用于制備疫苗組合物的方法
【專利摘要】一種制備包含一種或多種吸附至氨基酸的抗原的組合物的方法，其中所述方法包括：(i)在中和溶液混合物的情況中混合一種或多種抗原的溶液與氨基酸在含水酸中的溶液，由此形成包含所述一種或多種抗原和所述氨基酸的吸附物；(ii)通過交叉流過濾將所述吸附物分出入期望的緩沖液中，由此形成所述組合物；并(iii)回收所述組合物；其中在無菌環境中且在閉合系統內實施步驟(i)至(iii)。
【專利說明】用于制備疫苗組合物的方法
發明領域
[0001]本發明涉及用于制造無菌組合物的方法，所述無菌組合物包含結合至氨基酸的經修飾的抗原。
[0002]發明背景
[0003]疫苗接種是免疫學原則對人類健康的公知且最成功的應用。為了得到引入和批準，疫苗必須是有效的，并且所有疫苗的效力經常受到審查。有效的疫苗必須:誘導期望的免疫應答；在貯存時是穩定的；并且具有足夠的免疫原性。在非活疫苗的情況中，特別地，經常必需控制施用后的抗原釋放。
[0004]已經顯示了抗原與懸浮氨基酸的結合導致施用后抗原的緩慢釋放，由此通過延長暴露在優化效力的情況中提高安全性。然而，包含此類抗原的配制劑的制造是成問題的，因為抗原吸附至氨基酸生成需要除去的不想要的化學副產物。此外，必須在無菌條件下實施方法。由于終產物是懸浮液，它不能通過過濾來滅菌，且由于活性成分是生物學的，它不能熱滅菌。因而，經常通過在無菌套間內離心制造無菌懸浮液。
[0005]美國專利4，070, 455描述了細碎的酪氨酸微粒，其具有其中分散的經戊二醛處理的變應原。該微粒通過混合酪氨酸在含水強酸中的溶液與經戊二醛處理的豚草花粉的溶液，然后中和所得的溶液來制備。通過離心取出含有經修飾的變應原的酪氨酸微細顆粒。
[0006]EP0988862描述了用于免疫接種的抗原、TH-1誘導性佐劑和水微溶性氨基酸的配制劑。該配制劑如下制備，即在中和溶液混合物的情況中混合抗原和THl誘導性佐劑的溶液與微溶性氨基酸或衍生物在含水強酸中的溶液，由此共沉淀微溶性氨基酸和抗原。將所得的沉淀物通過離心自溶液取出，用新鮮緩沖液重建，并添加佐劑。
[0007]使用離心取出氨基酸/抗原沉淀物需要實質性程度的無菌暴露和對操作員交互(operator interaction)的高度依賴性。本發明解決此問題。
[0008]發明概述
[0009]本發明克服了現有技術的問題，其通過創建使用交叉流過濾分出抗原/氨基酸吸附物的系統實現。該系統改編死端式(dead end)過濾中常規使用的蒸汽可滅菌的燒結不銹鋼濾器，這通過在定制設計的閉合循環回路系統中納入它們來進行。由于添加新的緩沖液以維持體積和規格，這容許抗原/氨基酸吸附物和化學副產物經由濾器取出。
[0010]技術要求基于不能末端滅菌或過濾經修飾的變應原酪氨酸吸附物(MATA)產物而發生，所述產物是不溶性的 ，并且必須在無菌設施中制造。為了確保無菌性，必需開發密閉的原地清洗(CIP)原地蒸汽(SIP)系統。該系統的密閉性質意味著不得不將不溶性MATA成分在配制和緩沖液更換步驟期間在溶液中維持懸浮。為了實現這點，如本文中描述的那樣開發連續交叉流過濾系統。
[0011]由于閉合性質和蒸汽滅菌的能力，有可能在無菌套間外部定位硬件(盡管仍在受控生產區內)。因此，本發明與現有生產方法相比具有獨特的優點。本發明的方法通過具有閉合無菌系統來實質性降低抗原產物對環境的暴露。該方法還降低對物理干預的需要，這使該方法避免錯誤(error)和微生物污染兩者的風險。[0012]依照本發明的第一方面，提供了一種制備包含一種或多種吸附至氨基酸的抗原的組合物的方法，其中所述方法包括:
