專利名稱：一種耐熱型家畜用疫苗的制備方法
技術領域：
本發明涉及一種疫苗的制備方法，尤其是涉及一種耐熱型家畜用疫苗的制備方法。
背景技術：
偽狂犬病毒G^seudorabies Virus, PRV)是一種a_皰疹病毒，可引起多種家畜和野生動物的偽狂犬病。除豬以外的其它動物表現為致死性感染，豬是PRV的天然宿主和貯存宿主，呈流行性感染。成年豬常常表現為隱性感染和呼吸道癥狀，母豬流產、產死胎和木乃伊胎，公豬表現為睪丸炎。仔豬表現出發熱、昏迷和神經癥狀，死亡率很高。因此，偽狂犬病是養豬業的一種重要繁殖障礙性傳染病。PRRS可引起豬群多系統病癥，繁殖母豬感染可導致流產、早產、死胎、木乃伊胎等嚴重的繁殖障礙，死胎率可達20% 60% ；初生及斷乳前仔豬呼吸困難及高死亡率(可高達80%)；仔豬發生呼吸系統疾病，并易繼發細菌或病毒感染如豬偽狂犬病毒(PRV)、豬流感病毒(CPN)、豬圓環病毒2型(PCV 2)、豬呼吸道冠狀病毒、胸膜肺炎放線桿菌(APP)、豬鏈球菌(SS)、多發性巴氏桿菌((PM)、副豬嗜血桿菌(HP >等，死亡率增加，生長緩慢；育肥豬感染多數發病較為溫和，但可造成飼料報酬降低，生產性能下降；公豬感染可造成精液品質下降；豬只一旦感染PRRSV，常可導致長期的病毒血癥/持續感染而不斷向外排毒，引起本病在豬群中反復爆發而難以根除。目前PRRS已遍及全球主要養豬國家與地區，給養豬業帶來慘重的經濟損失。PRRS目前已成為危害養豬業最嚴重的豬傳染病之一。OIE及我國已將該病列為B類/乙類/ 二類傳染病” (List B disease)。目前，弱毒活疫苗是預防畜禽傳染病的主要疫苗之一，在我國動物用疫苗中，活疫苗占相當大的比例。國內疫苗企業常用的保護劑主要是蔗糖、牛奶、明膠等，組方簡單，保護性能差。如果在2°C 8°C條件下，保存期只有3 6個月，多需要在-15°C以下保存。而國內傳統的動物用疫苗保護劑的研制相對滯后，使疫苗的長期保存和長途運輸受到很大限制，加上基層防疫部門缺乏必要的冷凍和冷藏設施，容易因免疫失敗而造成疫病流行。所以，耐熱保護劑的研究非常急需，發達國家在二十世紀八十年代就已開始進行耐熱保護劑的研究，目前已經基本采用耐熱凍干保護劑生產凍干疫苗，但由于保護劑的研究和應用屬于專利資料，處于保密狀況中。當前，進入中國市場的偽狂犬疫苗均是采用耐熱保護劑冷凍的而成，存放溫度在 2 8°C，存放時間甚至長達30個月，很好的保證了疫苗的使用效果。而我國的偽狂犬活疫苗存放溫度仍然是_15°C，進口疫苗對國產疫苗造成了巨大的市場沖擊，影響國內生物制品企業的發展。技術的落后也限制了國產疫苗海外市場的拓展，因此，耐熱型疫苗的研發勢在必行。

發明內容
本發明的目的就是為了克服上述現有技術存在的缺陷而提供一種操作簡單，可以
3在2 8°C條件下保存，疫苗效價較好的耐熱型家畜用疫苗的制備方法。本發明的目的可以通過以下技術方案來實現一種耐熱型家畜用疫苗的制備方法，其特征在于，該方法包括以下步驟(1)按照以下組分及含量(Wt % )準備耐熱保護劑原料
明膠1 --3，
蔗糖6 ^-8，
牛血清白蛋白1 --3，
胰蛋白胨2 --3，
EDTA1 --3，
谷氨酸單鈉1 --3，
