專利名稱：抗菌肽融合蛋白基因、其重組載體、其轉化體及其表達產物的制作方法
技術領域：
本發明屬于基因工程藥物領域，具體涉及抗菌肽citropin 1. 18融
合蛋白基因、含有該基因的重組載體和轉化體以及該基因的表達產物 和其用途。
背景資料
新生血管生成，是指從既存的成熟血管形成新的毛細血管網絡的過 程，這個過程對于脊椎動物的生理發育和損傷組織的修復是必需的， 同時，許多疾病的病理過程都涉及到新生血管生成，包括腫瘤生長、 心血管疾病、糖尿病性視網膜病變、銀屑病和風濕性關節炎等疾病
(Ortega N， Werb Z.. J Cell Sci, 2002， 115(Pt 22): 4201—4214; Sottile J. Biochim Biophys Acta, 2004， 1654(1): 13-22; Hamano Y et al Biophys Res Commun， 2005， 333(2): 292-298)。
腫瘤是一種環境因素與遺傳因素互相作用而產生的一類疾病，是細 胞中多種基因突變累積的結果。目前，腫瘤化療技術已經取得了相當 的進步，從而使腫瘤患者生存時間明顯延長，特別是對白血病、惡性 淋巴瘤等治療有了突破，但對危害人類生命健康最嚴重的、占惡性腫 瘤90%以上的實體瘤的治療未能達到滿意的效果。藥學家和腫瘤學家越 來越深刻地認識到要提高腫瘤治療的效果，必須從腫瘤發生發展的 機制著手，才能取得新的突破性進展。1971年，Folkman(NEngl JMed， 1971， 285(21): 1182-1186)提出"腫瘤的生長和轉移都依賴于新生血 管的生成"的觀點。腫瘤的生長取決于腫瘤細胞和腫瘤血管內皮細胞 的數量，兩者相互依存，任何一種細胞群的增減都會導致另一細胞群的相應增減。
循此思路的研究，已有多種抑制新生血管生成的藥物，如腫瘤抑素
(tumstatin)、血管生成抑素(angiostatin)、內皮抑素(endostatin)、 kringle5、抗-凝血酶III用于抗腫瘤的研究，有的已經進入臨床研究階 段，它們通過作用于遺傳上穩定，不易產生藥物抗性的內皮細胞來抑 制腫瘤的生長(R. Kalluri. Cold Spring Harb Symp Quant Biol， 2002， 67: 255-266; Nyberg P et al. Cancer Res， 2005， 65(10): 3967-3979; Maeshima Y et al. J Biol Chem， 2000， 275(28): 21340-21348)。 腫瘤抑素屬于膠原蛋白IV a3鏈的一部分。每一個a3鏈單體由一個 半胱氨酸豐富的N端7S區，中間的三螺旋區和C端球形非膠原區(NC1) 組成。三條a3鏈通過NCl區相互作用、三螺旋區的纏繞、7S區的共 價結合構成了三聚體結構。兩個三聚體通過NC1區頭與頭相連。四個 三聚體通過7S區共價連接構成膠原蛋白IV的網狀結構。腫瘤抑素由 麗P-9蛋白水解酶從膠原蛋白IV a3鏈水解而來，分子量為28kD，由 244個氨基酸組成，其中12個氨基酸來源于三螺旋區，232個氨基酸 位于NC1區；有兩個活性區 一個具有抗腫瘤細胞增殖作用的靠近C 端的185~203氨基酸之間，另一個具抗腫瘤血管生成作用的接近N端 的54-132氨基酸之間(tum-5)。其抗腫瘤血管生成作用與二硫鍵無關， 在去除二硫鍵或將二硫鍵烷基化時，tum-5的活性不受影響。利用這種 特性將tum-5分成八個肽，人工合成重疊序列來研究其活性區，研究 表明T7肽(74~98)具有與turn-5相同的抗血管生成作用，因此腫瘤 抑素抗血管作用活性區可能位于中間的25個氨基酸。同時T7肽還可 改造成與其具同等作用的易溶的T8肽(MaeshimaYet al. JBiolChem， 2001， 276(34) :31959-31968)。
抗菌肽citropinl. 18來源于藍嶺樹蛙(Litoria citropa)的皮腺 分泌物，是16個氨基酸殘基組成的活性小分子肽，可通過其C末端帶 正電荷的極性氨基酸，與腫瘤細胞膜表層帶負電荷的磷脂(PS)產生
靜電引力作用，使多肽聚集于腫瘤細胞膜表面。聚集的多肽呈現a-螺 旋結構，非極性的一側疏水氨基酸借疏水作用伸入細胞膜內層，造成 膜內分子位移、質膜穿孔，從而殺傷腫瘤細胞。
目前研究的抗腫瘤藥物，基本上都是從抗血管活性、或直接殺傷腫 瘤細胞等單方面著手， 一定程度上作用手段單一，容易產生耐藥性。 有些如腫瘤壞死因子a (TNFci),大量的動物試驗表明具有強大的抗 腫瘤活性，但臨床效果不理想，原因是毒副作用太大。
若可以從同時直接殺傷腫瘤細胞和抑制新生血管兩方面著手，這為 抗腫瘤以及和所有與新血管生成相關的疾病治療提供了一條新思路。

發明內容
本發明所要解決的技術問題發明一種藥物能直接殺傷腫瘤細胞和 /或抑制腫瘤新生血管，為抗腫瘤以及和所有與新血管生成相關的疾病 治療提供了一條新的選擇。
為解決的上述技術問題，本發明公開了涉及含有與抗菌肽 citropin 1. 18或其片段或其變體融合的抗血管生成肽或其片段或其 變體的蛋白質。
本文將這些融合蛋白通稱為"本發明的抗菌肽citropin 1.18融 合蛋白"。本發明的這些融合蛋白表現出直接殺傷腫瘤細胞和/或抑制 新生血管活性。
本文所用術語"蛋白質"和"肽"不局限于但包括蛋白質、多肽 以及肽。所述抗血管生成肽包括但不限于具有抗血管生成活性的腫瘤 抑素(tumstatin)、血管生成抑素(angiostatin )、內皮抑素 (endostatin)、 kringle5、抗凝血酶III或其片段或其變體。
本發明還涉及雙功能(或多功能)融合蛋白，其中抗菌肽cittopin 1.18與兩個(或多個)抗血管生成肽結合，任選所述抗血管生成肽是 不同的抗血管生成肽，包括但不限于具有抑制血管生成之特性的腫瘤
抑素(tumstatin)、血管生成抑素(angiostatin )、 內皮抑素 (endostatin)、 kringle5、抗-凝血酶III或其片段或其變體。與僅含 有一種抗血管生成肽的抗菌肽citropin 1.18融合蛋白相比，所述雙 功能(或多功能)融合蛋白還能表現出協同的抗一血管生成作用。
所述的抗菌肽citropin 1. 18為具有序列表中SEQ ID NO. 1所述 的氨基酸序列的肽。
在一實施例里，所述的抗血管生成肽優選為具有序列表中SEQ ID NO. 3所述的氨基酸序列的肽。
在一實施例里，所述抗菌肽citropin 1.18融合蛋白優選為具有 序列表中SEQ ID NO. 5所述的氨基酸序列的融合蛋白。在本發明里， 該融合蛋白命名為"Tumpin"。
本發明還涉及一類citropin 1.18融合蛋白，其中一個(或多個) 抗血管生成肽，任選為不同的抗血管生成肽與兩個相同或不同的抗菌 肽citropin 1. 18分子或其片段或變體結合。
另外，本發明還包括經化學修飾本發明的融合蛋白，以增強生物 活性或調制生物活性。
本發明還包括編碼抗菌肽citropin 1.18融合蛋白的核酸分子以 及含有這些核酸的載體，被這些核酸載體轉化的宿主細胞，以及使用 這些核酸、載體和/或宿主細胞制備本發明的抗菌肽citropin 1.18 融合蛋白的方法。
本發明還包括經修飾后含有本發明的核酸分子、任選經修飾后可 以表達由所述核酸分子編碼的抗菌肽citropin 1.18融合蛋白的轉基 因生物體。
本發明還包括藥物組合物，其含有本發明的抗菌肽citropin 1. 18 融合蛋白和藥學可接受的載體。
所述藥物組合物可用于預防、治療或改善患者(如哺乳動物或人) 與血管生成有關的疾病、疾病癥狀或相關失調的方法，所述方法包括
給患者施用藥物組合物的步驟。
本發明還包括使與使用中高濃度的抗血管生成肽治療哺乳動物有 關的副作用(如注射位點反應、頭疼、惡心、發燒、能量水平提高、 皮疹、虛弱、腹瀉、眩暈、過敏反應、異常低的中性粒細胞水平)潛 在最小化的方法，所述方法包括給所述哺乳動物施用與抗菌肽
citropin 1.18融合蛋白。
本發明包括預防、治療或改善由血管生成引起的相關疾病或失調 的方法，所述方法包括給需要所述預防、治療或改善的哺乳動物施用 含有有效量抗血管生成肽(或其片段或其變體)的本發明的抗菌肽 citropin 1. 18融合蛋白，以治療、預防或改善疾病或失調。在本發明 中，抗血管生成肽也被稱為"治療性蛋白質"。