[0013]⑴在中和溶液混合物的情況中混合一種或多種抗原的溶液與氨基酸在含水酸中的溶液，由此形成包含所述一種或多種抗原和所述氨基酸的吸附物；
[0014](ii)通過交叉流過濾將所述吸附物分出入緩沖液中，由此形成所述組合物；并
[0015](iii)回收所述組合物；
[0016]其中在無菌環境中且在閉合系統內實施步驟⑴至(iii)。
[0017]優選地，氨基酸是微溶性氨基酸。[0018]優選地，氨基酸是酪氨酸、色氨酸或其衍生物。更優選地，氨基酸是酪氨酸。
[0019]優選地，所述一種或多種抗原是用戊二醛修飾的。
[0020]在一個特別優選的實施方案中，所述一種或多種抗原自花粉、螨、霉、細菌或病毒衍生。
[0021]在一個實施方案中，所述方法包括制備組合物，該組合物包含一種或多種用戊二醛修飾且吸附至酪氨酸的花粉抗原，所述方法包括:
[0022](i)用戊二醛修飾一種或多種花粉抗原；
[0023](ii)使用交叉流過濾除去過量的戊二醛以形成經修飾的花粉溶液；
[0024](iii)在中和溶液混合物的情況中混合所述經修飾的花粉溶液與酪氨酸在含水酸中的溶液，由此形成包含所述經修飾的花粉和所述酪氨酸的吸附物；
[0025](iv)通過交叉流過濾將所述吸附物分出入緩沖液中，由此形成所述組合物；并
[0026](V)回收所述組合物；
[0027]其中在無菌環境中且在閉合系統內實施步驟(iii)至(V)。優選地，在EU GMP‘C’級/IS07類環境中實施步驟(iii)至(V)。優選地，在EU GMP ‘B’級/IS05類環境內實施步驟⑴和(ii)。
[0028]在另一個實施方案中，所述方法包括制備組合物，該組合物包含一種或多種用戊二醛修飾且吸附至酪氨酸的花粉抗原，其中所述方法包括:
[0029](i)將所述一種或多種花粉抗原提取到溶液中以形成花粉提取物溶液；
[0030](ii)過濾所述花粉提取物溶液以除去固體；
[0031](iii)實施交叉流過濾，并分離包含所述花粉抗原的保留物；
[0032](iv)用戊二醛修飾所述一種或多種花粉抗原；
[0033](V)使用交叉流過濾除去過量的戊二醛以形成經修飾的花粉溶液；
[0034](vi)無菌過濾所述經修飾的花粉溶液；
[0035](vii)在中和溶液混合物的情況中混合所述經修飾的花粉溶液與酪氨酸在含水酸中的溶液，由此形成包含所述經修飾的花粉和所述酪氨酸的吸附物；
[0036](viii)通過交叉流過濾將所述吸附物分出入緩沖液中，由此形成所述組合物；并
[0037](ix)回收所述組合物；
[0038]其中在無菌環境中且在閉合系統內實施步驟(vii)至(ix)。優選地，在EU GMP‘C’級/IS07類環境中實施步驟(vii)至(ix)。優選地，在EU GMP ‘B’級/IS05類環境內實施步驟⑴和(vi)。
[0039]花粉抗原可以是但不限于剪股穎(Bent)花粉、狐尾草(Foxtail)花粉、黃花茅(Sweet vernal)花粉、三毛草(False oat)花粉、雀麥(Brome)花粉、洋狗尾草(Cresteddogstail)花粉、鴨茅(Cocksfoot)花粉、羊茅(Fescue)花粉、絨毛草(Yorkshire fog)花粉、麥草(Rye grass)花粉、梯牧草(Timothy)花粉、草甸(Meadow)花粉和栽培黑麥(Cultivated rye)花粉。
[0040]優選地，所述一種或多種抗原由剪股穎花粉、狐尾草花粉、黃花茅花粉、三毛草花粉、雀麥花粉、洋狗尾草花粉、鴨茅花粉、羊茅花粉、絨毛草花粉、麥草花粉、梯牧草花粉、草甸花粉和栽培黑麥花粉組成。