磷酸氫二鉀1 --2，磷酸二氫鉀0.5 0.6，雙蒸水余量；(2)將明膠、蔗糖、EDTA、胰蛋白胨按比例溶于雙蒸水中，控制溫度為108 121°C， 滅菌15 30min，得到耐熱組份；(3)將牛血清白蛋白、谷氨酸單鈉、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀按比例溶于剩余的雙蒸水中，經0. 22 μ m的濾膜除菌得到不耐熱組份，然后將不耐熱組份與耐熱組份混合，得到疫苗耐熱保護劑；(4)將上述步驟得到的偽狂犬活疫苗耐熱保護劑與偽狂犬病毒培養液或豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)病毒培養液按重量比為1 (1 1.2)混合，將得到的混合溶液裝入凍干機中，在2 池內緩慢降溫至_45°C，在此溫度下維持5 6h，開始抽真空至10_4Pa，然后控制升溫，在14 16h內升至-20°C，再以2 5°C /h的升溫速度將溫度升至20°C，控溫保持5 他將其取出，即得到耐熱型家畜用疫苗。所述步驟(1)中磷酸二氫鉀的含量優選0. 52wt%。所述步驟O)中的偽狂犬病毒培養液按常規方法獲得。所述步驟(3)中的PRRS病毒培養液按常規方法獲得。與現有技術相比，本發明采用的原料成本較低，操作簡單，可以大規模生產，制備得到的耐熱偽狂犬活疫苗或耐熱PRRS活移苗可在2 8°C條件下保存M個月，疫苗效價均保持在每頭份彡IO6 0TCID500


圖1為實施例2中的凍干曲線。
具體實施例方式下面結合附圖和具體實施例對本發明進行詳細說明。實施例1耐熱型偽狂犬病毒活疫苗的制備方法，該方法包括以下步驟(1)凍干保護劑的配方及配制方法耐熱成份明膠lwt%、蔗糖8wt%、EDTA Iwt %，然后用雙蒸水定溶到合適的刻度。121°C高壓滅菌30min，不耐熱成份谷氨酸單鈉、磷酸氫二鉀2wt%、磷酸二氫鉀 0. 52wt%，牛血清白蛋白Iwt %、胰蛋白胨2wt%用雙蒸水定溶到合適的刻度，用0. 22μπι的濾膜除菌，然后將耐熱組分及不耐熱組分按1 1混合，得到疫苗耐熱保護劑；(2)偽狂犬病毒培養液的獲取a, Vero細胞的復蘇、培養從液氮中取出凍存的Vero細胞2 3個安瓶，在37°C 水浴中迅速解凍。將每個安瓶用lOOOr/min離心5 lOmin，棄去上清液，用2 3mL含有100IU/mL青霉素、80 μ g/mL鏈霉素、6%犢牛血清和0. 5%水解乳蛋白的DMEM重新懸浮細胞，然后吸入裝有IOmL培養液的培養瓶中搖勻，置37°C、5% C02的培養箱中靜止培養， 48 7 后待其形成良好單層細胞后，棄生長液，用PBS反復洗滌3次后，加入細胞消化液， 待細胞消化好后，傾去細胞消化液，并用吸管吸取生長液輕輕吹打細胞，使細胞充分散成單個細胞，分裝至96孔細胞培養板后置37°C恒溫培養，逐日觀察細胞形態，選擇生長良好的細胞備用；b、病毒的增殖當細胞鋪滿單層時，將PRV接種到細胞單層上，37°C感作40min或 Ih,每20min搖勻1次，使病毒充分接觸細胞，加適量維持液，置37°C、5 % CO2培養箱培養。 每天在顯微鏡下觀察CPE。細胞出現70% 80% CPE時，收取偽狂犬病毒培養液，_20°C冰箱保存備用；(3)偽狂犬病毒經過培養后，進行無菌檢驗和病毒含量的測定，將合格的偽狂犬病毒培養液和配制好的凍干保護劑1 1混合后，充分搖勻，定量分裝后立即進行冷凍干燥；(4)將分裝好的疫苗裝入凍干機箱體內，在池內緩慢降溫至_45°C，在此溫度下維持他后，開始抽真空至10-4 后，再開始升溫，14h內升至-20°c，之后以2°C /h的速度升溫至20°C，維持他加塞出箱，凍干全程為42h，得到耐熱型偽狂犬活疫苗。實施例2耐熱型偽狂犬病毒活疫苗的制備方法，該方法包括以下步驟(1)凍干保護劑的配方及配制方法耐熱成份明膠3wt%、蔗糖6wt%、EDTA Iwt %，然后用雙蒸水定溶到合適的刻度，121°C高壓滅菌30min，不耐熱成份谷氨酸單鈉3wt%、磷酸氫二鉀lwt%、磷酸二氫鉀 0. 