另外，本發明還涉及可用于以下方面的應用和方法抑制腫瘤細 胞和/或內皮細胞增殖和/或遷移；抑制腫瘤誘導的血管生成；抑制原 發性腫瘤和轉移的生長或促進其消退；以及治療癌癥、糖尿病性視網 膜病、進行性黃斑變性或類風濕性關節炎和所有與血管生成相關的疾 病。
本發明所公開的含有與抗菌肽citropin 1. 18或其片段或其變體 融合的抗血管生成肽或其片段或其變體的蛋白質能同時直接殺傷腫瘤 細胞和抑制新生血管，為抗腫瘤以及和所有與新血管生成相關的疾病 治療提供了一條新的選擇。


圖1 Tumpin融合基因的模式圖。
圖2重組質粒Tumpin/pMAL-c2X cDNA的構建圖。
圖3蛋白SDS-PAGE電泳圖。
圖4一實施例中，酰胺化Tumpin的ESI-MS圖譜。
圖5 —實施例中，酰胺化Tumpin抑制內皮細胞增殖試驗。圖6 —實施例中，酰胺化Tu卿in對NCI-H640細胞毒活性實驗。 圖7 —實施例中，酰胺化Tumpin對1990細胞毒活性實驗。 圖8 —實施例中，酰胺化Tumpin抑制體外管狀結構生成實驗。 圖9重組質粒Tumpin/ pGEX-4T-3 cDNA的構建圖。 賊雄襯
下文將進一步詳細討論本發明的多個方面。
本文所用"抗菌肽citropin 1.18"來源于藍嶺樹蛙(Litoria citropa)的皮腺分泌物，是16個氨基酸殘基組成的活性小分子肽， 可通過其C末端帶正電荷的極性氨基酸，與腫瘤細胞膜表層帶負電荷 的磷脂(PS)產生靜電引力作用，使多肽聚集于腫瘤細胞膜表面。聚 集的多肽呈現a -螺旋結構，非極性的一側疏水氨基酸借疏水作用伸入 細胞膜內層，造成膜內分子位移、質膜穿孔，從而殺傷腫瘤細胞。抗 菌月太citropin 1. 18的氨基酸序列見SEQ ID NO. 1，其cDNA序列見SEQ ID NO. 2。
本文所用"腫瘤抑素"(tumstatin)分子量為28kd，由244個氨 基酸組成，包括膠原IV a3的NCl活性區域的232個氨基酸和中間3 股螺旋區C-端的12個氨基酸。腫瘤抑素可能是由腎、肺和睪丸的基膜 釋放的，這些組織富含特定的膠原IV (i3鏈。現有的假說認為生理 水平的腫瘤抑素是基膜重構的一種反應產物。
本文所用"T8" (Tumstatin69 95)分子量為3. 2kd，由27個氨基 酸組成，來源于Tumstatin中具抗腫瘤血管生成作用的接近N端的 54 132氨基酸(tum-5)。 Tumstatin (腫瘤抑素)可能是由腎、肺和睪 丸的基膜釋放的，其有兩個活性區 一個具有抗腫瘤細胞增殖作用的 靠近C端的185~203氨基酸之間，另一個具抗腫瘤血管生成作用的接 近N端的54 132氨基酸之間(turn-5)。 turn-5的抗腫瘤血管生成作用 與二硫鍵無關，在去除二硫鍵或將二硫鍵烷基化時，tum-5的活性不受 影響。利用這種特性將tum-5分成八個肽，人工合成重疊序列來研究
其活性區，研究表明T8肽(69~95)具有與tum-5相同的抗血管生成 作用，因此腫瘤抑素抗血管作用活性區可能位于中間的25個氨基酸。 T8 (tumstatin69-95)的氨基酸序列見SEQ ID NO. 3，其cDNA序列見SEQ ID NO. 4。
本發明所用的腫瘤抑素表現出抗血管生成活性，還可進一步具有 其它的優良特征，例如增加的生物可利用度，和/或穩定性，或降低 的宿主免疫識別。
使用本領域已知的方法即可鑒定出可用于本發明的抗菌肽 citropin 1. 18融合蛋白的活性片段及其變體，所述方法包括列入本文 作為參考的專利和參考文獻中描述的那些方法。
本文所用"血管生成抑素"(angiostatin)于1994年0， Reilly et
al首次從Lewis肺癌小鼠的血清和尿液中分離得到，系纖溶酶原降解 產物，Mr 38 000，由350個氨基酸殘基組成，特異性作用于內皮細胞， 抑制血管生成.研究表明，Kringle區是血管抑素的抗血管生成作用 的關鍵結構.所謂Kringle區為三個二硫鍵組成的環狀區域，纖溶酶 原有5個串聯的Kringle區，除Kringle 4夕卜，Kringle 1， 2， 3， 5 的產物都分別有程度不同的抑制血管生成活性.血管抑素具有前4個 Kringle區。血管抑素的作用機制可能包括(l)抑制內皮細胞表面 ATP合成酶的活性；(2)抑制VEGF和bFGF活化內皮細胞細胞外信號 調節酶(ERK-1， ERK-2)，抑制內皮細胞遷移；(3)抑制內皮細胞的增 生；(4)抑制纖溶酶活性，阻止內皮細胞遷移；(5)誘導內皮細胞凋亡; (6)抑制血管生成素的產生。血管抑素已成功治療多種腫瘤動物模型， 如纖維肉瘤，黑色素瘤，前列腺癌，卵巢癌等。
在一個實施方案中，本發明所用的血管生成抑素的氨基酸序列見 GI:19111150。
本發明所用的血管生成抑素表現出抗血管生成活性，還可進一步 具有其它的優良特征，例如增加的生物可利用度，和/或穩定性，或降低的宿主免疫識別。
使用本領域已知的方法即可鑒定出可用于本發明的抗菌肽
citropin 1. 18融合蛋白的活性片段及其變體，所述方法包括列入本文 作為參考的專利和參考文獻中描述的那些方法。
本文所用內皮抑素(endostatin)是0' Reilly等于1997年首次 在患內皮細胞瘤的小鼠血清中分離獲得的，是大分子膠原蛋白XVIII 的羧基末端非膠原區片段，由183個氨基酸殘基組成，相對分子質量 為20kD。其抗腫瘤血管生成作用強于angiostatin。 endostatin能特 異地抑制內皮細胞增生并明顯抑制腫瘤的生長和轉移。用endostatin 處理牛肺動脈內皮細胞可致細胞凋亡，且可明顯減少抗凋亡蛋白 bcl-2和bcl-xl的產生，但在其它非內皮細胞中則未觀察到這種作用， 提示endostatin可能選擇性地引起內皮細胞凋亡。近來研究發現， endostatin也可通過與纖維母細胞生長因子競爭及通過阻止G0/G1期 向S期轉變等不同途徑抑制內皮細胞增殖。endostatin除單純使用具 有抗腫瘤活性外，作為一類新型抗腫瘤藥物還可以與傳統的化療、放 療聯合應用，具有明顯的協同作用。目前endostatin己在不同腫瘤中 進入臨床試驗期，并在肺癌、乳腺癌中顯示出較好的療效。我國SFDA 已批準重組的endostatin作為實驗性藥物上市。
本發明所用的內皮抑素表現出抗血管生成活性，還可進一步具有 其它的優良特征，例如增加的生物可利用度，和/或穩定性，或降低 的宿主免疫識別。
使用本領域已知的方法即可鑒定出可用于本發明的抗菌肽 citropin 1. 18融合蛋白的活性片段及其變體，所述方法包括列入本文 作為參考的專利和參考文獻中描述的那些方法。
本文所用kringle5是纖溶酶原中存在的、內皮抑素結構以外的纖 溶酶原內部片段。Kringle 5顯示出與纖溶酶原前4個kringle結 構域約50 %的序列同一性和結構相似性(Cao， Yetal， JBiolChem. Vol. 271， No 46， pp 29461-29467， 1996; Cao ， Y etal ， J Biol Chem . Vol. 272， No36， pp 22924-22928， 1997和Lu H， et al; Biochem Biophysical Research Communications, Vol. 258, pp 668-673， 1999)。
本發明所用的"Kingie 5"肽表現出抗血管生成活性，還可進一 步具有其它的優良特征，例如增加的生物可利用度，和/或穩定性， 或降低的宿主免疫識別。
使用本領域已知的方法即可鑒定出可用于本發明的抗菌肽 citropin 1. 18融合蛋白的活性片段及其變體，所述方法包括列入本文
作為參考的專利和參考文獻中描述的那些方法。
Alphastatin是Carolyn等于2004年在對纖維蛋白原 (fibrinogen)不同片斷對血管生成活性影響的分析后發現的具抑制 血管生成功能的內源性物質，由24個氨基酸組成，是現階段發現的最 小內源性肽段血管生成抑制物質。Alphastatin主要通過抑制內皮細 胞的遷移和管狀化而發揮抑制血管生成作用，但具體的作用機制尚不 清楚。Alphastatin抑制血管生成活性強，在動物實驗中，使用較低 劑量即能獲得很好抗腫瘤活性(0.025mg/kg/d)，有較好的潛在臨床應 用前景。
