種顆粒組成的差異具有組織特異性，影響鐵的氧化，核心形成和鐵的運轉。鐵蛋白的礦物化核心能夠為許多氧化還原酶提供具有生物活性的鐵離子，還具有解毒作用。
每個鐵蛋白由24個亞基組成顆粒，每個顆粒含432個對稱體，直徑為125埃，外殼厚度約為25埃，中空的內部核心直徑約為80埃(圖1)。典型的鐵蛋白單體結構至少有含有H鏈和L鏈的兩種異構體，這兩種鏈的差異在于氨基酸序列的不同。在包括人的脊椎動物中發現了多種長度的H亞基和L亞基。每個鐵蛋白亞基的分子量約為17Kd，具有束狀螺旋的拓撲結構，包括4個反平行螺旋基序和一個短螺旋(C端螺旋)，該短螺旋與第4個螺旋束的長軸大致垂直。依據慣例從N端開始分別將螺旋標記為“A，B，C，D和E”。N端序列與顆粒的第3個折疊軸相鄰，延伸到蛋白表面，而E螺旋在第4個折疊軸擠壓在一起，其C端延伸到顆粒核心。螺旋擠壓在顆粒表面形成兩個小孔。位于第4折疊區的小孔約有4-5埃，主要為疏水性。位于第3折疊區的小孔稍大些，直徑約有6.0埃，主要為親水性。這兩個孔或其中一個可能是水合鐵離子擴散出入顆粒的通道。
根據本發明，可以將適當的蛋白或肽融合到鐵蛋白的N端，緊鄰蛋白顆粒的第三個折疊軸形成顆粒外產物；或者將蛋白或肽融合到C端，延伸到蛋白核心形成顆粒內產物，或者是以上二者的集合體。這里所說的鐵蛋白是指鐵蛋白和/或它的H鏈和/或L鏈以及鐵蛋白類似物如5,304,382號美國專利中所描述的，在此通過引證被并入本文，還包括去鐵鐵蛋白和那些具有鐵蛋白結構的蛋白，即蛋白外表面為N端區域，內部核心為C端區域。本發明使用的蛋白或肽包括那些氨基酸序列能與鐵蛋白連接但不影響其結構的蛋白、多肽、抗體、片斷、酶、半抗原、肽聚糖或其他分子。融合鐵蛋白表達后自組裝成大分子或聚合結構，與天然鐵蛋白具有相同的構和構像(N端在表面，C端在內部核心)。
根據本發明設計融合產物時，有必要考慮在每個鐵蛋白和與鐵蛋白融合的蛋白或肽之間包括“間隔”結構的殘基，如甘氨酸或其他適當的氨基酸。一般而言間隔結構能增加鐵蛋白中心與連接蛋白或肽之間的距離，如希望增加鐵蛋白與融合蛋白或肽之間的空間時。鐵蛋白與具有抗原性的蛋白或肽連接時該類情況較多。因為充分暴露抗原有利于產生抗體如在疫苗的使用中。此外，本發明的融合蛋白是抗體與鐵蛋白連接，間隔結構能減少鐵蛋白與融合蛋白之間的空間位阻，使抗體更好的與目標結合。通常連接的分子越大就越需要充足的間隔結構。因此在本發明的融合產物中，無論是顆粒內融合產物還是顆粒外融合產物，如果顆粒外部需要足夠的空間容納較大蛋白時，均可利用一個或更多的甘氨酸殘基(或其他適當的氨基酸)。通常選擇甘氨酸因為它可以形成具有彈性的“鏈”，容易適應外伸的多肽構像。
正如本領域技術人員所認識的一樣，根據生理或物理需要，當需要屏蔽環境中的滅活或其他造成蛋白降解或切除因素時，可以將目標蛋白或肽融合到鐵蛋白內部；不需要屏蔽蛋白如希望引起更加快速的免疫反應時目標蛋白或肽可融合到蛋白外部。此外還可以利用顆粒內部(C端)或外部(N端)融合蛋白形成混合顆粒，如在顆粒表面或內部表達多種抗原蛋白或肽。可以利用這個方法確保發生抗體反應和細胞免疫反應。另外可以利用相同方法表達的多種酶為多步生化反應產生高度濃縮的酶“工廠”。通過相同載體多重表達或使用已知方法使顆粒解離后再與目的產物重新連接形成混合物的方法構建這類多價嵌合鐵蛋白。
本發明利用N端和C端分別在聚合結構外部和內部的定位(圖2A和2B)，將蛋白或肽連接到這些特定位置構建融合蛋白。在優選實施例中，使用適當的方法制備本發明的融合鐵蛋白，其中至少有一種蛋白或肽與鐵蛋白連接，且不會影響融合蛋白形成聚合結構，即融合鐵蛋白形成穩定多聚體結構時蛋白或肽仍與鐵蛋白保持連接，鐵蛋白保持基本的內部核心和外部表面結構，外表面的N端或內表面的C端與蛋白或肽連接(或在兩個部位都進行連接)。本發明的一個實施方案是融合蛋白具有鐵蛋白形成聚合顆粒結構的特性。可以理解的是，鐵蛋白具有自組裝的趨勢是有利的，表現出多種不同的形式，不僅是顆粒結構，還有其他的聚合結構如聚合體、半球形、柱狀等結構。根據本發明與鐵蛋白融合的自組裝產物具備多種應用如疫苗和以下詳細描述的方面。可以使用本領域技術人員熟知的適當方法構建本發明的融合蛋白，如重組表達或通過物理或化學方法與單個蛋白連接構建本發明的融合蛋白。