[0041 ] 優選地，使用0.2 μ m孔徑濾器過濾花粉提取物溶液；
[0042]換言之，優選地，組合物包含下組中的所有花粉，所述組由剪股穎花粉、狐尾草花粉、黃花茅花粉、三毛草花粉、雀麥花粉、洋狗尾草花粉、鴨茅花粉、羊茅花粉、絨毛草花粉、麥草花粉、梯牧草花粉、草甸花粉和栽培黑麥花粉組成。
[0043]優選地，將花粉于約2至約8°C，更優選地，約5°C提取到酚緩沖鹽水溶液，優選為PH6.5(優選地，其含有氯化鈉、磷酸二氫鉀、十二水合磷酸二鈉、80%w/w液化酚和注射用水(WFI))中。
[0044]優選地，將提取實施約12-30小時，更優選地約14至約24小時，仍更優選約18小時。
[0045]優選地，使用5-10kDa分子量截留的膜實施如本文中描述的用于分離保留物和/或除去過量戊二醛的交叉流過濾。更優選地，膜具有IOkDa分子量截留。
[0046]優選地，使用多燒結不銹鋼濾器，更優選5μπι多燒結不銹鋼濾器，優選用1.1-1.3巴的壓力實施用于分出吸附物的交叉流過濾。
[0047]通過在中和混合物(優選用NaOH進行)的情況中混合抗原與強酸，優選無機酸，優選氫氯酸(HCl)中的氨基酸形成包含抗原和氨基酸的吸附物。中和意指將pH調節至范圍
6.5至7.5，優選6.8至7.2內的數值。期望的是，在中和期間pH無時離開平衡或至少不長時間離開平衡，即移到PH范圍6.5至7.5外部或更優選pH范圍6.8至7.2外部。
[0048]優選地，強酸是具有約3.5M至約4.5M，優選約3.8M的摩爾濃度的HCl。優選地，NaOH具有約3至約3.5，優選約3.2M的摩爾濃度。
[0049]優選地,組合物是疫苗組合物。
[0050]在一個優選的實施方案中，組合物用作疫苗，并且抗原是可用于此類疫苗的抗原。
[0051]在多個實施方案中，可以將佐劑添加至組合物，諸如MPL、3-DMPL或其衍生物或鹽。
[0052]依照本發明的另一個方面，提供了通過本發明的方法制備的組合物。
[0053]發明詳述
[0054]本發明的多個優選特征和實施方案現在會作為非限制性例子描述。
[0055]除非另有指示，本發明的實踐會采用化學、分子生物學、微生物學、重組DNA和免疫學的常規技術，其在本領域普通技術人員的能力內。此類技術在文獻中解釋。參見例如 J.Sambrook, E.F.Fritsch, and T.Maniatis, 1989, Molecular Cloning:A LaboratoryManual,第二版，Booksl-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, F.M.等(1995 和定期增刊;Current Protocols in Molecular Biology,第 9 章，第 13 章，和第 16 章，John ffiley&Sons, New York, N.Y.) ;B.Roe, J.Crabtree, and A.Kahn, 1996, DNAIsolation and Sequencing:Essential Techniques, John Wiley&Sons;J.M.Polak andJames 0’ D.McGee，1990，In Situ Hybridization:Principles and Practice;OxfordUniversity Press;M.J.Gait (編)，1984，Oligonucleotide Synthesis:A PracticalApproach, Irl Press;D.M.J.Lilley and J.E.Dahlbergj 1992,Methods ofEnzymology:DNA Structure Part A:Synthesis and Physical Analysis of DNA Methodsin Enzymologyj Academic Press;及 Ε.