在一個實施方案中，Alphastatin的氨基酸序列和DNA序列參見 Staton等的報道(Staton CA et al, ， Blood 2004; 103(2) :601-6)。)
本文所用"抗菌肽citropin 1.18融合蛋白"指的是至少一個抗 菌肽citr叩inl. 18 (或其片段或變體)分子與至少一個治療性蛋白質 (或其片段或變體)分子融合形成的蛋白質。
本發明的抗菌肽citropin 1.18融合蛋白含有至少一個治療性蛋 白質片段或變體以及至少一個抗菌肽citropin 1. 18片段或變體，彼 此通過例如基因融合(即通過翻譯核酸表達抗菌肽citropin 1.18融 合蛋白，在所述核酸中，編碼全部或部分治療性蛋白質的多核苷酸與
編碼全部或部分抗菌肽citropin 1.18的多核苷酸框內連接)相互連接。
在一個實施方案中，本發明提供了抗菌肽citropin 1.18融合蛋 白，其含有治療性蛋白質和抗菌肽citropin 1.18，或由它們組成。在 其它實施方案中，本發明提供了抗菌肽citropin 1.18融合蛋白，其 含有治療性蛋白質的生物活性和/或治療活性片段和抗菌肽citropin 1.18，或由它們組成。
在一個實施方案中，抗菌肽citropin 1.18融合蛋白含有抗菌肽 citropin 1.18作為N-末端部分，含有治療性蛋白質作為O末端部 分。或者，也可使用含有抗菌肽citr叩in 1.18作為C-末端部分，含 有治療性蛋白質作為N-末端部分的抗菌肽citropin 1.18融合蛋白。
在其它實施方案中，抗菌肽citropin 1.18融合蛋白具有與抗菌 肽citropin 1. 18 N-末端和C-末端融合的治療性蛋白質。在一個實施 方案中，在N-和C-末端融合的治療性蛋白質是相同的治療性蛋白質。
在另一個實施方案中，在N-和C-末端融合的治療性蛋白質是不 同的治療性蛋白質。在另一個實施方案中，在N-和C-末端融合的治 療性蛋白質是可用于治療或預防相同疾病的、不同的治療性蛋白質。 在另一個實施方案中，在N-和C-末端融合的治療性蛋白質是可用于 治療或預防本領域已知一般同時出現于患者身上的疾病的、不同的治 療性蛋白質。
另外，本發明的抗菌肽citropin 1.18融合蛋白可在融合部分之 間包括接頭肽，以在組成成分之間提供較大的物理間距，從而使治療 性蛋白質部分的可靠近性最大化，例如用于結合其相應的受體。接頭 肽可由易彎曲或更剛性的氨基酸組成。
因此，如上所述，本發明的抗菌肽citropin 1.18融合蛋白可具 有下式R2-Rl、 R1-R2、 Rl-L- R2-L-Rl 、 Rl-L-R2、 R2-L-Rl或 R2-L-R1-L-R1，其中Rl是至少一個治療性蛋白質，肽或多肽序列(包
括其片段或變體)，但不必是相同的治療性蛋白質，L是接頭肽，R2是 抗菌肽citropin 1. 18序列(包括其片段或變體)。接頭肽包括例如 (GGGGS )n或(GGGS) N或(GGS) N，其中N是大于或等于1的整數， G表示甘氨酸，S表示絲氨酸。當Rl是兩個或多個治療性蛋白質、肽 或多肽序列時，任選通過接頭連接這些序列。
本文所用"治療性蛋白質"指的是具有抑制血管生成治療和/或 生物活性的抗血管生成肽，例如具有一種或多種治療和/或生物活性 的具有抑制血管生成之特性的腫瘤抑素、血管生成抑素、內皮抑素、 kringle5、抗-凝血酶III或其片段或其變體。因此，本發明的抗菌肽 citropin 1. 18融合蛋白至少含有一治療性蛋白質的片段或變體。
另外，術語"治療性蛋白質"可指治療性蛋白質的內源性或天然 關聯物。變體包括突變體、類似物和模擬物以及同系物，包括治療性 蛋白質的內源性或天然關聯物。
顯示出"治療活性"的多肽或具有"治療活性"的蛋白質指的是 具有一種或多種與治療性蛋白質有關的已知生物和/或治療活性的多 肽，例如本文所述的或本領域已知的一種或多種治療性蛋白質。作為 一個非限制性的例子，"治療性蛋白質"是可用于治療、預防或改善疾 病的蛋白質。本文所用的"治療活性"或"活性"可指其效果與希望 在人或非人哺乳動物或其它物種或生物體中出現的治療結果一致的活 性，可以在體內或體外測定治療活性。例如，可以在細胞培養物中檢 測所需的效果。對于多種本領域已知的治療性蛋白質而言，所述體外 或細胞培養試驗一般是容易做到的。
另外，可通過結合一個或多個寡糖基團來修飾對應于本發明抗菌 肽citropin 1.18融合蛋白中治療性蛋白質部分的治療性蛋白質。被 稱為糖基化的這種修飾可顯著影響蛋白質的物理特性，對于蛋白質的 穩定性、分泌和定位也很重要。所述修飾詳細描述于美國臨時申請流 水號60/355,547和WO 01/79480 (列入本文作為參考)。
可以修飾對應于本發明的抗菌肽citropin 1.18融合蛋白的治療 性蛋白質部分的治療性蛋白質及其類似物和變體，以使作為對其核酸 序列進行操作的結果，或由于其表達的其它條件所致，對其進行表達 的宿主細胞改變了一個或多個位點處的糖基化。例如，通過取消或導 入糖基化位點，例如通過取代或缺失氨基酸殘基，如用谷氨酸胺取代 天冬酰胺即可產生糖基化異構體，或者通過在不會使其糖基化的宿主 細胞，如大腸桿菌或糖基化一缺陷酵母中表達蛋白質，即可產生非糖 基化的重組蛋白質。這些方法的例子更詳細地描述于美國臨時申請流 水號60/355， 547和W0 01/79480 (列入本文作為參考)中并且是本領 域己知的。
本文所用"片段"還涉及所述治療性蛋白質、抗菌肽citropin 1. 18 和/或本發明的抗菌肽citr叩in 1.18融合蛋白的片段。即使從蛋白 質的N-末端或C-末端缺失一個或多個氨基酸會導致治療性蛋白質、 抗菌肽citropin 1. 18和/或抗菌月太citropin 1. 18融合蛋白的一或 多種生物功能的修飾或損失，但仍舍保留其它的治療活性和/或功能 活性(例如生物活性、多聚化的能力、與配體結合的能力)。
因此，對應于本發明的抗菌肽citropin 1.18融合蛋白的治療性 蛋白質部分的治療性蛋白質片段包括全長蛋白質，以及從對應多肽氨 基酸序列的氨基末端缺失了一個或多個殘基的多肽。本發明還包括編 碼這些多肽的多核苷酸。
另外，對應于本發明抗菌肽citropin 1.18融合蛋白中抗菌肽 citropin 1.18多肽片段包括全長多肽以及從對應多肽氨基酸序列的 氨基末端缺失了一個或多個殘基的多肽。本發明還包括編碼這些多肽 的多核苷酸。
如上所述，即使從參照多肽(如治療性蛋白質和/或抗菌肽 citropin 1. 18)的N-末端或C-末端缺失一個或多個氨基酸會導致蛋
白質一或多種生物功能的修飾或損失，但仍會保留其它的功能活性(例 如生物活性、多聚化的能力、與配體結合的能力)和/或治療活性。
本文所用"變體"指的是與參照核酸或多肽不同，但保留了其必 需特性的多核苷酸或核酸。 一般說來，變體總體上非常類似，很多區 域與參照核酸或多肽相同。
本文所用"變體"指的是所述治療性蛋白質部分、抗菌肽citropin 1. 18部分或本發明的抗菌肽citropin 1. 18融合蛋白部分在序列上與 治療性蛋白質、抗菌肽citropin 1. 18和/或本發明的抗菌肽citropin 1. 18融合蛋白有所不同，但如本文其它地方所述或如本領域所知，前 者仍能保留其至少一種功能和/或治療特性。 一般說來，變體總體上 非常類似，很多區域與對應于本發明的抗菌肽citropin 1.18融合蛋 白的治療性蛋白質部分的治療性蛋白質、對應于本發明的抗菌肽 citr叩in 1. 18融合蛋白的抗菌肽citropin 1.18、和/或本發明的抗 菌肽citr叩in 1. 18融合蛋白的氨基酸序列相同。
本發明還包括編碼這些變體的核酸。所述變體包括根據本領域已 知的一般規則進行選擇，因而對活性影響不大的缺失、插入、倒位、 重復和取代。
本發明的多肽可由肽鍵或經修飾的肽鍵互相連接的氨基酸，即肽 等組成，并可含有除了這20個由基因編碼的氨基酸以外的氨基酸。 可以用其它天然的方法，如翻譯后加工，或通過本領域眾所周知的化 學修飾技術對多肽進行修飾。基礎教科書和更詳細的專著以及多篇研 究文獻中詳細描述了所述修飾。修飾可發生在多肽中的任何位置，包 括肽主鏈，氨基酸側鏈和氨基或羧基末端。應懂得給定多肽的幾個位 點處可存在相同或不同程度的相同類型的修飾。
