去除重組漢遜酵母乙肝表面抗原中宿主細胞殘留dna的方法
【專利摘要】本發明提供了一種去除重組漢遜酵母乙肝表面抗原中宿主細胞殘留DNA的方法，該方法包括：步驟a、將待去除宿主細胞殘留DNA的重組漢遜酵母表達乙肝表面抗原樣品溶于含400～500mM NaCl的10～30mM PB溶液中；步驟b、以上述溶有重組漢遜酵母表達乙肝表面抗原樣品的含NaCl的PB溶液作為上樣液，利用Monoliths QA陰離子交換柱進行層析純化，得到去除宿主細胞殘留DNA的重組漢遜酵母表達乙肝表面抗原樣品。本發明的方法能夠有效去除重組漢遜酵母乙肝表面抗原樣品中殘留DNA，使所制得疫苗滿足國家藥典三部(2010版)中對其中殘留DNA含量的規定。
【專利說明】
去除重組漢遜酵母乙肝表面抗原中宿主細胞殘留DNA的方法
技術領域
[0001] 本發明是關于一種去除重組漢遜酵母乙肝表面抗原中宿主細胞殘留DNA的方法， 具體而言，是一種關于利用層析方法去除重組漢遜酵母表達乙型肝炎表面抗原樣品中宿主 細胞殘留DNA的方法。
【背景技術】
[0002] 重組漢遜酵母乙肝疫苗是一種乙型肝炎表面抗原(HbsAg)亞單位疫苗，它是采用 基因重組的方法將乙肝病毒表面抗原的基因進行質粒構建、轉入漢遜酵母中、通過培養這 種重組酵母菌來表達乙肝表面抗原亞單位而制備的。
[0003] 重組漢遜酵母乙肝疫苗的制備技術中，純化過程是關鍵技術之一。根據國家藥典 三部（2010版)規定，重組乙型肝炎疫苗（漢遜酵母)每劑（10yg或20yg HBsAg)DNA含量不超 過10ng。目前重組漢遜酵母表達乙型肝炎表面抗原多是經丁基-瓊脂糖(Butyl-Sepharose 4B)疏水層析精制純化，然而經丁基-瓊脂糖疏水層析精制純化后的料液樣品中仍會殘留有 或多或少游離的宿主細胞DNA，殘留DNA濃度甚至可高達1000ng/ml，而HBsAg濃度一般為200 ~600μg/ml，這樣的純化料液用于制備疫苗，常常難以滿足國家藥典三部(2010版)規定的 重組乙型肝炎疫苗(漢遜酵母)每劑DNA含量不超過10ng的要求。

【發明內容】

[0004] 本發明的一個目的在于提供一種有效去除重組漢遜酵母乙肝表面抗原樣品中宿 主細胞殘留DNA的方法，以使所制得疫苗滿足國家藥典三部(2010版）中對其中殘留DNA含量 的規定。
[0005] 為達上述目的，本發明提供了一種去除重組漢遜酵母乙肝表面抗原中宿主細胞殘 留DNA的方法，該方法包括：
[0006] 步驟a、將待去除殘留宿主DNA的重組漢遜酵母乙肝表面抗原樣品溶于含400~ 500mM NaCl的 10~30mM PB溶液中；
[0007] 步驟b、以上述溶有重組漢遜酵母乙肝表面抗原樣品的含NaCl的PB溶液作為上樣 液，利用Monoliths QA(季胺基-聚甲基丙烯酸酯整體介質）陰離子交換柱進行層析純化，得 到去除殘留宿主DNA的重組漢遜酵母乙肝表面抗原樣品。
[0008] 根據本發明的具體實施方案，本發明的方法中，所述待去除宿主細胞殘留DNA的重 組漢遜酵母乙肝表面抗原樣品可為經過Buty 1-4B疏水層析精制純化后的HBsAg料液樣品。 如前所述，重組漢遜酵母乙肝表面抗原(HBsAg)經丁基-瓊脂糖(Butyl-Sepharose 4B)疏水 層析精制純化后，料液(樣品）中盡管HBsAg純度已較高(大于99%)，但仍殘留有游離的宿主 細胞DNA(宿主細胞殘留DNA濃度為180~1000ng/ml，而HBsAg濃度為200~600μg/ml)。這樣 的純化料液用于制備疫苗，特別是用于制備HBsAg較高劑量的疫苗時，往往不能滿足國家藥 典三部(2010版）中對每劑DNA含量的限定要求。