根據本發明，融合鐵蛋白具有融合到外部如與外部N端連接的蛋白或通過與C端連接表達在內部的蛋白。正如下面詳細描述的一樣，本發明中融合蛋白的應用領域包括疫苗、治療、圖象襯比試劑、新的金屬鰲合系統、膠凝劑、蛋白純化平臺、治療性受體結合蛋白等，在人和獸醫中還有許多非治療方面的應用。
如上所述，使用基因工程領域常規的重組技術就能構建本發明中重組表達的融合鐵蛋白。如使用分子克隆的方法構建融合蛋白，比如通過與適當的鐵蛋白如人鐵蛋白L鏈連接，在大腸桿菌中表達制備重組人血紅蛋白α亞基。在這一過程中，使用以PCR為基礎的方法將血紅蛋白α亞基的全長cDNA與鐵蛋白輕鏈基因的C端通過甘氨酸連接子連接(圖3)。基因構建完成后，進行蛋白表達和分離和/或純化。首先對融合蛋白(如鐵蛋白/血紅蛋白融合蛋白)的編碼序列測序以確保重組體具有正確的DNA序列。重組質粒轉化蛋白表達細菌BL21(DE3)。當細菌繁殖到合適濃度如OD值為1.0(600nm)時，加入1mM IPTG激活T7啟動子，在30℃誘導表達。表達結束后細菌重懸在B-PER緩沖液中進行超聲破碎釋放蛋白。然后對融合蛋白進行分離和/或純化，如采用合適的層析方法或其他方法如分子排阻、凝膠過濾、離子交換層析等從上清液中分離蛋白。使用適當的多克隆和單克隆抗體通過常規的免疫印跡試驗進行蛋白確證。
本發明中的融合蛋白構建完成后，通過下列觀察對顆粒構像進行確認1)分子排阻凝膠層析純化的表達產物具有與比天然重組鐵蛋白(鐵蛋白分子量，408K)稍大的蛋白復合物一致的保留效應；2)使用光度計檢測單個蛋白的分散性，顯示蛋白直徑約是天然鐵蛋白的兩倍(圖6和表2)；
3)使用適當的多克隆抗體(如在上述實施例中，同時使用人鐵蛋白和血紅蛋白α的多克隆抗體)與融合蛋白進行免疫印跡試驗，分別得到陽性結果。
根據本發明，融合蛋白中的亞基數目有可能顯著多于天然鐵蛋白中的24個亞基數目，說明顆粒具有增加亞基與亞基之間組裝角度的能力，二聚體可能通過旋轉與平行于第二個折疊軸的“B”螺旋組裝，位于顆粒表面“B-C環”的彈性使二聚體進一步得到穩定，B-C環穿過第二個折疊軸形成反平行β折疊。該旋轉假說得到空間相互作用的支持，顆粒曲率增大為較大的血紅蛋白分子提供更多空間。亞基組裝角度發生的較小變化與顆粒直徑的顯著增加相關，使顆粒內部能容納更大的融合產物。同時可以更好的理解通過對表面暴露的環、B-C環進行修飾或替換構建“嵌合”鐵蛋白分子，用于疫苗或其他方面。
因此可以利用本發明的融合蛋白增強多種治療性蛋白和肽的效果。特別是通過與鐵蛋白連接極大增強了治療性蛋白在血漿中的半衰期，其半衰期通常為18-20個小時。因此當血液中的非融合蛋白或肽被完全降解后，融合蛋白或肽仍能提供較長時間的治療作用。此外，蛋白或肽與鐵蛋白融合后可以避免免疫相關問題，特別是蛋白與鐵蛋白內部C端區域連接時。同樣，融合鐵蛋白能夠對一些蛋白或肽(如酶，毒素鰲合物或小分子治療劑)起保護作用，否則這些蛋白或肽在血液中很快被降解。在這類應用中最好將這些蛋白和肽與鐵蛋白C端區域連接，使它們位于融合蛋白顆粒的內部核心部位。
經濟并可測量的分離純化融合鐵蛋白產物更進一步，蛋白或小肽與鐵蛋白外部的酶切位點連接后，根據鐵蛋白顆粒大小的差異，使用簡單的超濾對終產物進行分離，然后通過酶切將融合產物容易的分離出來。因此可以利用融合鐵蛋白平臺進行方便經濟的顆粒外融合產物的分離。
沉淀金屬復合物鐵蛋白核心具有沉淀多種金屬復合物的特性，包括某些天然狀態的陶瓷(見5,248,589、5,358,722和5,304,382號美國專利)。如實施例所示在融合蛋白核心表達一種新的金屬核多肽。可以理解由于組成金屬或無機復合物的放射性元素具有增強X射線或核磁共振造影劑的作用，這類物質可用于多種醫學方面的治療、診斷或預防。還可以理解利用顆粒結構的蛋白核心濃縮和沉淀貴重或稀有金屬(如通常在Fe的實例中)，利用這些具有特殊功能的蛋白通過細菌、酵母等發酵過程比較容易對表達的目的或非目的無機物進行分離。最近的研究集中在控制半導體材料中極小粒子生產的顆粒大小方面。