另外，給定多肽可含有多種類型的修飾。例如，多肽可以是分支 的，多肽也可以是具有或不具有分支的環形。環形、分支、和帶分支 的環形多肽可以由翻譯后的天然過程產生，也可以通過合成方法制備
得到。修飾包括乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、與黃素(flavin) 共價結合、與血紅素組成成分-(heme moiety)共價結合、與核苷酸或 核苷酸衍生物共價結合、與脂質或脂質衍生物共價結合、與磷脂酰肌 醇共價結合、交聯、環化、二硫鍵化、脫甲基化、共價交聯、形成半 胱氨酸、形成焦谷氨酸、'甲酰化、Y-羧基化、糖基化、形成GPI錨、 羥基化、碘化、甲基化、十四垸基化、氧化、PEG修飾、蛋白酶解加 工、磷酸化、異戊二烯化(prenylation)、外消旋化、硒化、硫酸鹽 化(sulfation )、由轉運-RNA介導在蛋白質上添加氨基酸(如精氨酰 化)和遍在蛋白化。
本發明包括的其它翻譯后修飾包括例如N-聯或O-聯糖鏈，加 工N-末端或C-末端，使化合物組成成分與氨基酸主鏈結合，對N -聯或0—聯糖鏈進行化學修飾，以及作為原核宿主細胞表達的結果添 加或缺失N-末端甲硫氨酸殘基。也可以用例如但不限于如藥物的化學 治療劑和/或如酶、熒光、同位素和/或親和標記的可測標記來修飾 抗菌肽citropin 1.18融合蛋白，以檢測和分離蛋白質。所述修飾的 例子是本領域已知的，參見例如美國臨時申請流水號60/355,547和 W0 01/ 79480 (列入本文作為參考)。
融合蛋白的表達
通過從酵母、如細菌的微生物或人或動物細胞系中分泌，可產生 重組分子形式的本發明的抗菌肽citropin L18融合蛋白。任選從宿 主細胞中分泌多肽。
許多表達系統是已知的和可用的，包括細菌(例如大腸桿菌和枯 草芽袍桿菌)，酵母(例如釀酒酵母、乳克魯維酵母)和巴斯德畢赤酵 母)，絲狀真菌(例如曲霉)，植物細胞，動物細胞和昆蟲細胞。
本發明包括編碼本發明的抗菌肽citropin 1.18融合蛋白的多核 苷酸以及含有這些多核苷酸的載體、宿主細胞和生物體。
本發明還包括通過合成和重組技術生產本發明的抗菌肽citropin 1.18融合蛋白的方法。通過本領域已知的方法可以分離和純化多核苷 酸、載體、宿主細胞和生物體。
用于本發明的載體可以是如噬菌體、質粒、粘粒、微型染色體、 病毒或逆轉錄病毒載體。可用于克隆和/或表達本發明的多核苷酸的 載體是能在需復制和/或表達多核苷酸的宿主細胞中復制和/或表達 多核苷酸的載體。 一般說來，多核苷酸和/或載體可用于任何真核或 原核細胞，包括哺乳動物細胞(如人(如HeLa)、猴(如Cos)、兔(如 兔網織紅細胞)、大鼠、倉鼠(如CH0、 NS0和幼倉鼠腎細胞)或小鼠 細胞(如L細胞))、植物細胞、酵母細胞、昆蟲細胞或細菌細胞(如 大腸桿菌)。有關適用于多種類型宿主細胞的適當載體的例子可參見例 如F. Ausubel et al. ， Current Protocols in Molecular Biology . Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience (1992)禾口 Sambrook et al. (1989)。然而，需注意的是當使用復制缺損的逆轉 錄病毒載體時，病毒增殖一般僅發生在互補的宿主細胞中。可以使用 含有這些多核苷酸的宿主細胞來大量表達可用于例如藥物、診斷試劑、 疫苗和治療劑的蛋白質。
已開發出多種方法用于經由互補的粘性末端使DNA與載體可操 作相連。例如，可在欲插入載體DNA內的DNA區段添加互補的同聚 體序列片段。然后通過互補同聚體尾之間的氫鍵連接載體和DNA區段 以形成重組DNA分子。
含有一或多種限制性位點的合成接頭提供了另一種連接DNA區 段與載體的方法。用噬菌體T4 DNA聚合酶或大腸桿菌DNA聚合酶I 處理通過內切核酸酶限制性消化產生的DNA區段，所述的兩種聚合酶 用其3'，5'-核酸外切活性除去突出的Y-單鏈末端，并用其聚合活性 補平3'-凹端。因此，這些活性的聯合產生了平端DNA區段。然后 在能催化平端DNA分子連接的酶，如噬菌體T4 DNA連接酶的存在下
將平端區段與大摩爾過量的接頭分子一起保溫。因此，反應產物是末
端攜有聚合接頭序列的DNA區段。然后用適當的限制性酶裂解這些 DNA區段，并連接至已用酶裂解的表達載體中，所述酶能產生與所述 DNA區段相容的末端。從多個商家可以買到含有多個限制性內切核酸 酶位點的合成接頭。
多核苷酸插入物應該可操作地連接于同表達多核苷酸的宿主細胞 相容的適當啟動子上。啟動子可以是強啟動子和/或誘導型啟動子。 列舉的一些啟動子的例子包括噬菌體久PL啟動子、大腸桿菌lac、 trP 、phoA、tac啟動子、SV40早期和晚期啟動子以及逆轉錄病毒LTR 啟動子。其它適當啟動子是本領域技術人員已知的。表達重組載體進 一步含有轉錄起始、終止位點，并在轉錄區含有用于翻譯的核糖體結 合位點。重組載體表達的轉錄物的編碼部分可包括位于起點處的翻譯 起始密碼子和適當地位于被翻譯多肽的末端的終止密碼子(UAA ， UGA 或UAG)。
如上所述，表達載體可包括至少一個選擇標記。所述標記包括對 真核細胞培養物而言的二氫葉酸還原酶、G418 、谷氨酰胺合酶或新 霉素抗性；以及用于大腸桿菌和其它細菌培養的四環素、卡那霉素或 氨卞青霉素抗性基因。適當宿主的代表性例子包括但不限于細菌細
胞，如大腸桿菌、鏈霉菌和鼠傷寒沙門氏菌細胞；真菌細胞，如酵母 細胞(如釀酒酵母或巴斯德畢赤酵母)；昆蟲細胞，如果蠅S2和夜蛾 SF9細胞；動物細胞，如CH0 ， COS ， NS0 , 293和Bowes黑素瘤細 胞；和植物細胞。上述宿主細胞的適當培養基和培養條件是本領域已 知的。
在一個實施方案中，可將編碼本發明的抗菌肽citropin 1.18融 合蛋白的多核苷酸與信號序列融合，所述信號序列能介導本發明的蛋 白質定位于原核或真核細胞的特定區室，和/或能介導本發明的蛋白 質從原核或真核細胞中分泌出來。
本發明還包括含有本發明的核苷酸序列的宿主細胞，所述核苷酸 序列經本領域已知的技術與一或多種異源控制區(如啟動子和/或增 強子)可操作相連。可以選擇能調節插入的基因序列的表達，或能按 照所需的特殊方式修飾和加工基因產物的宿主菌株。在某些誘導物的 存在下，某些啟動子啟動的表達會升高；因此，可以控制經基因改造 的多肽的表達。另外，不同宿主細胞具有特征性的和特殊的翻譯、翻 譯后加工和修飾(如磷酸化、裂解)蛋白質的機制。可以選擇適當的 細胞系以確保對表達的外源蛋白質進行合乎需要的修飾和加工。
通過磷酸鈣轉染、DEAE-葡聚糖介導的轉染、陽離子脂質介導的 轉染、電穿孔、轉導、感染或其它方法，即可將本發明的核酸和核酸 重組載體導入宿主細胞。所述方法描述于多個標準的實驗室手冊中， 如Davis et al.， BasicMethods In Molecular Biology ( 1986 )。
編碼本發明的抗菌肽citropin 1.18融合蛋白的多核苷酸可以與 含有選擇標記的載體連接以在宿主中增殖。 一般說來，可在沉淀物， 如磷酸躬沉淀物或其與帶電脂質的復合物中導入質粒載體。如果載體 是病毒，可使用適當的包裝細胞系在體外對其進行包裝，再轉導至宿 主細胞。
通過眾所周知的技術可以鑒定出被成功轉化的細胞，即含有本發 明的DNA重組載體的細胞。例如，可培養導入表達重組載體所得的細 胞以產生所需多肽。收集并裂解細胞，使用如Southern ( 1975 ) J. Mol. Biol. 95， 503或Berent et al (1985) Biotech. 3， 208所述的方 法，檢測其DNA內容物中DNA的存在。或者，使用抗體檢測上清液中 蛋白質的存在。
通過眾所周知的方法從重組細胞培養物中回收和純化本發明的抗 菌肽citropin 1.18融合蛋白較為有利，所述方法包括硫酸按或乙醇 沉淀、酸提取、陰離子或陽離子交換層析、磷酸纖維素層析、疏水作 用層析、親和層析、羥基磷灰石層析、疏水電荷作用層析和凝集素層
析。在一些實施方案中，可使用高效液相層析(HPLC)進行純化。