[0009] 根據本發明的優選具體實施方案，本發明的方法所適用的待去除宿主細胞殘留 DNA的重組漢遜酵母乙肝表面抗原樣品中，HBsAg純度大于99%。更優選地，這樣的待去除宿 主細胞殘留DNA的重組漢遜酵母乙肝表面抗原樣品中，HBsAg濃度為200~600μg/ml，殘留宿 主DNA濃度為180~1000ng/ml，通常每10yg HBsAg中的殘留宿主DNA含量在50ng以下，例如 為10~50ng。
[0010] 根據本發明的具體實施方案，本發明的去除重組漢遜酵母乙肝抗原樣品中宿主細 胞殘留DNA的方法，主要是先將樣品溶于含特定濃度NaCl的1?溶液中（或將樣品的原緩沖液 置換為含特定濃度NaCl的PB溶液），以此作為上樣液進行MonolithsQA陰離子交換柱層析純 化。通常情況下，HBsAg料液樣品的原緩沖液為濃度約5.0~6.5mM的低濃度磷酸鹽緩沖液， 這樣的料液樣品如果直接用于本發明的上樣柱并不能達到良好的去除宿主細胞殘留DNA的 效果。本發明中，是以含400~500mM NaCl的10~30mM高濃度PB溶液作為上樣緩沖液。其中， NaCl的添加對于純化結果（即宿主細胞殘留DNA的去除效率)具有重要影響，在本發明所述 的NaC 1濃度范圍內，宿主細胞殘留DNA的去除效率可達90 %或更高。本發明的步驟a中的含 400~500mM NaCl的10~30mM PB溶液，在所述1?溶液濃度范圍（10~30mM)內，PB溶液濃度 改變對宿主細胞殘留DNA的去除效率基本無顯著影響。另，含NaCl的PB溶液的pH值可保持與 HBsAg料液樣品的原緩沖液一致，例如，所述1?溶液的pH為7.0~7.4(該范圍內pH值的改變 對宿主細胞殘留DNA的去除效率基本無顯著影響）。此外，本發明的方法中，優選控制上樣液 中，HBsAg濃度為200~600μg/ml，宿主細胞殘留DNA濃度為180~1000ng/ml。
[0011] 將待去除宿主細胞殘留DNA的重組漢遜酵母乙肝抗原樣品（通常為溶液形式)溶于 含特定濃度NaCl的1?溶液中的過程可以采用所屬領域中任何可行的辦法，例如，可采用超 濾等技術將HBsAg料液樣品中的緩沖液置換為含400~500mM NaCl的10~30mM 1?溶液，制 備得到上樣液。
[0012] 根據本發明的具體實施方案，本發明所用的Monoliths QA陰離子交換柱可為所屬 領域中的已有設備，例如可采用奧地利公司BIA Separation的產品C丨MK Mono 1 iths層析柱 (Convective interaction media Monoliths)〇
[0013] 本發明的去除重組漢遜酵母乙肝抗原樣品中宿主細胞殘留DNA的方法中，是采用 穿透模式進行層析，即，使宿主細胞殘留DNA結合在Monolith-QA層析介質上、而HBsAg流穿 出去，收集穿透峰得到去除宿主細胞殘留DNA的重組漢遜酵母乙肝表面抗原樣品。
[0014] 根據本發明的具體實施方案，本發明的去除重組漢遜酵母乙肝抗原樣品中宿主細 胞殘留DNA的方法中，在利用Monoliths QA陰離子交換柱進行層析純化前，可采用含400~ 500mM NaCl的10~30mM PB溶液（同樣的，所述PB溶液的pH值可為7.0~7.4)對Mono 1 i ths QA陰離子交換柱進行平衡。
[0015] 根據本發明的具體實施方案，本發明的去除重組漢遜酵母乙肝抗原樣品中宿主細 胞殘留DNA的方法中，上樣時，每毫升Monolith-QA柱，上樣量為2~15ml，優選上樣量為2~ 10ml。每毫升Monolith-QA柱，上料速度為：1~4ml/min。
[0016] 根據本發明的具體實施方案，本發明的去除重組漢遜酵母乙肝抗原樣品中宿主細 胞殘留DNA的方法，步驟b中，還可包括將收集穿透峰得到去除宿主細胞殘留DNA的重組漢遜 酵母乙肝表面抗原樣品中的緩沖液置換為原緩沖液（即待去除宿主細胞殘留DNA的重組漢 遜酵母乙肝抗原樣品料液中的緩沖液，通常為濃度約5.0~6.5mM的低濃度磷酸鹽緩沖液） 的過程。該過程也可以采用蛋白純化領域中任何可行的辦法，例如，可采用超濾等技術進 行。