抗體介導的治療性病毒樣顆粒(VLPs)由抗體Fv片斷或更大結構域構成的顆粒外融合產物能夠介導在顆粒內或在表面表達的治療或診斷制劑到特定部位。在這一實施例中，針對或摧毀細胞如腫瘤細胞的蛋白或肽與鐵蛋白連接后再與抗體(或抗體的活性區域如活性片斷)連接，這樣形成的融合蛋白將直接針對靶組織(如腫瘤)。因此根據本發明可以將以這類方式結合的顆粒蛋白包括毒素蛋白，放射性元素或其他破壞性因子直接導入腫瘤組織。
以血紅蛋白為基礎的血液替代品與血紅蛋白融合的鐵蛋白可以作為新的血液替代品。這類嵌合鐵蛋白的潛在優點包括1)增加血管內殘留時間；2)降低與內皮的相互作用，限制或消除與氧化氮結合引起的副作用；3)組裝方式可以保護血紅蛋白的Fe免受不必要的氧化；4)聚合體形式能防止血紅蛋白α鏈與β鏈解離。
疫苗以上描述的本發明的融合蛋白可以在疫苗開發中加以應用，誘導產生針對感染的主動免疫和被動免疫。
在實施例中，根據本發明抗體與鐵蛋白連接形成融合蛋白可以作為被動免疫的疫苗，為治療或預防感染提供適當抗體。
正如本領域技術人員所認識的一樣，根據本發明構建的疫苗可以有多種免疫方式，如注射方式(肌肉注射，皮內注射或皮下注射)或鼻咽方式(鼻內免疫)。其中一種情況是疫苗進行肌肉注射如注射到三角肌，但具體免疫途徑還應該根據感染的性質和病人的狀況。疫苗最好溶于制藥行業認同的溶劑中以方便使用。這類溶劑通常是含有或不含防腐劑的水或生理鹽水。疫苗可以凍干或以溶液形式保存，凍干疫苗在免疫時重懸。
本發明中融合蛋白的優選的免疫劑量是免疫病人后的有效劑量，如使病人產生特異性和非特異性抗體。該劑量通常指“具有免疫原性的量”，使用劑量根據抗原性質和病人免疫系統及身體狀況變化很大。因此本發明中作為有效疫苗使用的融合蛋白的“免疫原性量”即指沒有毒性，但有足夠的抗原量以產生預防或治療性抗體。同時免疫原用量隨著病人不同而不同，與人種、年齡和病人的狀況，需要治療的嚴重程度，疫苗使用的特殊載體或佐劑及免疫方式等方面有關。同時任何一個特定融合蛋白成分中的“免疫原性量”根據特定的情況而不同，在每種疫苗的具體使用中，由本領域技術人員根據常規試驗決定免疫原的適當用量。根據個體需要調整使用劑量和疫苗組成，并根據個體的年齡、體重和代謝情況有所不同。疫苗組份還包括穩定劑或制藥行業認可的防腐劑，如硫柳汞(乙基(2-巰基乙醇)汞鈉鹽)(Sigma化學公司，St.Louis，MO)。
因此，根據本發明構建的有效疫苗，由上述單個蛋白的免疫原性量決定有效疫苗的使用量，用來免疫需要這類疫苗的病人或患病動物。疫苗還可能包括適當的、制藥行業認可的媒介物、賦形劑或載體。根據本發明，鐵蛋白可以與具有高度致病性病毒的蛋白，如AIDS、SARS等病毒的包膜蛋白或其他蛋白連接，使用融合蛋白誘導產生針對AIDS和/或SARS病毒的抗體。除了能用于保護免受致命性病毒感染的疫苗外，融合蛋白還可以用于對該類疾病的研究，同時還可能用于開發針對該類疾病的有效的治療方法或藥物。
本發明的融合蛋白與抗體連接可以作為被動疫苗進行免疫。在這種情況中，以能有效預防和治療感染的用量作為根據本發明構建的被動疫苗的適宜劑量。這一用量隨著感染性質和病人狀態的不同而有很大變化。根據本發明構建的融合抗體的“有效用量”指沒有毒性但有足夠量的抗體以能達到預期的預防或治療作用。同時抗體或治療藥物得到用量隨著病人不同而不同，與人種、年齡和病人的狀況，需要治療的嚴重程度，疫苗使用的特殊載體或佐劑及免疫方式等方面有關。同時任何一個特定抗體組份的“有效用量”根據特定的情況而變化，在每種疫苗的具體使用中，由本領域技術人員根據常規試驗決定適當的有效用量。根據個體需要調整使用劑量和疫苗組成，并根據個體的年齡、體重和代謝情況有所不同。疫苗組份還包括穩定劑或制藥行業認可的防腐劑，如硫柳汞(乙基(2-巰基乙醇)汞鈉鹽)(Sigma化學公司，St.Louis，MO)。