在一些實施方案中，可使用上述的一種或多種層析方法純化本發 明的抗菌肽citropin 1.18融合蛋白。在其它實施方案中，可使用下 述的一種或多種層析柱純化本發明的抗菌肽citropin 1. 18融合蛋白， 所述層析柱有- Q s印harose FF柱、 SP s印harose FF柱、 Q s印harose High Performance柱、Blue s印harose FF柱、Blue柱、 Phenyl S印harose FF柱、DEAE Sepharose FF或Methyl柱。
另外，可使用國際公開號WO 00/44772 (全文列入本文作為參考) 中描述的方法純化本發明的抗菌肽citropin 1.18融合蛋白。本領域 技術人員可以容易地改動其中所述的方法以用于純化本發明的抗菌肽 citropin 1. 18融合蛋白。可以從包括例如細菌、酵母、高等植物、昆
蟲和哺乳動物細胞的原核或真核宿主經重組技術產生的產物中回收本 發明的抗菌肽citropin 1. 18融合蛋白。
本發明提供了通過施用本發明的融合蛋白和/或編碼本發明的抗 菌肽citropin 1,18融合蛋白的多核苷酸來治療與新血管生成相關之 疾病的方法。
可以用本發明的多核苷酸和多肽或激動劑或拮杭劑治療的惡性和 轉移疾病包括但不限于本文所述和本領域已知的惡性腫瘤、實體腫瘤 和癌癥(有關所述疾病的評述可參見Fishlnan等，Medicine, 2d Ed.， J. B. Lippincott Co., Philadelphia (1985))。
因此，本發明提供了治療血管生成相關疾病的方法，所述方法包 括給需要治療的個體施用^療有效量的本發明的抗菌肽citropin 1. 18融合蛋白和/或編碼本發明的抗菌肽citropin 1. 18融合蛋白的 多核苷酸。例如，可以在多種旨在治療癌癥或腫瘤的方法中使用本發 明的融合蛋白和/或編碼本發明的抗菌肽citropin 1.18融合蛋白的 多核苷酸。 可用本發明的融合蛋白和/或編碼本發明的抗菌肽citropin 1. 18 融合蛋白的多核苷酸治療的癌癥包括但不限于實體腫瘤，包括前列腺 癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、胃癌、胰腺癌、喉癌、食管癌、睪丸癌、 肝臟癌、腮腺癌、膽道癌、結腸癌、直腸癌、宮頸癌、子宮癌、子宮 內膜癌、腎臟癌、膀胱癌、甲狀腺癌；原發性腫瘤和轉移；黑素瘤； 膠質母細胞瘤；卡波濟氏肉瘤(Kaposi' s sarcoma);平滑肌肉瘤； 非-小細胞肺癌；結腸直腸癌；晚期惡性腫瘤；和血液腫瘤，如白血病。 例如，可以局部傳遞本發明的融合蛋白和/或編碼本發明的抗菌肽 citropin 1.18融合蛋白的多核苷酸，以治療諸如皮膚癌、頭頸腫瘤、 乳腺癌和卡波濟氏肉瘤的癌癥。
本發明的抗菌肽citr叩in 1.18融合蛋白和/或編碼本發明的抗 菌肽citropin 1.18融合蛋白的多核苷酸也可用作內皮細胞增殖和腫 瘤-誘導的血管生成的抑制劑。
本發明的抗菌肽citropin 1.18融合蛋白和/或編碼本發明的抗 菌肽citropin 1.18融合蛋白的多核苷酸可用于治療除癌癥外的其它 與血管生成有關的疾病。這些疾病包括但不限于良性腫瘤(benign tumor)，例如血管瘤、聽神經瘤)、神經纖維瘤、沙眼和膿性肉芽腫； 動脈粥樣硬化性斑(artheroscleric plaque);眼血管生成病(ocular angiogenic disease),女口糖尿病性視網膜病(diabetic retinopathy)、 早熟視網膜病(retinopathy of prematurity)、黃斑變性(macular degeneration)、角膜移植物排斥(corneal graft rejection)、新生 血管性青光眼(neovascular glaucoma);晶體后纖維增生癥 (retrolental fibroplasia)、發紅(rubeosis)、 l見網膜母細胞瘤 (retinoblastoma),眼色素層炎(uvietis)和翼狀背肉(Pterygia ) (異常血管生長)；類風濕性關節炎；牛皮癬；創傷愈合延遲(delayed wound healing); 子宮內膜異位 (endometriosis); 血管發生 (vasculogenesis); 肉芽發生(granulateon );月巴大性癒痕(hepe—
trophic scar)(瘢痕疙瘩(keloids));骨不連合性骨折(nonunion fracture); 硬皮病(sclemoderma); 沙目艮；血管粘連(vascular adhesion ); 心肌血管生成(myocardial angiogenesis); 冠狀偵俠
(coronay collaterall); 大腦側突(cerebral collateral); 動靜 脈畸形(arteriovenous malformation);局部缺血性肢體血管生成
(ischemic limb angiogenesis);奧斯勒綜合征(Osier-Webber Syndrome)5 斑新血管生成(Plaque neovascularization); 毛細管擴 張(telangiectasia); 血友病關節(hemophiliac joints); 血管纖 維瘤(angiofibroma ); 纖維肌性發育不良癥(bromuscular dysplasia);傷口肉芽發生(wound granulation);節段性回腸炎
(crohn， s disease);禾口動脈粥樣硬化(atherosclerosis)。
另外，本發明的抗菌肽citropin 1.18融合蛋白可用于治療或預 防疾病。例如，本發明的抗菌肽citropin 1.18融合蛋白可用作預防 或治療劑以預防原發性腫瘤和轉移的生長或促使其消退；并可用于治 療癌癥、糖尿病性視網膜病、進行性黃斑變性或類風濕性關節炎。
另外一方面，編碼本發明的抗菌肽citropin 1.18融合蛋白的重 組載體可用作基因治療方案的一部分，用于傳遞治療有效量的抗菌肽 citropin 1. 18融合蛋白。將核酸體內導入細胞的一種方法是使用含有 核酸的病毒載體，所述核酸編碼本發明的抗菌肽citropin 1.18融合 蛋白。用病毒載體感染細胞的好處是大部分靶細胞能接受到核酸。另 外，病毒載體內編碼的分子，如病毒載體所含cDNA編碼的分子能在 接受病毒載體核酸的細胞中有效表達。所述抗菌肽citropin 1. 18融 合蛋白的延長血漿半衰期甚至能補償有可能較低的表達水平。
逆轉錄病毒載體和腺-伴隨病毒載體可用作重組基因傳遞系統，用 于在體內轉移編碼抗菌肽citropin 1.18融合蛋白的外源核酸分子。 這些載體能有效地將核酸傳遞至細胞內，轉移的核酸能穩定整合至宿 主的染色體DNA中。
可通過多種方法中的任一種將編碼本發明的抗菌肽citropin 1. 18 融合蛋白之基因的基因傳遞系統導入患者。例如，可通過靜脈內注射 全身性導入基因傳遞系統的藥物制品，由于基因傳遞載體提供的轉染 特異性，控制受體基因表達的轉錄調節序列所致的細胞一類型或組織 一類型表達或其組合，靶細胞中蛋白質的特異性轉導占優勢。
可通過任何包括非腸道(如皮下或肌內)注射或靜脈內輸注的常 規方法施用本發明的抗菌肽citropin 1.18融合蛋白或其制劑。治療 由單個劑量或一段時間內的多個劑量組成。另外，與不同抗菌肽 citropin 1. 18融合的治療性蛋白質相比，施用單個劑量或多個劑量的 頻率較低。盡管本發明的抗菌肽citropin 1.18融合蛋白可以單獨施 用，但與一種或多種可接受載體一起作為藥物制劑的形式被提供也是 合乎需要的。在與抗菌肽citropin 1. 18融合蛋白相容并且對其受體 無害的意義上說，載體必須是"可接受的"。 一般說來，載體是無菌和 無熱原質的水或鹽水。
可以方便地以單位劑量形式提供配制劑，可通過藥學領域眾所周 知的任何方法制備所述配制劑。所述方法包括使抗菌肽citropin 1. 18 融合蛋白與構成一種或多種輔助成分的載體聯合的步驟。 一般說來， 通過使活性成分與液體載體或經細分的固體載體或這兩者均勻和密切 地混合，然后，必要時使產品成形即可制備出配制劑。