Μ.Shevach and W.Stroberj 1992 及定期增干丨J，Current Protocols in Immunology, John Wiley&Sons, New York，NY。通過提及將這些通用教科書之每篇收入本文。
[0056]抗原
[0057]術語“抗原”用于指免疫應答的適應性(adaptive)元件(即B細胞或T細胞或兩者)可以特異性識別的任何分子。
[0058]優選地，本發明中使用的抗原是免疫原，即活化免疫細胞以產生針對自身的免疫應答的抗原。
[0059]抗原可以通過重組手段或肽合成獲得，或者獲自天然來源或提取物，并且可以自任何活的或非活的生物體衍生。
[0060]抗原可以自細菌衍生，所述細菌諸如例如炭疽(anthrax)、彎曲桿菌(campylobacter)、霍亂(cholera)、白喉(diphtheria)、產腸毒素性大腸桿菌(E.coli)、賈第蟲(giardia)、淋球菌(gonococcus)、幽門螺桿菌(Helicobacter pylori)、乙型流感嗜血菌(Hemophilus influenza B)、不可定型的流感嗜血菌、腦膜炎球菌(meningococcus)、百日咳(pertussis)、肺炎球菌(pneumococcus)、沙門氏菌(salmonella)、志賀氏菌(shigella)、鏈球菌B、A組鏈球菌、破傷風(tetanus)、霍亂弧菌(Vibrio cholerae)、耶爾森氏菌(yersinia)、葡萄`球菌(Staphylococcus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)物種和梭菌屬(Clostridia)物種。
[0061]或者，抗原可以自病毒衍生，所述病毒諸如例如腺病毒、登革熱I至4血清型、埃博拉病毒(ebola) (Jahrling 等，Arch Virol Suppl，11:135-140，1996)、腸道病毒、肝炎 A 至 E 血清型(Blum，Digestion56:85-95，1995;Katkov, Med ClinNorth Am80:189-200,1996;Lieberman and Greenberg, Adv Pediatr InfectDisll:333-363, 1996;Mast 等，Annu Rev Med47:257-266，1996)、單純皰疹病毒 I 或 2、人免疫缺陷病毒(D^rez等，Vaccinel4:375-382，1996)、流感、日本馬腦炎、麻疹、諾沃克(Norwalk)、乳頭瘤病毒、細小病毒B19、脊髓灰質炎、狂犬病、輪狀病毒、風疹(rubella)、麻疹(rubeola)、痘苗、含有編碼其它抗原諸如瘧疾抗原的基因的痘苗構建體、水痘(varicella)、和黃熱病(yellow fever)。寄生物包括例如:溶組織內阿米巴(Entamoebahistolytica) (Zhang 等，Infect Immun63:1349-1355);癥原蟲(Plasmodium) (Bathurst等，Vaccinell:449-456，1993)、弓形體病(Toxoplasmosis)、和螺蟲(Helminth)。