此外，以上描述的本發明中的抗體和疫苗可以與適當佐劑共同免疫，增強針對融合體的免疫反應。比如，常用的佐劑包括在人體中廣泛使用的鋁制劑(磷酸鋁或氫氧化鋁)，其他佐劑如皂角苷和它的純化成份Quil A，完全弗氏佐劑及在研究和獸醫中使用的其他佐劑。其他化學組成明確的制備包括胞壁酰二肽、單磷酰脂質A、由Goodman-Snitkoff等人在《J.Immunol.》1991，147410-415頁描述的磷脂化合物，文獻在此通過引證被并入本文及由Miller等人在《J.Exp.Med.》1992，1761739-1744頁中描述的蛋白脂質體包裹的融合體，文獻在此通過引證被并入本文，脂質體包裹的蛋白如NovasomeTM脂質體(Micro VescularSystems，Inc.，Nashua，NH)比較有用。
與其他病毒顆粒疫苗相比，鐵蛋白不像病毒顆粒一樣可以被免疫系統迅速識別，使用根據本發明構建的顆粒內融合蛋白產物時，顆粒不會被認為是外源蛋白。只有在融合產物開始降解，暴露出抗原后才能誘導產生免疫反應，所以可以創造緩釋抗原效應，因為抗原可以保持相當長的暴露時間從而誘導產生較強的免疫反應。融合鐵蛋白結構簡單，比病毒樣顆粒特別是那些包含多個蛋白結構組份的顆粒更容易制備。
藥物組合物正如本領域技術人員所認識的，根據本發明構建的融合蛋白還可以作為用于治療或預防人或動物感染的藥物組合物，或作為治療疾病的藥劑。上述融合蛋白的藥物組合物可以與其他合適的藥物溶劑、賦形劑或載體聯合使用，這些聯合制劑在本行業中經常使用，包括鹽、葡萄糖、水、甘油、乙醇及其他治療性組合物。正如專業人士所認識的，這些特殊的溶劑、賦形劑或載體隨著病人和病人狀態的不同而不同，根據藥物組合物采用適當的給藥方式，包括但不局限于以下方式局部給藥、口腔給藥、肛門給藥、陰道給藥、靜脈注射、腹腔注射、肌肉注射、皮下注射、鼻腔和皮內給藥。
局部給藥的制劑中，藥劑形式有膏劑、霜劑、凝膠體、滴劑(如滴眼劑和滴耳劑)或溶液(如漱口液)。還包括由特定制劑浸泡的傷口或外科敷料、縫合用的線、氣霧劑等。這些制劑還包括常規的添加劑，如防腐劑、促進滲透的溶劑和緩和劑。局部用藥制劑還可能包括常規的吸收劑如霜或膏基質，乙醇或油醇。
其他方面的應用如上所述，根據本發明構建的融合鐵蛋白在疫苗領域、制藥、治療藥物組合物及其它能夠提供有益作用的許多方面均有應用價值。比如可以利用本發明中的融合鐵蛋白儲存濃縮的具有放射性的金屬，這些金屬與抗體連接作為治療藥劑直接高濃度導入腫瘤組織。此外，由于鐵蛋白具有潛在的結合鐵離子和其他稀有金屬的能力，可以通過本發明中的融合鐵蛋白提取所需金屬。因為該方法可以避免產生有毒的化學物質，因此提供了一種環保的采礦方法。另外在一些組織中L和H鏈的構成比例不同，具有特定L鏈和H鏈比例的融合鐵蛋白或主要由一種類型的鏈構成的融合鐵蛋白(如60-100％)可以將顆粒即治療劑(DNA等)導入組織中，比如在心肌組織中鐵蛋白主要由H鏈構成，而血液中的鐵蛋白主要有L鏈構成。
其他方面的應用包括用于更加復雜的系統大結構組裝平臺(Macro structure assembly platform)-納米技術。另外，鐵蛋白、包裹在內部的治療劑或其他藥劑通過與抗體連接或其它方法到達體內需要進行治療或其它的目標。就抗體而言，可以將完整的抗體或只具有抗原識別部位的Fv片斷通過化學或重組的方法與鐵蛋白連接。還可以插入鐵蛋白顆粒的不同成分進行修飾，構建作為疫苗或治療藥物的混合分子。如替代位于蛋白表面的BC環。還可以使那些難以形成晶體的多肽或蛋白表達形成顆粒進而形成晶體，特別是在顆粒內部表達時，從而可以保留晶體外部組裝的相互作用。顆粒內表達還可以解決某些疏水性蛋白的溶解性問題。融合鐵蛋白還可以有以下方面的應用在識別過程如NMR，圖象襯比或X射線成像中使用的顆粒由于連接旋轉速度減慢，因此本發明的融合蛋白可應用于相關領域。
總之，上述根據本發明構建的融合鐵蛋白在疫苗、其他藥物和治療藥劑的組成中非常有用，將在給藥、運輸氧氣和提高藥物在血液中殘留時間的應用中發揮特殊的作用。
實施例下面的實施例體現了本發明的優選實施方案。此領域中的技術人員應理解后面實施例中公開的技術代表了本發明發明人所發明的技術，其很好地實施了本發明，因而可以作為操作方法的優選模式。然而，根據本申請的公開內容，本領域技術人員應可認識到對本文公開的具體實施方案所做的各沒有背離本發明范圍和精神的并仍然獲得相同或相似結果的修改。