適用于非腸道給藥的配制劑包括含水和不含水的無菌注射溶液， 其中可含有抗氧化劑、緩沖液、抑菌劑和使制劑適用于欲治療受體的 溶質；以及含水和不含水的無菌懸浮液，其中包括懸浮劑和增稠劑。 可以單位劑量或多劑量容器，例如密封的安氛、小管或注射器提供制 劑，也可將所述制劑儲存于僅需要在使用前添加無菌液體載體。可由 無菌粉末制備臨時用的注射溶液和懸浮液。
本發明還提供了治療和/或預防疾病(例如本文所述的一種或多種疾病)的方法，所述方法為給受試者施用處于藥物可接受載體中的、
有效量的本發明的抗菌肽citropin 1.18融合蛋白或編碼本發明的抗 菌肽citropin 1.18融合蛋白的多核苷酸("抗菌肽citropin 1. 18融 合蛋白多核苷酸")。
通過本領域眾所周知的提到如生物半衰期、生物可利用度和毒性 的參數的方法，包括利用使用本領域技術人員眾所周知的方法進行的 常規體外和體內研究所述的研究中得出的數據，可以測定欲施用的本 發明的抗菌肽citropin 1. 18融合蛋白和/或多核苷酸的有效劑量。 以與常見醫學實踐相一致的方式配制抗菌肽citropin 1, 18融合蛋白 和/或多核苷酸并確定其劑量，此時應考慮到各個患者的臨床條件(特 別是單獨用抗菌肽citropin 1.18融合蛋白和/或多核苷酸治療的副 作用)、傳遞位點、給藥方法、給藥的時間安排和操作者已知的其它因 素。
因此，由這些考慮因素來決定用于本文目的的"有效量"。例如， 決定欲傳遞之物質的有效量取決于多個因素，包括例如物質的化學結 構和生物活性，患者的年齡和體重，需要治療的準確病情及其嚴重程 度和給藥的途徑。治療的頻率取決于多個因素，如每個劑量施用的抗 菌肽citropin 1. 18融合蛋白或多核苷酸重組載體的量，以及受試者 的健康狀況和病豐。護理的醫生或獸醫可決定精確的量、劑量數目和 劑量的時間安排。
本發明的抗菌肽citropin 1.18融合蛋白和多核苷酸可施用給任 何動物，優選施用給哺乳動物和鳥類。優選的哺乳動物包括人、狗、 貓、小鼠、大鼠、兔、綿羊、牛、馬和豬，特別優選施用于人。
作為一般性的建議，本發明的抗菌肽citropin 1.18融合蛋白的 配制劑量或給藥頻率(在未融合的治療性蛋白質的摩爾基礎上)應低 于未融合的治療性蛋白質。治療有效劑量指的是足以導致癥狀改善或 疾病穩定化或患者存活期延長或生命質量改善的化合物的量。
可通過口服、直腸、非腸道、淋巴間隙內、陰道內、腹膜內、局 部(通過粉末、軟膏、凝膠、滴劑或經皮膏藥)、口腔、或作為口或鼻
噴霧劑施用抗菌肽citropin 1. 18融合蛋白和/或多核苷酸。
"藥物可接受載體"指的是任何無毒的固體、半固體或液體填充 劑、稀釋劑、膠囊材料或配制助劑。
本文所用術語"非腸道"指的是包括靜脈內、肌內、腹膜內、胸 骨內、皮下和關節內注射和灌注的給藥模式。
本發明的抗菌肽citr(Dpin 1.18融合蛋白和/或多核苷酸也適于 通過緩釋系統給藥，所述緩釋系統描述于例如美國臨時申請流水號 60/355,547和W001/ 79480 (列入本文作為參考)。
在一個實施方案中，為了進行非腸道給藥， 一般通過在單位劑量 可注射形式(溶液、懸浮液或乳劑)中使所需純度水平的抗菌肽 citropin 1.18融合蛋白和/或多核苷酸與藥物可接受載體混合來配 制藥品，所述載體就是在所用劑量和濃度下對受體無毒，并且與制劑 中的其它成分相容的載體。例如，制劑任選不包括氧化劑和其它已知 對治療劑不利的化合物。
本發明的抗菌肽citropin 1.18融合蛋白和/或多核苷酸可以單 獨施用或與其它治療劑聯合施用。可與本發明的抗菌肽citropin 1. 18 融合蛋白和/或多核苷酸聯合施用的抗菌肽citropin 1.18融合蛋白 和/或多核苷酸藥劑包括但不限于化學治療劑、抗生素、類固醇和 非類固醇抗炎癥劑、常規的免疫治療劑和/或如美國臨時申請流水號 60/355,547和W001/ 79480 (列入本i作為參考)中所述的治療。組 合物可相伴使用，例如作為混合物，分開但同時施用；或依次施用。 它包括作為治療混合物同時施用組合藥劑，以及分開但同時(例如通 過分開的靜脈內線進入相同的個體)施用組合藥劑。"聯合"給藥還包 括分開施用首先使用的一種化合物或藥劑，接著施用第二種。
適用于本發明的藥物組合物包括包含有效量的活性成分以達到其
目的的組合物。
發明說明鑒于上文對本發明的一般性描述，參考下文的實施例將 更容易理解本，提供下述實施例只是為了闡明而不是限制本發明。
無需進一步描述，可以相信本領域技術人員可使用上文的描述和 下文性的實施例來制備和利用本發明中檢測到的改變并且實踐所要求 的方法。因此，下述工作實施例具體描述了本發明的某些實施方案， 不能將其看成是對其余內容的限制。
實施例l、 Tumpin在大腸桿菌中的表達
1、 目的基因的設計
融合多肽N端為tumstatin(T8)序列，通過多聚甘氮酸的橋連Gly Gly Gly Gly Ser連接C端的citr叩in 1. 18序列。由融合肽的氨基酸 序列，根據遺傳密碼在原核生物中的偏愛性，設計得到融合肽基因DNA 序列。分別構建目的基因(1)tumstatin(T8)基因片段，該序列的5， 端引入BamH I酶切位點(GGATCC); (2)柔性連接(GGTGGCGGTGGCTCT);
(3) citropinl.l8序列，其3，端引入終止密碼子(TGATAA)及Xho I 酶切位點(CTCGAG)，以便與表達載體片段連接。
2、 單鏈寡核苷酸的序列(SEQ ID NO. 6)的合成委托上海生物工 程有限公司進行，合成cDNA總長度為162 bp，包括Tu卿incDNA、 5' 端BamH I酶切位點和3'端Xho I酶切位點參見圖1;兩個終止密碼子 TGA和TAA。單鏈寡核苷酸的序列(SEQ ID NO. 6)拼接及克隆到 pGEX-4T-3步驟見圖9。
3、 DNA序列測定，在Tumpin/pGEX-4T-3 cDNA轉化的大腸桿菌培 養皿上挑取單克隆，搖菌提取質粒DNA測序，結果完全與預計序列相 符，表明克隆成功。
二、 Tumpin基因在大腸桿菌中的表達及表達產物的酰胺化、純化、
鑒定 1、 重組質粒pMAL-c2X/Tumpin cDNA的構建 重組質粒pMAL-c2X/Tumpin cDNA的構建圖見圖2。
1) 、目的片斷pMAL-c2X/Tumpin cDNA的獲得 用質粒抽提試劑盒提取pGEX-4T-3/ Tumpin cDNA及pMAL-c2X質
粒DNA，對pGEX-4T-3/ Tumpin cDNA進行BamH I 、 Xho I雙酶切，酶 切反應體系為10XBuffer BamH I : 2ul， IOOXBSA:O. 2 " 1， Tumpin/ pGEX-4T-3:8u 1(1.2ug) ， BamH I :1.2ul ， Xho I :1.2ul ， ddH20:7.4yl，共20ul，混勻，37。C孵育2h，膠回收試劑盒回收酶切 后的Tumpin cDNA片斷。對pMAL-c2X質粒進行BamH I 、 Sal I雙酶切， 酶切反應體系為10 X Buffer BamH I :2u 1， 100 X BSA:O. 2 n 1 ， pMAL-c2X:5ix 1(1 Jig) ， BamH I :0. 8tU， Sal I :0. 8ul， ddH20: 11.2ul，共20ul，混勻，37。C孵育2h，酶切后的pMAL-c2X質粒DNA 片斷用DNA清潔試劑盒純化。
2) 、連接
連接反應體系酶切后的pMAL-c2X質粒DNA:4u 1(0.5pg)，膠回 收的Tumpin片段3u 1(0. 05u g) ， 10x DNA ligase Buffer:2 y 1, DNA ligase:lul， ddH20:10ul，混勻，短暫離心后16。C孵育6h，因為Xho I與Sal I酶切后粘性末端序列互補，故可將Tumpin cDNA片斷插入 pMAL-c2X質粒中。
2、 重組質粒的篩選和鑒定
按氯化鈣常規方法制備感受態大腸桿菌BL21 (DE3)，取上述連接混 合液10 y 1轉化感受態大腸桿菌BL21 (DE3) 100 u 1，均勻涂布于LB瓊 脂培養平板(含AmplOO u g/yl)，放置隔水式電熱恒溫培養箱37"C孵育 20h。然后從孵育平板中挑取單克隆，接種于5ml液體LB培養基(含 Ampl00ug/ul)過夜振搖培養。部分菌液保存用于送檢DNA序列測定， 剩余菌液用質粒提取試劑盒抽提質粒pMAL-c2X/Tumpin cDNA，并用 EcoR I和HindIII進行雙酶切鑒定。雙酶切后可見到約160bp的片斷，