[0017] 根據本發明的具體實施方案，本發明的去除重組漢遜酵母乙肝抗原樣品中宿主細 胞殘留DNA的方法，還可包括以步驟b所得到的去除宿主細胞殘留DNA的重組漢遜酵母乙肝 表面抗原樣品制備疫苗的過程。所述以步驟b所得到的去除宿主細胞殘留DNA的重組漢遜酵 母乙肝表面抗原樣品制備疫苗的過程可以參照所屬領域的現有技術進行。本發明中，能有 效去除重組漢遜酵母乙肝抗原樣品中宿主細胞殘留DNA，可使所制得疫苗滿足國家藥典三 部(2010版）中對其中殘留DNA含量的規定。
[0018] 根據本發明的具體實施方案，本發明的去除重組漢遜酵母乙肝抗原樣品中宿主細 胞殘留DNA的方法，還可包括在步驟b后對使用過的Monoliths QA陰離子交換柱進行洗脫和 介質再生的過程，其中：
[0019] 洗脫液優選為含1.9~2.1M NaCl的10~30mM PB溶液（同樣的，優選所述PB溶液的 pH值為7.0~7.4)，洗脫流速為每ml Monolith-QA為1~4ml/min，洗脫8~12個柱床體積；
[0020] 再生過程優選為:先用1M NaOH溶液，以lml/min流速再生1~2h;再用30%異丙醇， 以lml/min流速再生1~2h;之后用注射用水，以每ml Monolith-QA 1~4ml/min的流速沖洗 lh;接著用20%乙醇，以每ml Monolith-QA 1~4ml/min的流速沖洗（乙醇的沖洗時間保證 QA柱沖洗完全即可，通常為20min~30min)。
[0021] 在本發明的一些具體實施方案中，本發明用奧地利BIA Seperation公司生產的 CIM' Monoliths層析柱（其具有強陰離子交換介質一季胺基-聚甲基丙稀酸酯整體介質 (Monolith-QA))實施了本發明的去除重組漢遜酵母乙肝抗原樣品中宿主細胞殘留DNA的方 法。相關試驗結果顯示：當乙型肝炎疫苗關鍵有效成分乙型肝炎表面抗原(HBsAg)溶于含特 定濃度NaCl的PB溶液中，采用穿透模式上樣(料)時，漢遜酵母宿主細胞殘留的游離DNA能夠 吸附在Monolith-QA柱上，而HBsAg不與QA柱結合而流穿出來；在80ml QA柱以800ml HBsAg 精制純化樣品（料液)上樣(料）后，不僅1 〇yg HBsAg中DNA含量小于1 Ong，而且20yg HBsAg中 DNA含量也小于10ng，可分別滿足制備10yg和20yg HBsAg劑量重組漢遜酵母乙肝疫苗的要 求。本發明的技術方案能夠有效解決重組漢遜酵母乙肝疫苗宿主細胞殘留DNA高于國家藥 典規定上限的問題，對去除高HBsAg劑量(高于20yg)重組酵母乙肝疫苗中的宿主細胞殘留 DNA也提供了解決方案及借鑒。
【附圖說明】
[0022] 圖l:HBsAg樣品在不同NaCl濃度條件上樣的層析圖（lml Monolith-QA柱）。
[0023] 圖2:8ml Monolith-QA柱 16ml HBsAg樣品上樣層析圖。
[0024] 圖3:8ml Monolith-QA柱24ml HBsAg樣品上樣層析圖。
[0025] 圖4:8ml Monol ith-QA柱 120ml HBsAg樣品上樣層析圖。
【具體實施方式】
[0026] 下面將結合實施例對本發明的實施方案進行詳細描述，但是本領域技術人員將會 理解，下列實施例僅用于說明本發明，而不應視為限定本發明的范圍。下列各實施例中未注 明具體條件的操作方法，按照常規條件或按照儀器制造廠商所建議的條件進行。
[0027] 各實施例中所用試劑材料設備和基本方法：
[0028] 1.1試劑和材料
[0029] (1 )Butyl_4B疏水層析精制純化后的HBsAg料液樣品
[0030]由北京天壇生物制品股份有限公司（天壇生物）疫苗研究二室提供，HBsAg純度大 于99%，邢348濃度為200~60(^8/1111，0嫩濃度為180-10001^/1111，每1(^8邢848中的0嫩含量 約為10~50ng。