例1顆粒內表達的融合蛋白人血紅蛋白蛋白α鏈通過單甘氨酸連接子與人鐵蛋白C端連接構成重組融合蛋白顆粒縮寫(FL.G.Hα)。
分子克隆在大腸桿菌中表達人血紅蛋白α亞基與人鐵蛋白L鏈融合的重組蛋白。使用PCR方法將血紅蛋白α鏈的全長cDNA與鐵蛋白輕鏈基因C端通過由一個甘氨酸組成的連接子連接(圖3)。
蛋白表達和純化通過DNA測序驗證鐵蛋白/血紅蛋白的編碼序列。將重組子轉化蛋白表達細菌BL21(DE3)。轉化細菌生長到OD值為1.0(600nm)時，加入1mMIPTG激活T7啟動子，在30度誘導表達。表達結束后將細胞重懸于B-PER緩沖液中，超聲破碎釋放蛋白。使用分子篩和離子交換凝膠過濾層析從上清中純化重組的融合蛋白。使用多克隆和單克隆抗體進行免疫印跡試驗確證表達蛋白。
通過以下觀察顯示顆粒或自組裝顆粒(SAP)具有正確構像1)分子排阻凝膠層析洗脫的純化表達產物具有與大于天然重組鐵蛋白一致的保留效應(鐵蛋白分子量408K)。
2)圖5和表1中的蛋白光掃描試驗顯示單個分散蛋白的直徑約是天然鐵蛋白2.5倍，這一數據是根據圖6和表2中的數值(這些數值一般不十分準確，但重要的是為單個分散蛋白提供了分子大小一致和有序SAP的依據)進行估計的。分別使用針對人鐵蛋白和血紅蛋白α的多克隆抗體與融合產物進行免疫印跡試驗，應得到陽性結果。
對本復合物使用光散射分析得到的亞基數目要高于天然鐵蛋白中的24個。盡管該復合物的確切結構還不清楚，SAP與單個分子在性質上是一致的。說明亞基與亞基之間的結合具有增加組裝角度的內在能力。假設二聚體(見圖4)越過顆粒第二個折疊軸旋轉后與B螺旋組裝，顆粒表面越過第二個折疊軸與β折疊反平行的B-C環的彈性進一步穩定了這種相互作用。這一旋轉假設得到血紅蛋白α鏈之間的空間相互作用的支持，如彎曲率大的顆粒能容納較大的血紅蛋白分子。這些亞基組裝角度中小的變化與顆粒直徑的增加有關，使得顆粒核心能容納更大的融合蛋白。
表1(FL.G.Hα)的數據表。在溫度22℃使用Proteinsolutions Dynapro光散射分光光度計進行檢測得到的結果。
表2(天然馬的心臟的鐵蛋白)的數據表。在溫度22℃使用Proteinsolutions Dynapro光散射分光光度計進行檢測得到的結果。
例2顆粒內表達的融合蛋白銀濃縮多肽通過包含2個甘氨酸的連接子與人鐵蛋白L鏈C端連接構成重組融合蛋白顆粒縮寫(FL.GG.Ag4)，AG4是指NPSSLFRYLPSD(序列號1)。
作為與鐵蛋白連接的金屬提取多肽，通過下列觀察顯示顆粒具有正確構像
1)分子排阻凝膠層析洗脫的純化表達產物具有與天然重組鐵蛋白(鐵蛋白分子量408K)一致的保留效應。
2)圖7和表3中的蛋白光散射試驗顯示單個分散蛋白的直徑約為180埃；3)silver condensing peptide的顆粒特點已經明確；4)透射電子顯微鏡成像顯示具有適當外部尺寸的多面體顆粒與鐵蛋白X射線結構完全一致(圖8)。
表3(FL.GG.Ag4)的數據表。在溫度22℃使用Proteinsolutions Dynapro光散射分光光度計進行檢測得到的結果。
例3顆粒外融合蛋白HIV Tat蛋白(84個氨基酸)通過包含6個甘氨酸的連接子與N端連接構成重組蛋白。
顆粒縮寫(Tat.6G.FL)其中HIV Tat蛋白序列MEPVDPRLEP WKHPGSQPKT ACTNCYCKKC CFHCQVCFITKALGISYGRK KRRQRRRAHQ NSQTHQASLS KQPTSQPRGDPTGPKE-(序列號2)甘氨酸連接子序列GGGGGG(序列號3)人鐵蛋白L鏈序列MSSQIRQNYS TDVEAAVNSL VNLYLQASYT YLSLGFYFDR DDVALEGVSHFFRELAEEKR EGYERLLKMQ NQRGGRALFQ DIKKPAEDEW GKTPDAMKAAMALEKKLNQA LLDLHALGSA RTDPHLCDFL ETHFLDEEVK LIKKMGDHLTNLHRLGGPEA GLGEYLFERL TLKHD(序列號4)分子克隆在大腸桿菌中表達野生型HIV-1 Tat與人鐵蛋白L鏈融合的重組蛋白。使用PCR方法將Tat蛋白的全長cDNA與鐵蛋白輕鏈基因N端通過包含6個甘氨酸的連接子連接(圖9)。