說明Tumpin cDNA片斷已插入到表達載體pMAL-c2X中。
3、 重組pMAL-c2X/Tumpin的表達
挑帶有pMAL-c2X/citrostatin cDNA重組質粒的BL21 (DE3)單克隆 于50ml液體LB培養基中(AmplO(Htg/ml)， 37°C、 200rpm培養過夜， 然后以2%-5y。的比例接種到250ml液體LB培養基中，培養4hr，以4% 的比例接種到5L發酵培養基中，溫度37-C，起始轉速200rpm，通氣 量5L/min, PH7. 0，培養過程中通過控制轉速、通氣量維持溶氧在30°/0 以上，培養約2h-3h后，開始補加少量葡萄糖，至0D600達到10左右， 加入終濃度為O. lmM-0. 5mM的IPTG誘導，27°C-37。C誘導3-5h后，停 止發酵。8000g 、 4t:離心10min收集菌體，棄上清。
4、 超聲破菌
菌體以每克菌液加10ml冰冷的裂解緩沖液(0. lmol/L BPS， 0. 15 mol/L NaCl， 0. 25% Tween 20， 10腿ol/L 2-巰基乙醇，10 mmol/L EDTA) 中懸浮，超聲破菌，9000g離心30min，收集上清液，棄去殘渣。
5、 親和層析純化
采用Amylose Resin親合層析柱，層析柱先用柱平衡液(20mM Tris-HCL， 200mM NaCL， lmM EDTA， 1Mm azide， 1Mm DTT)平衡，然后取超 聲破碎上清液直接上柱，流速〈lml/minute，上樣完畢后，以12倍柱 體積平衡液淋洗，以柱平衡液+10mM麥芽糖洗脫液洗脫，收集融合蛋白。 電泳可見約48KD的條帶，純度在80%以上(參見圖3泳道1)。
6、 酶切
將收集的融合蛋白測定蛋白含量后，以融合蛋白Xa = 100:1的 比例加入Xa，室溫放置5小時，電泳可見融合蛋白切割率在95%以上， 出現42. 5kD和0. 5KD兩條條帶，分別是MBP和Tumpin (參見圖3泳道 2)。
7、 分離純化
純化的融合蛋白用Xa因子蛋白酶切割后，經緩沖液[PH 8.0， 20
畫1/L Tris-HCl， 20 NaCl]平衡的Q S印harose Fast Flow過
柱，25-500咖ol/L NaCl梯度洗脫，方法參照New England Biolabs 公司操作指南進行。MBP在大約125咖ol/L NaCl溶液中被洗脫， Tump in在大約225 mmol/L NaCl溶液中被洗脫。Tump in電泳，經凝膠 掃描分析系統分析，純度達95°/。以上，分子量與理論值一致(參見圖3 泳道3)。
8、酰胺化
利用CPD-Y催化體外的轉酰胺化反應，可實現對Tumpin的C端修 飾。使Tumpin C末端亮氨酸與精胺酰胺交換，產生末端為酰胺的Tumpin (酰胺化Tumpin)。間隔取樣HPLC分析發現，反應在90 120min時達 到峰值，產率大于50%，反應時間延長產率反而下降，故120min后終 止反應。反應產物用HPLC進行純化，ESI-MS測定分子量為5270，與理 論計算的分子量相符，冷凍干燥保存。(參見圖4)
實施例2、酰胺化的Tumpin活性
1、 細胞的培養
復蘇ECV304內皮細胞、成纖維細胞929、腫瘤細胞1990、NCI-H640， 自液氮罐中取出保存的凍存管迅速放入37。C水浴中快速解凍，將凍存 管放入離心機中，500rpm離心5~10min;在超凈臺中打開凍存管，吸 出原培養液；加入新鮮的培養液l-2 ml,小心吹打；吸出吹打后的細 胞懸液，裝入培養瓶中，并加入培養液6 ml,顯微鏡下觀察后置C02 孵箱培養；培養8 10h后觀察到大部分細胞貼壁，換液；以后每兩天 換液一次，細胞長至單層匯合后傳代培養；
2、 內皮細胞殺傷實驗
參照Mosmann的MTT方法進行[10] 。 ECV304內皮細胞接種于96孔 細胞培養板，每孔100yl， 37 °C、 5% C02培養箱中培養24 h，棄去 培養液，每孔加入不同濃度的藥物培養基100 ul， PBS為空白對照， 共同孵育48 h后，每孔加入5mg/ml的MTT溶液10 u 1, 4-6小時后棄
去培養液，每孔加入100ulDMS0，震蕩后測定波長570nm處的吸光度 值。根據所得到的OD值計算citrostatin對內皮細胞ECV304的抑制 率。計算抑制率(。/。^(A空白對照組-A實驗組)/A空白對照組X100y。。 結果表明Tumpin在劑量為3. 1 u g/ml時，與未酰胺化的Tumpin相比 較，能明顯抑制ECV304內皮細胞增殖(p〈0. 05);在劑量為6.2ug/ml、 12. 5 u g/ml、 25 p g/ml時，與未酰胺化的Tumpin相比較，能顯著抑制 ECV304內皮細胞增殖(p〈0. 01 )。酰胺化的Tumpin在劑量為1.5ug/ml、 6. 2 P g/ml、 50 u g/ml時，與相同劑量的T8與Citropinl. 18的混合物 (l:l)相比較，都能明顯抑制ECV304內皮細胞增殖(p〈0.05);在劑量 為3.2ug/ml、 12.5ug/ml、 25yg/ml時，與相同劑量的T8與 Citropinl. 18的混合物(1:1)相比較，能顯著抑制ECV304內皮細胞增 殖(p〈0.01)。(參見圖5) 3細胞毒活性分析
取對數生長期的腫瘤細胞(1990細胞、NCI-朋40細胞)，制成細 胞懸液，細胞數為2_2. 5X 1()S個/ml， 10(mi/孔接種96孔細胞培養板， 37 °C、 5 % C02培養箱中培養，觀察到孔中細胞長至占各孔表面積的 70 — 80%時，在上述RPMI-1640完全培養基中加入放線菌素D，使終濃 度為1.5ug/ml，配成樣品稀釋液，倍比稀釋，將加好樣品的96孔板 置37'C、 5 Q/。的C02培養箱中繼續培養22 h，棄除培養板中的培養基， 每孔加入IOO W染色液(1.5 mmol/L結晶紫)染色20min。洗去染色 液，充分干燥后，每孔加入33%的冰醋酸10(^1，充分振蕩，于入=595 nm處在測定各孔的吸光值。結果表明酰胺化的Tumpin對1990細胞、 NCI-H640細胞的ED50的濃度分別為10. " g/ml、 20u g/ml。對1990 細胞，在劑量為6.2ug/ml、 12.5ug/ml、 25 u g/ml時，與未酰胺化 的Tumpin相比較，能明顯抑制ECV304內皮細胞增殖(p〈0.05);在劑 量為3. 1 u g/ml、 50 u g/ml、 100 u g/ml時，與未酰胺化的Tumpin相 比較，能顯著抑制ECV304內皮細胞增殖(p<0. 01)。對NCI-H640細胞，
酰胺化的Tumpin在劑量為3. 1 u g/ml 、 6. 2 u g/ml 、 6. 2 u g/ml 、 12.5ug/ml、 100ug/ml時,與未酰胺化的Tumpin相比較，能明顯抑 制ECV304內皮細胞增殖(p<0. 05);在劑量為25u g/ml時，與未酰胺 化的Tumpin相比較，能顯著抑制ECV304內皮細胞增殖(p〈0.01)。與 相同劑量的T8與Citropinl. 18的混合物(1:1)相比較，酰胺化的 Tumpin對1990細胞，在各劑量組都能顯著抑制1990細胞的增殖 (p〈0.01)(參見圖6);對NCI-H640細胞，酰胺化的Tumpin在劑量為 12. 5ug/ml、 25ug/ml、 50ng/ml、 100ug/ml時，與相同劑量的T8 與Citropinl. 18的混合物(1:1)相比較，能明顯抑制NCI-H640細胞增 殖(p〈0.05)。(參見圖7)
4、體外管狀結構生成抑制實驗
ECMatrixTM在22 35'C時會很快固態化，因此要在低溫(TC以下保 存，Dilunent Buffer亦冷凍保存。在實驗前一天將裝有ECMatrixTM 的小瓶在冰上或4X:冰箱過夜，預冷無菌的微量移液管、96孔板、吸 管等儀器。
在Eppendorf管中，將100 u 1 10x的Diluent Buffer力卩入900 u 1 ECMatrixTM溶液中，緩慢混勻，避免空氣進入(最好在冷凍室完成此 項工作)。