[0031] (2)CIM_Monoliths QA陰離子交換柱
[0032] 為奧地利公司BIA Separation產品，規格分別為lml、8ml、80ml。
[0033] 1.2主要儀器和設備
[0034] AlCTAPurifier 100型純化系統，購自美國GE公司，用于小量介質（lml、8ml)試 驗，操作按照說明書進行。
[0035] 1.3上柱料液的制備
[0036] 通過購自德國賽多利斯公司的超濾裝置100KD Vivaflow 50,將含有HBsAg料液樣 品中的緩沖液置換為含特定濃度NaCl的PB溶液，置換流速為50ml/min，從而制備得到上柱 料液(上樣液）。
[0037] 1.4層析過程
[0038] 1.4.1Monolith-QA 介質平衡：
[0039]以與上樣液中緩沖液相同的含特定濃度NaCl的1?溶液平衡CM-Monoliths QA介 質，依Monolith-QA柱規格設定流速（lml Monol ith-QA為4ml/min; 8ml Monol ith-QA為 lOml/min; 80ml Monolith-QA, 80ml/min)，緩沖液總量大于10個柱床體積，且基線為直線， 即可上料(樣）。
[0040] 1.4.2上料(樣）：
[0041 ] 將上柱料液(上樣液），栗入(ΠΜ-Monoliths QA柱，依Monolith-QA柱規格設定流速 (lml Monolith-QA為4ml/min;8ml Monolith-QA為10ml/min;80ml Monolith-QA,80ml/ min);待起峰時開始收集穿透峰料液(樣品）。
[0042] 1.4.3流洗：
[0043]上料(樣)結束后，繼續以與上樣液中緩沖液相同的含特定濃度NaCl的PB溶液流洗 CIM-Mono 1 iths，依Monol ith-QA柱規格設定流速（lml Mono 1 ith-QA為4ml/min ; 8ml Monol ith-QA為lOml/min; 80ml Monol ith-QA，80ml/min)，直至穿透峰結束，結束收集，回歸 基線后方可進行介質洗脫和再生;測量穿透峰料液(樣品)體積。
[0044] 1.4.4洗脫和介質再生：
[0045] 用含 2M NaCl 的20mM ΡΒ(ρΗ7· 2)，依Monol ith-QA 柱規格設定流速（lml Monol ith- QA 為4ml/min;8ml Monol ith-QA 為 10ml/min; 80ml Monol ith-QA ， 80ml/min) ， 洗脫 10 個柱床 體積；用謂他0!1以11111/1^11流速再生1-211;用30%異丙醇以11111/1^11流速再生1-211 ;用注射 用水，依Monol ith-QA柱規格設定流速（lml Monol ith-QA為4ml/min; 8ml Monol ith-QA為 lOml/min; 80ml Monol ith-QA，80ml/min)沖洗lhr;最后用20% 乙醇，依Monol ith-QA 柱規格 設定流速（lml Monolith-QA為4ml/min;8ml Monolith-QA為10ml/min;80ml Monolith-QA, 80ml/min)沖洗約20分鐘后并保存。
[0046] 1.5樣品檢測
[0047] 1 ·5· lHBsAg含量檢測（Lowry法）
[0048]蛋白質在堿性溶液中可形成銅-蛋白質復合物，此復合物加入酚試劑后，產生藍色 化合物，該藍色化合物在650nm處的吸光度與蛋白質含量成正比，根據供試品的吸光度，計 算供試品的蛋白質含量。