52wt%，牛血清白蛋白3wt%、胰蛋白胨2wt%用雙蒸水定溶到合適的刻度，用0. 22μπι的濾膜除菌，然后將耐熱組分及不耐熱組分按1 1混合，得到疫苗耐熱保護劑；(2)偽狂犬病毒經過培養后，進行無菌檢驗和病毒含量的測定，將合格的病毒液和配制好的凍干保護劑1 1混合后，充分搖勻，定量分裝后立即進行冷凍干燥；(3)將分裝好的疫苗裝入凍干機箱體內，凍干曲線如圖1所示，在池內緩慢降溫至-45°C，在此溫度下維持證后，抽真空至10’a，開始升溫，IMi內升至-20°C，之后以2°C / h的速度升溫至20°C，維持證加塞出箱，凍干全程為46h，得到耐熱型偽狂犬活疫苗。凍干產品的測試將不同實施案例凍干的產品，置于100°C、37°C、2 8°C條件下保存，不同時間取樣，測定病毒含量及其物理性狀。表1凍干制品置于100°C間接煮沸10分鐘后的物理性狀和TCID50的測定結果
權利要求
1. 一種耐熱型家畜用疫苗的制備方法，其特征在于，該方法包括以下步驟(1)按照以下組分及含量(Wt % )準備耐熱保護劑原料明膠1 --3，蔗糖6 “-8,牛血清白蛋白1 --3，胰蛋白胨2 --3，EDTA1 --3，谷氨酸單鈉1 --3，磷酸氫二鉀1 --2，磷酸二氫鉀 0. 5 0. 6，雙蒸水余量；(2)將明膠、蔗糖、EDTA、胰蛋白胨按比例溶于雙蒸水中，控制溫度為108 121°C，滅菌 15 30min，得到耐熱組份；(3)將牛血清白蛋白、谷氨酸單鈉、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀按比例溶于剩余的雙蒸水中，經0. 22 μ m的濾膜除菌得到不耐熱組份，然后將不耐熱組份與耐熱組份混合，得到疫苗耐熱保護劑；(4)將上述步驟得到的偽狂犬活疫苗耐熱保護劑與偽狂犬病毒的培養液或豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)病毒的培養液按重量比為1 (1 1.2)混合，將得到的混合溶液裝入凍干機中，在2 汕內緩慢降溫至_45°C，在此溫度下維持5 6h，開始抽真空至10_4Pa，然后控制升溫，在14 16h內升至-20°C，再以2 5°C /h的升溫速度將溫度升至20°C，控溫保持5 他將其取出，即得到耐熱型家畜用疫苗。
2.根據權利要求1所述的一種耐熱型家畜用疫苗的制備方法，其特征在于，所述步驟 (1)中磷酸二氫鉀的含量優選0. 52wt%。
3.根據權利要求1所述的一種耐熱型家畜用疫苗的制備方法，其特征在于，所述步驟 (4)中的偽狂犬病毒培養液按常規方法獲得。
4.根據權利要求1所述的一種耐熱型家畜用疫苗的制備方法，其特征在于，所述步驟 (4)中的PRRS病毒培養液按常規方法獲得。
全文摘要
本發明涉及一種耐熱型家畜用疫苗的制備方法，該方法先配制好偽狂犬活疫苗或PRRS活移苗耐熱保護劑，然后將偽狂犬活疫苗耐熱保護劑或PRRS活移苗耐熱保護劑)與偽狂犬病毒培養液或PRRS病毒培養液混合，將得到的混合溶液裝入凍干機中，再經凍干操作得到耐熱型家畜用疫苗。與現有技術相比，本發明采用的原料成本較低，操作簡單，可以大規模生產，制備得到的耐熱偽狂犬活疫苗或PRRS活移苗可在2～8℃條件下保存24個月，疫苗效價均保持在每頭份≥106.0TCID50。
文檔編號A61P31/14GK102284061SQ20101020211
公開日2011年12月21日 申請日期2010年6月17日 優先權日2010年6月17日
發明者賴 志, 高俊鋒, 龔建培 申請人:上海創宏生物科技有限公司