在預冷過的96孔培養板中加入混合均勻的液體，每孔50ul， Tip 頭與ECMatrixTM溶液應始終保持冰冷。
將加好樣的培養板放置在37°C，保持1 h以上，使ECMatrixTM溶 液形成固態。
收集內皮細胞ECV304使成細胞懸液，每孔接種細胞5000~10000 個，加在ECMatrixTM的表面，每孔加完全培養基100 y 1。同時用培養 基稀釋樣品，按不同濃度加入細胞懸液中，每孔加入50yl。
將培養板放置在37。C、 5XC02的細胞培養箱種，經8 14h孵育， 在100x放大的顯微鏡下觀測結果并拍照。
結果顯示在實驗組可觀察到管狀結構數目減少或斷裂等現象；
在低劑量組(0.2)，酰胺化的Tumpin與未酰胺化的Tumpin以及相同 劑量的T8與Citropinl. 18的混合物(1:1)相比較，抑制管狀結構更明 顯，有明顯性差異。(p〈0.05);在中、高(lPg/ml、 5Pg/ml)時，酰 胺化的Tumpin與未酰胺化的Tumpin以及相同劑量的T8與 Citropinl.18的混合物(1:1)相比較，抑制管狀結構更明顯，有顯著性 差異(p<0.01)。(參見圖8)
本發明的范圍不受所述具體實施方案的限制，所述實施方案只作 為闡明本發明各個方面的單個例子，本發明范圍內還包括功能等同的 方法和組分。實際上，除了本文所述的內容外，本領域技術人員參照 上文的描述和附圖可以容易地掌握對本發明的多種改進。所述改進也 落入所附權利要求書的范圍之內。上文提及的每篇參考文獻皆全文列 入本文作為參考。
序列表.txt
<110>中國人民解放軍海軍醫學研究所
〈120〉抗菌肽融合蛋白基因、其重組載體、其轉化體及其表達產物 <160〉 5
<210> SEQ ID NO. 1 <211> 16 <212〉 PRT
<213>藍嶺樹蛙(Litoria citropa) <220〉 <221〉 <222> <400〉
Gly Leu Phe Ala Val lie Lys Lys Vsl 1 5
〈210> SEQ ID NO. 2 〈211〉 48 〈212〉 DNA
<213〉藍嶺樹蛙(Litoria citropa) 〈220〉 〈221> CDS <222> <400> 1
GGTCTGTTTG CGGTTATCAA AAAGGTGGCT AAAGTAATTA AAAAGGCA 48
<210〉 SEQ ID NO. 3 <211> 27 <212> PRT
<213>人(Homo sapiens)
<220>
〈221>
〈222〉
<400>
Lys Gin Arg Phe Thr Thr Met Pro Phe Leu Phe Cys Asn Val Asn
1 5 10-15
Asp Val Cys Asn Phe Ala Ser Arg Asn Asp Tyr Ser 20 25
<210〉 SEQ ID NO. 4 <211〉 81 <212> DNA
<213〉人(Homo sapiens)
<220>
<221> CDS
<222〉
<400>1
AAACAGCGTT TCACGACCAT GCCGTTTCTG TTCTGCAACG TTAATGACGT GTGCAACTTT 60 GCGTCTCGCA ATGATTACTC T 81
<210> SEQ ID NO. 5 <211> 48 <212> PRT <213〉人工序列 <220〉
<221> MOD—RES <222> (487 <223〉酰胺化的Leu <400〉
Lys Gin Arg Phe Thr Thr Met Pro Phe Leu Phe Cys Asn Val Asn 15 10 15
Asp Val Cys Asn Phe Ala Ser Arg Asn Asp Tyr Ser Gly Gly Gly
20 25 30
Gly Ser Gly Leu Phe Ala Val lie Lys Lys Val Ala Lys Val lie 35 4b 45
Lys Lys Xaa 48
<210〉 SEQ ID NO. 6
<211> 162
〈212〉隱
<213>人工序列
〈220>
〈221〉
<222〉
〈400>1
Ala Lys Val lie Lys Lys Leu 10 15GGATCCAAAC AGCGTTTCAC GACCATGCCG TTTCTGTTCT GCAACGTTAA TGACGTGTGC 60 AACTTTGCGT CTCGCAATGA TTACTCTGGT GGCGGTGGCT CTGGTCTGTT TGCGGTTATC 120 AAAAAGGTGG CTAAAGTAAT TAAAAAGGCA TGATAACTCG AG
權利要求
1.一種抗菌肽citropin 1.18融合蛋白，含有與抗菌肽citropin1.18或其片段或其變體融合的抗血管生成肽或其片段或其變體。
2. 如權利要求1所述的融合蛋白，其特征在于包含抗菌肽citropin 1.18和兩個(或多個)抗血管生成肽。
3. 如權利要求l所述的融合蛋白，其特征在于包含一個或多個相同 或不同的抗血管生成肽與兩個相同或不同的抗菌肽citropin 1.18分子或其片段或變體。
4. 如權利要求l所述的融合蛋白，其特征在于所述抗菌肽citropin 1. 18融合蛋白可在融合部分之間包括接頭肽。
5. 如權利要求4所述的融合蛋白，其特征在于所述接頭肽的氨基酸 序列為(GGGGS )N、 (GGGS) N或(GGS) n中之一，其中N是大 于或等于1的整數，G表示甘氨酸殘基，S表示絲氨酸殘基。
6. 如權利要求5所述的融合蛋白，其特征在于所述接頭肽的氨基酸 序列為GGGGS， G表示甘氨酸殘基，S表示絲氨酸殘基。
7. 如權利要求1-5任一項所述的融合蛋白，其特征在于所述抗血管 生成肽包括具有抗血管生成活性的腫瘤抑素、血管生成抑素、內 皮抑素、kringle5、抗凝血酶III或其片段或其變體。
8. 如權利要求l所述的融合蛋白，具有序列表中SEQ IDN0.5所述 的氨基酸序列。
9. 藥物組合物，其特征在于含有權利要求1-6、 8任一項所述的抗菌 肽citropin 1.18融合蛋白和藥學可接受的載體。
10. 權利要求1所述的抗菌肽citropin 1. 18融合蛋白在制備預防、 治療或改善由血管生成引起的相關疾病或失調的藥物中應用。
11. 權利要求10所述的血管生成引起的相關疾病選自良性腫瘤、動脈粥樣硬化性斑、眼血管生成病、類風濕性關節炎、牛皮癬、創 傷愈合延遲、子宮內膜異位、血管發生、肉芽發生、肥大性瘢痕; 骨不連合性骨折、硬皮病、奧斯勒綜合征、斑新血管生成、毛細 管擴張、血友病關節、血管纖維瘤、纖維肌性發育不良癥、傷口 肉芽發生或動脈粥樣硬化。
12. 編碼權利要求1-5、 8任一項所述的抗菌肽citropin 1. 18融合蛋 白的多核酸分子。
13. 含有權利要求12所述核酸分子的重組載體。
14. 含有權利要求13所述重組載體轉化的宿主細胞。
15. 制備權利要求1所述抗菌肽citropin 1.18融合蛋白的方法，包 括下列步驟-a) 制備可在宿主細胞里表達的重組載體，所述重組載體含有編 碼抗菌肽citropin 1. 18融合蛋白的核酸分子；b) 在宿主細胞里表達所述重組載體，形成抗菌肽citropin 1. 18 融合蛋白；c) 純化抗菌肽citropin 1. 18融合蛋白。
全文摘要
本發明屬于基因工程藥物領域，具體涉及抗菌肽citropin 1.18融合蛋白基因、含有該基因的重組載體合轉化體以及該基因的表達產物、體外酰胺化及其用途。本發明所公開的一種抗菌肽citropin 1.18融合蛋白，含有與抗菌肽citropin 1.18或其片段或其變體融合的抗血管生成肽或其片段或其變體。該融合蛋白能同時直接殺傷腫瘤細胞和抑制新生血管，為抗腫瘤以及和所有與新血管生成相關的疾病治療提供了一條新的選擇。
文檔編號C07K14/46GK101182355SQ20071004730
公開日2008年5月21日 申請日期2007年10月22日 優先權日2007年10月22日
發明者儲智勇, 術 張, 楊生生, 蔡在龍, 雷呈祥, 麗 馬 申請人:中國人民解放軍海軍醫學研究所