[0049] (1)加空白（去離子水）、標準品（14、29、30、43、58、72和86以8/1111)及已經稀釋過后 的樣品各lml于試管中；
[0050] (2)各試管中各加 C液5ml，混勻室溫放置lOmin;
[0051 ] (3)各試管各加 D液0.5ml，充分混勾，室溫放置30min顯色；
[0052] (4)測定各管液體在560nm的吸光度值。
[0053] 1.5.2DNA 檢測方法(Picogreen 熒光法）
[0054] (1 )DNA標準品配制：以TE緩沖液為溶劑精確配制10μg/ml的小牛胸腺嘧啶DNA溶液 作為標準品母液，先用TE緩沖液稀釋至100ng/ml，然后連續稀釋8個稀釋度，具體如下:①10 倍稀釋至1〇〇〇1^/1111;@12.5倍稀釋至8〇1^/1111;@2倍稀釋至4〇1^/1111 ;標準品@-@均為上 一個樣品的2倍稀釋;標準品②-⑨DNA濃度分別為：80ng/ml、40ng/ml、20ng/ml、10ng/ml、 5ng/ml、2 · 5ng/ml、1 · 25ng/ml和0 · 625ng/ml，共8個稀釋度的標準品樣品；
[0055] (2)料液樣品準備:準備待檢測樣品的原倍樣品、10倍稀釋樣品及100倍稀釋樣品， 為供試品；
[0056] (3)熒光染料配制:TE緩沖液1:200稀釋，取所需量的PicoGreen染料溶于20ml溶于 TE緩沖液中；
[0057] (4)空白、供試品和熒光染料等體積混合:精密量取標準品樣品、供試品樣品溶液 各500μ1于1.5ml EP管中，分別加入新配置的熒光染料500μ1，混勻后，避光室溫反應5min;
[0058] (5)酶標板加樣:取上述標準品和供試品樣品反應液250μ1加入酶標板，各做3個復 孔；
[0059] (6)檢測:激發波長480nm，發射波長520nm，ΤΕ緩沖液為空白對照，測得熒光強度為 本底；
[0060] (7)計算：以標準品溶液的濃度對其熒光強度做直線回歸，求直線方程，將供試品 樣品的熒光強度帶入直線方程，求出樣品中的DNA含量。
[0061 ] 1.5.3計算：
[0062]
[0063]
[0064]
[0065] 實施例1
[0066] 采用100KD Vivaflow 50超濾裝置，將20121010批經Butyl-4B疏水層析精制純化 后的冊848料液樣品以液體置換方式溶于分別含300、400、500和60011^似(：1的2011^?8 (PH7.2)中，作為上樣液；
[0067] lml規格的Monolith-QA柱，依次分別以含300、400、500和600mM NaCl的20mM PB做 為上樣緩沖液，以含2M NaCl的20mM PB(pH7.2)作為洗脫緩沖液，上樣量為5ml。分別收集穿 透峰和洗脫峰樣品，檢測穿透峰和洗脫峰中的DNA水平和HBsAg水平。
[0068] HBsAg樣品在不同NaCl濃度條件上樣的層析圖（lml Monolith-QA柱)參見圖1。 [0069] HBsAg樣品在不同NaCl濃度條件上樣的層析（1ml Monolith-QA柱)實驗結果參見 表1。
[0070] 表1、HBsAg樣品在不同NaCl濃度條件上樣的層析實驗結果
[0071]
[0072] Λ: 20101010: HBsAg濃度：423 · 42μg/ml ;DNA濃度：753 · 25ng/ml
[0073] /:無法計算，無效值
[0074] 從表1中的實驗結果可以看出，當NaCl濃度為400~500mM時，穿透峰中的DNA去除 率在90 %以上，且每1 Oyg HBsAg中的DNA含量從〈1 Ong。
[0075] 實施例2