蛋白表達和純化通過DNA測序驗證鐵蛋白/Tat的編碼序列。將重組子轉化蛋白表達細菌BL21(DE3)。轉化細菌生長到OD值為1.0(600nm)時，加入1mMIPTG激活T7啟動子，在30度誘導表達。表達結束后將細胞重懸于B-PER緩沖液中，超聲破碎釋放蛋白。使用分子篩和離子交換凝膠過濾層析從上清中純化重組的融合蛋白。使用多克隆和單克隆抗體進行免疫印跡試驗確證表達蛋白(圖10)。
通過下列觀察顯示顆粒具有正確構像1)分子排阻凝膠層析洗脫的純化表達產物具有與同樣大小或大于天然重組鐵蛋白(鐵蛋白分子量408K)特點一致的保留效應，；2)圖11和表4中的蛋白光散射試驗顯示，單個分散蛋白的直徑約是天然鐵蛋白2倍；3)使用針對Tat的多克隆抗體與融合蛋白進行免疫印跡試驗得到陽性結果(圖10)。
表4(Tat.6G.FL)的數據表。在溫度為22℃使用Proteinsolutions Dynapro光散射分光光度計進行檢測得到的結果。
例4顆粒外融合蛋白HIV Tat小肽通過包含6個甘氨酸的連接子與人鐵蛋白L鏈N端連接構成重組蛋白。
顆粒縮寫(TatP.6G.FL)，其中TatP的序列為QPKTACTNC(序列號5)分子克隆在大腸桿菌中表達野生型HIV-1 Tat多肽與人鐵蛋白L鏈融合的重組蛋白。使用PCR方法將Tat蛋白的全長cDNA與鐵蛋白輕鏈基因N端通過包含包含6個甘氨酸的連接子連接(圖9)。
蛋白表達和純化通過DNA測序驗證鐵蛋白/Tat的編碼序列。將重組子轉化蛋白表達細菌BL21(DE3)。轉化細菌生長到OD值為1.0(600nm)時，加入1mMIPTG激活T7啟動子，在30度誘導表達。表達結束后將細胞重懸于B-PER緩沖液中，超聲破碎釋放蛋白。使用分子篩和離子交換凝膠過濾層析從上清中純化重組的融合蛋白。由于融合多肽的分子較小，在本例中使用多克隆和單克隆抗體進行免疫印跡試驗不能得到陽性結果。
通過下列觀察顯示顆粒具有正確構像1)分子排阻凝膠層析洗脫的純化表達產物具有與天然重組鐵蛋白(鐵蛋白分子量408K)相一致的保留效應。
例5顆粒外融合蛋白HIV P24蛋白通過包含6個甘氨酸的連接子與N端連接構成重組蛋白。
顆粒縮寫(P24.6G.FL)分子克隆在大腸桿菌中表達野生型HIV-1 P24與人鐵蛋白L鏈融合的重組蛋白。使用PCR方法將Tat的全長cDNA與鐵蛋白輕鏈基因N端通過包含6個甘氨酸的連接子連接(圖9)。
蛋白表達和純化通過DNA測序驗證鐵蛋白/P24的編碼序列。將重組子轉化蛋白表達細菌BL21(DE3)。轉化細菌生長到OD值為1.0(600nm)時，加入1mMIPTG激活T7啟動子，在30度誘導表達。表達結束后將細胞重懸于B-PER緩沖液中，超聲破碎釋放蛋白。使用分子篩和離子交換凝膠過濾層析從上清中純化重組的融合蛋白。所表達的蛋白可能包含截短的P24蛋白(未對表達產物進行確證)。但是使用多克隆抗體與融合顆粒蛋白進行免疫印跡試驗得到陽性結果。
通過下列觀察顯示顆粒具有正確構像1)分子排阻凝膠層析洗脫的純化表達產物具有與天然重組鐵蛋白(鐵蛋白分子量408K)相一致的保留效應；2)融合蛋白與P24多克隆抗體進行免疫印跡試驗得到陽性結果。
實施例附錄1.GenBank序列號人鐵蛋白L鏈GenBank序列號M11147人鐵蛋白H鏈GenBank序列號AA075690人血紅蛋白α鏈GenBank序列號V00493HIV-1GenBank序列號K034552.氨基酸序列HIV-1 P24PIVQNIQGQMVHQAISPRTLNAWVKVVEEKAFSPEVIPMFSALSEGATPQDLNTMLNTVGGHQAAMQMLKETINEEAAEWDRVHPVHAGPIAPGQMREPRGSDIAGTTSTLQEQIGWMTNNPPIPVGEIYKRWIILGLNKIVRMYSPTSILDIRQGPKEPFRDYVDRFYKTLRAEQASQEVKNWMTETLLVQNANPDCKTILKALGPAATLEEMMTACQGVGGPGHKARVL(列號6)Tat-多肽QPKTACTNC(序列編號5)