[0062]在一個優選的實施方案中，抗原是變應原。術語“變應原”用于描述引發不想要的免疫超敏感性或變應性反應的抗原。變態反應是對環境抗原(變應原)的超敏感性應答。
[0063]本發明中使用的變應原可以自任何引起變態反應的物質衍生，所述物質諸如但不限于:花粉(例如剪股穎花粉、狐尾草花粉、黃花茅花粉、三毛草花粉、雀麥花粉、洋狗尾草花粉、鴨茅花粉、羊茅花粉、絨毛草花粉、麥草花粉、梯牧草花粉、草甸花粉和栽培黑麥花粉、豚草花粉、北艾(Mugwort)花粉、樺樹(Birch)花粉、棺木(Alder)花粉、榛樹(Hazel)花粉、橄欖樹(Olive)花粉、墻草(Pariateria)花粉、槭樹(Maple)(柊葉槭(Acer negundo))花粉、柏樹(Cypress)花粉和日本雪松(Japanese Cedar)(日本柳杉(Cryptomeria japonica))花粉、食物、昆蟲毒液、霉和動物衍生材料諸如動物軟毛或螨諸如房塵螨(例如粉塵螨(D.farinae)或屋塵螨(D.pteronyssinus)或熱帶無爪螨(Blomia tropicalis))。
[0064]優選地，本發明中使用的抗原是花粉抗原。優選地，花粉抗原是剪股穎花粉、狐尾草花粉、黃花茅花粉、三毛草花粉、雀麥花粉、洋狗尾草花粉、鴨茅花粉、羊茅花粉、絨毛草花粉、麥草花粉、梯牧草花粉、草甸花粉和栽培黑麥花粉。
[0065]抗原可以通過與在幫助避免不想要的不利效應的情況中保留或增強抗原的期望的免疫原性特性的已知物質(例如但不限于甲醛或戊二醛，優選戊二醛)的反應來化學修飾。
[0066]氨基酸
[0067]優選地，本發明中使用的氨基酸于25°C具有約1.1或更小的g/100ml H2O的水溶解度。特別優選的氨基酸是酪氨酸或色氨酸；更加不溶的酪氨酸是優選的。這些氨基酸的藥學可接受衍生物也包括在本發明的范圍內，諸如苯甲基-O-十八烷酰基-L-酪氨酸。
[0068]制備
[0069]如下制備本發明的組合物，即混合抗原的水溶液與氨基酸在含水強酸中的溶液，并中和溶液混合物，由此共沉淀氨基酸和抗原。
[0070]通常，將抗原的水性溶液(優選為pH6.3至7.2)與氨基酸在含水強酸中的溶液混合。強酸通常是無機酸，優選是氫氯酸。此步驟中使用的抗原溶液通常含有多至0.15g/ml抗原蛋白質。在一個實施方案中，使用的氨基酸溶液是約24%w/v。
[0071]將抗原和氨基酸的溶液的所得混合物中和。期望的是，在中和期間溶液的pH無時偏離平衡或至少不長時間偏離平衡。若想要的話，此條件可以通過有力攪拌溶液并通過僅使用需要量的堿滿足。有用地，可以將各種緩沖劑諸如緩沖鹽水溶液添加至抗原溶液以幫助混合和中和階段期間的pH控制。
[0072]實施中和的特別有用的方法分開要流入抗原溶液中的氨基酸和中和性堿溶液的流。添加的溶液的流速受到PH狀態，即受到設備控制，所述設備調節一種或兩種溶液的流動，使得反應混合物的PH在預先確定的水平保持基本上恒定。我們已經發現了最佳結果通常通過范圍6.5至7.5，優選6.8至7.2內的pH控制獲得，盡管精確的pH可以隨抗原的性質而變化。
[0073]中和的結果是氨基酸的立即沉淀，在所述氨基酸之內和/或之上吸留和/或吸附抗原溶液。
[0074]交叉流過濾
[0075]可用于分級各種顆粒的方法是交叉流過濾或切向流過濾(TFF)。交叉流過濾是一種使用膜以基于大小或分子量差異來分出液體溶液或懸浮液中的組分的分離方法。在交叉流過濾中，將要過濾的溶液或懸浮液以交叉流模式通過膜表面。過濾的驅動力是跨膜壓。濾液通過膜表面的速度也控制過濾速率，并且幫助防止膜堵塞。由于交叉流過濾使保留物再循環通過膜表面，使膜阻塞最小化，維持高過濾速率，并且增強產物回收。
