專利名稱：白細胞介素23-白細胞介素6融合蛋白及制備方法
技術領域：
本發明涉及一種白細胞介素23 (IL-23) —白細胞介素6(IL-6)的融合蛋白，提供一種生物技術來制備白細胞介素23—白細胞介素6融合蛋白的方法。
背景技術：
以往研究表明IL-23是由p19和IL-12的p40亞單位通過二硫鍵相連組成的異二聚體。由活化的樹突狀細胞(DC)和巨噬細胞(M(p)產生，它能促進DC對腫瘤抗原肽的提呈，能影響T細胞的增殖，并且除了直接作用于T細胞外，IL-23還能通過DC來活化和調節T細胞依賴的免疫應答。另外，IL-23具有較強的抗腫瘤作用，IL-23因其所誘導的IFN，的產生較少及對APC的激活作用將有望成為腫瘤治療中一種新的、更為安全的選擇。IL-6是一具有明顯抗腫瘤活性的生物免疫調節劑，屬參與造血、免疫的多功能因子，其特點是抗腫瘤活性高，毒性作用小。新近研究證實，IL"6可直接作用于NK細胞，并促進其功能分化。

發明內容
本發明目的是提供一種白細胞介素23 (IL-23) —白細胞介素6〈IL-6)的融合蛋白，提供一種生物技術制備白細胞介素23 —白細胞介素6融合蛋白的方法。
本發明的目的是通過下述方法實現的我們以IL-23功能區特異性的上下游引物，通過RT-PCR合成包含信號肽序列及BamHI-EcoRI兩個酶切位點的IL-23 cDM，同理以IL~€功能區特異性的上下游引物合成無信號肽序列的包含Xhol-Xbal兩個酶切位點及終止密碼子TGA的IL-6 cDNA 。經過純化酶切，連接重組至表達載體pcDNA3.1(+)。將該pcDNA3.1(+)/IL-23-IL-6重組質粒轉染至中國倉鼠卵巢細胞(CHO)進行表達，表達產物即為IL-23-IL-6融合蛋白。
IL-23-IL-6融合蛋白較IL-23、 IL-6單因子或雙因子聯合都有更多的生物學效應，達到了很好的協同效應。
具體實施例方式
以下對本發明作詳細說明
一、 引物合成利用Sequce程序通過計算機分析確定轉譯的最佳起始區域，使其具有最小自由能，最佳堿基排列，確保兩個引物之間，引物與模板之間具有最少的配對以避免擴增不必要的序列。在IL-23上游引物中導入Bamffl酶切位點，接著為起始密碼子ATG及信號肽序列；在下游引物中導入EcoRI酶切位點。在IL-6上游引物中導入Xhol酶切位點；下游引物中導入終止密碼子TGA及XbaI酶切位點。
二、 基因克隆通過RT-PCR合成包含信號肽序列及BamHI-EcoRI兩個酶切位點的IL-23 cDNA，同理以IL-6功能區特異性的上下游引物合成無信號肽序列的包含XhoI-Xbal兩個酶切位點及終止密碼子TGA的IL-6cDNA,經過純化，再以T-A克隆進行擴增，最后將該IL-23 cDNA與IL-6 cDNA分別克隆入pcDNA3.1 (+)表達載體，以BamHI-EcoRI和Xhol-Xbal雙酶切鑒定及測序分析。
三、 真核細胞表達將上述陽性克隆轉染CHO細胞表達，收集表達上清，以ELISA檢測IL-23與IL-6的表達。
四、 純化及活性鑒定對表達上清進行蛋白純化，純化后的蛋白進行淋巴細胞增殖試驗，證實該表達產物可明顯增強淋巴細胞增殖，且比單獨的IL"23與IL-6效果更為明顯。
權利要求
1、一種白細胞介素23—白細胞介素6(IL-23-IL-6)的融合蛋白，其特征在于由白細胞介素23與白細胞介素6多肽序列組成。
2、 如權利要求l所述的融合蛋白，其特征在于IL-23cDNA含起始密碼子、信號肽序列 和雙酶切位點。
3、 如權利要求1所述的融合蛋白，其特征在于IL-6 cDNA含雙酶切位點及終止密碼子。
4、 一種白細胞介素23—白細胞介素6融合蛋白的制備方法，其特征在于IL-23、 IL-6 基因的克隆；融合蛋白的表達、純化及活性鑒定。
5、 如權利要求l所述的融合蛋白，其特征在于兩因子融合有較好的協同抗腫瘤效應。
全文摘要
一種白細胞介素23(IL-23)-白細胞介素6(IL-6)的融合蛋白，通過RT-PCR合成IL-23與IL-6 cDNA，經過純化擴增酶切，將兩者連接重組至真核表達載體pcDNA3.1(+)。該重組質粒的表達產物為IL-23-IL-6融合蛋白。它較IL-23、IL-6單因子有更好的協同抗腫瘤效果。
文檔編號C07K19/00GK101469029SQ20071017346
公開日2009年7月1日 申請日期2007年12月27日 優先權日2007年12月27日
發明者峰 李 申請人:上海匯康生物科技有限公司