α球蛋白MVLSPADKTNVKAAWGKVGAHAGEYGAEALERMFLSFPTTKTYFPHFDLSHGSAQVKGHGKKVADALTNAVAHVDDMPNALSALSDLHAHKLRVDPVNFKLLSHCLLVTLAAHLPAEFTPAVHASLDKFLASVSTVLTSKYR(序列號7)HIV Tat序列MEPVDPRLEP WKHPGSQPKT ACTNCYCKKC CFHCQVCFIT KALGISYGRKKRRQRRRAHQ NSQTHQASLS KQPTSQPRGDPTGPKE(序列號2)人鐵蛋白L鏈序列MSSQIRQNYS TDVEAAVNSL VNLYLQASYT YLSLGFYFDR DDVALEGVSHFFRELAEEKR EGYERLLKMQ NQRGGRALFQ DIKKPAEDEW GKTPDAMKAAMALEKKLNQA LLDLHALGSA RTDPHLCDFL ETHFLDEEVK LIKKMGDHLTNLHRLGGPEA GLGEYLFERL TLKHD(序列號4)人鐵蛋白H鏈序列MTTASTSQVR QNYHQDSEAA INRQINLELY ASYVYLSMSY YFDRDDVALKNFAKYFLHQSH EEREHAEKLM KLQNQRGGRIFL QDIKKPDCDDWESGLNAMEC ALHLEKNVNQ SLLELHKLAT DKNDPHLCDF IETHYLNEQVKAIKELGDH VTNLRKMGAP ESGLAEYLFD KHTVVETVIMK AKPRANFP(序列號8)
序列表<110>丹尼爾·C·卡特<120>融合鐵蛋白在疫苗和其他方面的應用<130>P07624WO00/BAS<150>60/379,145<151>2002-05-10<160>8<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>12<212>PRT<213>Homo sapiens<400>1Asn Pro Ser Ser Leu Phe Arg Tyr Leu Pro Ser Asp1 5 10<210>2<211>86<212>PRT<213>Homo sapiens<400>2Met Glu Pro Val Asp Pro Arg Leu Glu Pro Trp Lys His Pro Gly Ser1 5 10 15Gln Pro Lys Thr Ala Cys Thr Asn Cys Tyr Cys Lys Lys Cys Cys Phe20 25 30
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<210>6<211>231<212>PRT<213>Homo sapiens<400>6Pro Ile Val Gln Asn Ile Gln Gly Gln Met Val His Gln Ala Ile Ser15 10 15Pro Arg Thr Leu Asn Ala Trp Val Lys Val Val Glu Glu Lys Ala Phe20 25 30Ser Pro Glu Val Ile Pro Met Phe Ser Ala Leu Ser Glu Gly Ala Thr35 40 45Pro Gln Asp Leu Asn Thr Met Leu Asn Thr Val Gly Gly His Gln Ala50 55 60Ala Met Gln Met Leu Lys Glu Thr Ile Asn Glu Glu Ala Ala Glu Trp65 70 75 80Asp Arg Val His Pro Val His Ala Gly Pro Ile Ala Pro Gly Gln Met85 90 95Arg Glu Pro Arg Gly Ser Asp Ile Ala Gly Thr Thr Ser Thr Leu Gln100 105 110Glu Gln Ile Gly Trp Met Thr Asn Asn Pro Pro Ile Pro Val Gly Glu115 120 125Ile Tyr Lys Arg Trp Ile Ile Leu Gly Leu Asn Lys Ile Val Arg Met130 135 140