[0076]交叉流過濾裝置一般包含泵、進料溶液貯器、過濾模塊和用于連接這些元件的導管。使用中，將進料溶液從進料溶液貯器引導至過濾模塊，此時將來自過濾模塊的保留物從過濾模塊再循環到進料溶液貯器，直到獲得期望體積的保留物。
[0077]優選地，維持1.1至1.3巴的壓力使用5μπι孔徑多燒結不銹鋼濾器實施本發明中用于分出包含經修飾的抗原和氨基酸的吸附物的交叉流過濾。
[0078]閉合系統
[0079]閉合系統是一種分離的系統，其防止組合物暴露于系統外部的環境。組合物僅暴露于構成閉合系統的管道和機器組件的緊接環境。本發明的閉合系統防止組合物的污染。它通過確保組合物相對于系統外部的環境密封，防止污染物進入該系統來實現這點。
[0080]佐劑
[0081]可以將佐劑添加至通過本發明的方法生成的組合物。優選地，佐劑是THl誘導性佐劑。THl誘導性佐劑是增強針對抗原的THl應答的佐劑。
[0082]可以通過測定針對抗原的抗體的概況(profile)測定佐劑作為THl誘導性佐劑的有效性，所述抗體源自施用也包含各種佐劑的疫苗中的此抗原。
[0083]優選地，佐劑是經修飾的脂多糖。如美國專利N0.4，912，094中描述的，腸細菌脂多糖(LPS)是一種有力的免疫刺激物。然而，它也能引發有害的且有時致命的應答。現在已知與LPS有關的內毒素活性源自其脂質A組分。因而，更優選地，本發明使用脂質A的脫毒衍生物。Ribi ImmunoChem生產一種最初稱為精制脫毒內毒素(RDE),但是已經被稱為單磷酰脂質A(MPL)的脂質A衍生物。如美國專利No，4，912，094中描述的，MPL通過在中等強度礦物酸溶液(例如0.1N HCl)中將自革蘭氏陰性細菌(例如沙門氏菌)的無庚糖突變體獲得的LPS或脂質A回流30分鐘左右的時段來生成。此處理導致還原性末端葡糖胺的位置I處的磷酸模塊的喪失。另外，在此處理期間從非還原性葡糖胺的6’位置除去核心碳水化合物。
[0084]然而，優選地，使用經修飾的LPS或脂質A，其中脫毒脂質A保留附著于非還原性葡糖胺的6’位置的核心模塊。LPS和脂質A的此類衍生物也記載于美國專利N0.4，912，094。更詳細地，美國專利4，912，094披露了一種經修飾的脂多糖，其通過僅選擇性除去脂多糖中與所述脂多糖的位置3’處的還原性末端葡糖胺酯連接的β_羥基肉豆蘧酰基殘基的方法獲得，所述方法包括使所述脂多糖進行堿水解。可以在本發明中使用此類脫-O-酰化單磷酰脂質A (MPL)、二磷酰脂質A (DPL)和LPS。如此，在一個優選的實施方案中，本發明使用MPL、DPL或LPS，其中還原性末端葡糖胺的位置3’是脫_0_酰化的。這些化合物分別稱為3-DMPL、3-DDPL 和 3-DLPS。
[0085]在美國專利4，987，237中，描述了具有下式的MPL衍生物:
[0086]
【權利要求】
1.一種制備包含一種或多種吸附至氨基酸的抗原的組合物的方法，其中所述方法包括: (i)在中和溶液混合物的情況中混合一種或多種抗原的溶液與氨基酸在含水酸中的溶液，由此形成包含所述一種或多種抗原和所述氨基酸的吸附物； (?)通過交叉流過濾將所述吸附物分出入緩沖液中，由此形成所述組合物；并 (iii)回收所述組合物； 其中在無菌環境中且在閉合系統內實施步驟(i)至(iii)。
2.依照權利要求1的方法，其中所述氨基酸是酪氨酸。