[0076] 取 20100908、20101009、20101010 和 20120605批經 Butyl-4B 疏水層析精制純化后 的HBsAg料液樣品，將樣品采用100KD Vivaflow 50超濾裝置以液體置換方式溶于含500mM NaCl的20mM PB(pH7.2)中作為上樣液，用8ml規格Monolith-QA進行不同上樣量試驗，上樣 量分別采取161111、241111和12〇1111，洗脫緩沖液為含21似(：1的2〇1111?8(?!17.2)，收集穿透峰溶 液并測量其體積，檢測穿透峰HBsAg濃度和DNA濃度。評價穿透峰中DNA水平及HBsAg收率和 DNA去除率。
[0077] (i)i6ml 上樣量
[0078] 16ml上樣量的實驗結果參見圖2和表2。
[0079] 表2、8ml Monolith-QA柱 16ml HBsAg樣品上樣層析結果
[0080]
[0081J 從圖2和表2結果可以看出，當使用8ml Monolith-QA柱，將HBsAg浴于含500mM NaCl的20mM PB(pH7.2)中在QA柱上16ml進行上樣，穿透峰中HBsAg的收率約為89.3~ 95.2%之間，穿透峰中每10yg HBsAg中的DNA約為1.0~4. lng，每20yg HBsAg中的DNA約為 2·0~8·2ng0
[0082] (2)24ml 上樣量
[0083] 24ml上樣量的實驗結果參見圖3和表3。
[0084] 表3、8ml Monolith-QA柱24ml樣品上樣層析結果
[0086] 從圖3和表3結果可以看出，當使用8ml Monolith-QA柱，將24ml溶于含500mM NaCl 的20mM PB(pH7.2)中HBsAg精制樣品上樣至QA柱，穿透峰中HBsAg的收率約為93.6-99.3% 之間，穿透峰中每lOyg HBsAg中的DNA約為2 · 7~3 · 2ng，每20yg HBsAg中的DNA約為5 · 4~ 6·4ng〇
[0087] (3) 120ml 上樣量
[0088] 120ml上樣量的實驗結果參見圖4和表4。
[0089] 表4、8ml Monolith-QA柱 120ml HBsAg樣品上樣層析結果
[0090]
[0091] 從圖4和表4結果可以看出，用8ml Monolith-QA柱，將120ml溶于含500mM NaCl的 201^?8(口!17.2)中冊848上樣至]\1〇11〇1丨讓-04柱上，穿透峰中冊848的收率約為95.9~ 99 · 3 %之間，穿透峰中每10yg HBsAg中的DNA約為3 · 9~7 · 9ng，每20yg HBsAg中的DNA約為 7 · 8~15 · 8ng〇
[0092] 綜合表2、表3和表4顯示，上樣量為16ml、24ml、120ml (8ml Monolith-QA柱）時，每 10yg HBsAg中的DNA均低于10ng;上樣量為16ml、24ml時，每20yg HBsAg中的DNA也低于 10ng。當8ml Monolith-QA柱上樣量為120ml時，雖然每10yg HBsAg中的DNA仍低于10ng，但 是已經有一批樣品20100201 (表4，c)上樣后，每20yg HBsAg中的DNA超過1 Ong，為15.8ng。
[0093] 實施例3
[0094] 取20121110、20121111和20121112三批經刖丨71-48疏水層析精制純化后的冊8八 8料液樣品，將采用超濾裝置以液體置換方式溶于含500mM NaCl的20mM 1?溶液(pH7.2)中作 為上樣液，用80ml Monolith-QA柱進行去除游離DNA放大試驗，上料量為800ml。
[0095]洗脫緩沖液為含2M NaCl的20mM PB(pH7.2)，收集穿透峰料液并測量其體積，檢測 穿透峰HBsAg濃度和DNA濃度。評價穿透峰中DNA水平及HBsAg收率和DNA去除率。
[0096] 實驗結果參見表5。
[0097] 表5、80ml QA柱800ml HBsAg料液上柱層析結果
[0098]