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權利要求
1.一種融合鐵蛋白，是從包括下列融合蛋白的組中選取的在C端與能與鐵蛋白融合且不會影響產物融合蛋白聚合組裝的蛋白或肽融合的鐵蛋白，或在N端與能與鐵蛋白融合且不會影響產物融合蛋白聚合組裝的蛋白或肽融合的鐵蛋白。
2.根據權利要求1的融合鐵蛋白，其中融合蛋白形成聚合體。
3.根據權利要求1的融合鐵蛋白，其中融合蛋白形成顆粒結構。
4.根據權利要求1的融合鐵蛋白，其中與鐵蛋白連接的蛋白通過至少由1個氨基酸組成的連接子進行連接。
5.根據權利要求4的融合鐵蛋白，其中氨基酸是甘氨酸。
6.根據權利要求5的融合鐵蛋白，其中甘氨酸連接子包括1到6個甘氨酸。
7.根據權利要求1的融合鐵蛋白，其中與鐵蛋白融合的蛋白從下列蛋白中選擇血紅蛋白，銀濃縮多肽，HIV Tat蛋白，HIV Tat小肽，HIV-1 P24蛋白和SARS病毒的病毒蛋白。
8.根據權利要求1的融合鐵蛋白，其中與鐵蛋白融合的蛋白從下列蛋白序列編號中選擇序列編號1，序列編號2，序列編號5，序列編號6和序列編號7。
9.根據權利要求1的融合鐵蛋白，其中鐵蛋白從包括鐵蛋白L鏈和H鏈的組中選擇。
10.根據權利要求1的融合鐵蛋白，其中鐵蛋白主要由鐵蛋白L鏈組成。
11.根據權利要求1的融合鐵蛋白，其中鐵蛋白主要由鐵蛋白H鏈組成。
12.根據權利要求1的融合鐵蛋白，其中與鐵蛋白融合的蛋白是抗體。
13.一種包括免疫原性量的權利要求1的融合蛋白的疫苗。根據權利要求1，疫苗由免疫原性融合蛋白組成。
14.一種包括權利要求1的融合蛋白和藥用可接受的媒介物、賦形劑或載體的藥物組合物。
15.根據權利要求14的藥物組合物，其可適合對人或動物進行注射，口服，鼻內，皮下，氣霧或靜脈給藥。
16.一種制備病毒疫苗的方法，包括融合鐵蛋白，至少一種具有免疫原性的病毒蛋白或肽序列能與鐵蛋白的一個鏈連接且不影響鐵蛋白形成融合蛋白的自組裝能力。
17.一種增強有用蛋白或肽治療作用的方法，包括將所述蛋白或肽與鐵蛋白融合形成融合蛋白，其中融合蛋白保持與鐵蛋白相同的聚合體結構。
18.一種在人體或動物中誘導產生免疫反應的方法，包括給人或動物服用免疫原性量的權利要求1分離的融合蛋白。
19.一種編碼權利要求1的融合蛋白的核酸序列或其簡并序列。
20.一種增加人或動物內服的蛋白或肽的半衰期的方法，包括所述蛋白或肽與鐵蛋白形成融合蛋白，其中融合蛋白保持與鐵蛋白相同的自組裝能力。
21.一種融合鐵蛋白，包括至少與鐵蛋白C端融合的一種蛋白或肽和至少與鐵蛋白N端融合的一種蛋白或肽，其中所述蛋白或多肽能與鐵蛋白融合且不影響產物融合蛋白形成聚合體結構。
22.一種通過重組方法制備如權利要求1中的融合鐵蛋白。
23.一種通過重組方法制備如權利要求21中的融合鐵蛋白。
24.一種提取金屬的方法，包括將含有與鐵蛋白融合的金屬提取肽的權利要求1的融合蛋白置于含有要提取金屬的液體中充分長的時間以使金屬與融合蛋白的金屬提取肽結合，然后回收結合金屬的融合蛋白。
全文摘要
本文涉及分離的融合鐵蛋白，即蛋白或肽與鐵蛋白連接不影響融合蛋白自組裝形成聚合結構，蛋白與鐵蛋白C端融合形成顆粒內表達，或與N端融合形成顆粒外表達。融合蛋白能自組裝形成多種有用的高級聚合形式，如顆粒或其它聚合體；融合蛋白有多方面應用，包括作為人或獸用疫苗、治療、血液替代品、圖象襯比試劑、金屬螯合系統、膠凝劑、蛋白純化平臺、治療性受體結合蛋白。
文檔編號A61K39/385GK1659187SQ03813504
公開日2005年8月24日 申請日期2003年5月12日 優先權日2002年5月10日
發明者丹尼爾·C·卡特, 切斯特·Q·李 申請人:新世紀藥品有限公司