3.依照權利要求1或2的方法，其中所述一種或多種抗原是用戊二醛修飾的。
4.依照任一前述權利要求的方法，其中所述一種或多種抗原是自花粉衍生的。
5.依照權利要求1的方法，其包括制備包含一種或多種用戊二醛修飾且吸附至酪氨酸的花粉抗原的組合物，其中所述方法包括: (i)用戊二醛修飾所述一種或多種花粉抗原； (?)使用交叉流過濾除去過量的戊二醛以形成經修飾的花粉溶液； (iii)在中和溶液混合物的情況中混合所述經修飾的花粉溶液與酪氨酸在含水酸中的溶液，由此形成包含所述經修飾的花粉和所述酪氨酸的吸附物；` (iv)通過交叉流過濾將所述吸附物分出入緩沖液中，由此形成所述組合物；并 (V)回收所述組合物； 其中在無菌環境中且在閉合系統內實施步驟(iii)至(V)。
6.依照權利要求1的方法，其包括制備包含一種或多種用戊二醛修飾且吸附至酪氨酸的花粉抗原的組合物，其中所述方法包括: (i)將所述一種或多種花粉抗原提取到溶液中以形成花粉提取物溶液； (?)過濾所述花粉提取物溶液以除去固體； (iii)實施交叉流過濾，并分離包含所述花粉抗原的保留物； (iv)用戊二醛修飾所述一種或多種花粉抗原； (v)使用交叉流過濾除去過量的戊二醛以形成經修飾的花粉溶液； (vi)無菌過濾所述經修飾的花粉溶液； (vii)在中和溶液混合物的情況中混合所述經修飾的花粉溶液與酪氨酸在含水酸中的溶液，由此形成包含所述經修飾的花粉和所述酪氨酸的吸附物； (viii)通過交叉流過濾將所述吸附物分出入緩沖液中，由此形成所述組合物；并 (ix)回收所述組合物； 其中在無菌環境中且在閉合系統內實施步驟(vii)至(ix)。
7.依照任一前述權利要求的方法，其中所述組合物包含下述花粉抗原:剪股穎(Bent)花粉、狐尾草(Foxtail)花粉、黃花茅(Sweet vernal)花粉、三毛草(False oat)花粉、雀麥(Brome)花粉、洋狗尾草(Crested dogstail)花粉、鴨茅(Cocksfoot)花粉、羊茅(Fescue)花粉、絨毛草(Yorkshire fog)花粉、麥草(Rye grass)花粉、梯牧草(Timothy)花粉、草甸(Meadow)花粉和栽培黑麥(Cultivated rye)花粉。
8.依照權利要求6或7的方法，其中使用酚緩沖溶液于約2至約8°C實施提取步驟(i)達約18小時。
9.依照權利要求5至8中任一項的方法，其中使用具有5至IOkDa分子量截留的膜實施使用交叉流過濾除去過量的戊二醛。
10.依照任一前述權利要求的方法，其中使用多燒結不銹鋼濾器實施使用交叉流過濾分出包含所述抗原和所述氨基酸的吸附物。
11.依照權利要求10的方法，其中所述多燒結不銹鋼濾器是5μπι孔徑濾器。
12.依照任一前述權利要求的方法，其中通過在用摩爾濃度約3.2Μ的的NaOH中和混合物的情況中混合所述抗原與摩爾濃度約3.8Μ的HCl中的氨基酸形成包含所述抗原和所述氨基酸的吸附物。
13.依照任一前述權利要求的方法，其中將所述組合物稀釋至期望的濃度以供胃腸外(parental)使用。
14.依照任一前述權利要求的方法，其中將佐劑添加至所述組合物。
15.依照權利要求14的方法，其中所述佐劑是MPL、3-DMPL或其衍生物或鹽。
16.通過任一前述權利要求的方法制備的組合物。
【文檔編號】A61K39/00GK103608034SQ201280030190
【公開日】2014年2月26日 申請日期:2012年4月20日 優先權日:2011年4月21日
【發明者】M.斯金納, S.休英斯, D.帕克, R.波倫 申請人:過敏療法（英國）有限責任公司