[0099] 從表5結果可以看出，用80ml Monolith-QA柱，將800ml溶于含500mM NaCl的20mM PB(pH7.2)中精制純化HBsAg料液上至Monolith-QA柱，穿透峰中HBsAg的收率約為88.8~ 90 · 8%之間，穿透峰中每10yg HBsAg中的DNA約為2 · 5~4· 5ng，每20yg HBsAg中的DNA約為 5.0~9.Ong。可以滿足國家藥典三部(2010版)對重組乙型肝炎疫苗(漢遜酵母)宿主細胞殘 留DNA低于每劑10ng的要求。
【主權項】
1. 一種去除重組漢遜酵母乙肝表面抗原中宿主細胞殘留DNA的方法，該方法包括： 步驟a、將待去除殘留宿主DNA的重組漢遜酵母乙肝表面抗原樣品溶于含400~500mM NaCl的10~30mM PB溶液中； 步驟b、以上述溶有重組漢遜酵母乙肝表面抗原樣品的含NaCl的PB溶液作為上樣液，利 用Monoliths QA陰離子交換柱進行層析純化，得到去除宿主細胞殘留DNA的重組漢遜酵母 乙肝表面抗原樣品。2. 根據權利要求1所述的方法，其中，所述待去除宿主細胞殘留DNA的重組漢遜酵母乙 肝表面抗原樣品為經過Buty 1-4B疏水層析精制純化后的HBsAg料液樣品。3. 根據權利要求1所述的方法，其中，所述待去除宿主細胞殘留DNA的重組漢遜酵母乙 肝表面抗原樣品中，HBsAg純度大于99% ;上樣液中，HBsAg濃度為200~600μg/ml，宿主細胞 殘留DNA濃度為180~1000ng/ml。4. 根據權利要求1所述的方法，其中，所述待宿主細胞殘留DNA的重組漢遜酵母乙肝表 面抗原樣品中，每l〇yg HBsAg中的宿主細胞殘留DNA含量為10~50ng。5. 根據權利要求2所述的方法，其中，步驟a中采用超濾技術將HBsAg料液樣品中的緩沖 液置換為含400~500mM NaCl的10~30mM PB溶液，制備得到上樣液;優選地，所述PB溶液的 pH值為7.0~7.4。6. 根據權利要求1所述的方法，其中，步驟b中采用使宿主細胞殘留DNA結合在 Monolith-QA層析介質上、而HBsAg流穿出去的穿透模式進行層析，收集穿透峰得到去除宿 主細胞殘留DNA的重組漢遜酵母乙肝表面抗原樣品。7. 根據權利要求1所述的方法，其中，每毫升Monolith-QA柱，上樣量為2~15ml，優選上 樣量為2~10ml。8. 根據權利要求1或7所述的方法，其中，每毫升Monolith-QA柱，上料速度為：1~4ml/ min〇9. 根據權利要求1所述的方法，該方法還包括： 在利用Monoliths QA陰離子交換柱進行層析純化前，采用含400~500mM NaCl的10~ 30mM 1?溶液對Monoliths QA陰離子交換柱進行平衡的過程;優選地，所述PB溶液的pH值為 7.0~7.4〇10. 根據權利要求1所述的方法，該方法還包括在步驟b后對使用過的Mono 1 iths QA陰 離子交換柱進行洗脫和介質再生的過程，其中： 洗脫液為含1.9~2.11似(：1的？!17.0~7.4的10~3〇11^?8溶液，洗脫流速為每1111 Mono 1 i th-QA為1~4ml/min，洗脫8~12個柱床體積； 再生過程為：先用1M NaOH溶液，以lml/min流速再生1~2h;再用30 %異丙醇，以lml/ min流速再生1~2h;之后用注射用水，以每ml Monolith-QAl~4ml/min的流速沖洗lh;接著 用20%乙醇，以每ml Monolith-QAl~4ml/min的流速沖洗。
【文檔編號】C07K1/18GK105837667SQ201610329460
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2016年5月18日
【發明人】楊旭琴, 李彩梅, 張德有, 李津, 楊云凱, 趙鎧, 馬銳, 許寧, 劉英微, 王曦
【申請人】北京天壇生物制品股份有限公司