一種豬瘟病毒重組亞單位疫苗的制備方法與應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種豬瘟病毒重組亞單位疫苗的制備方法與應用，屬于生物疫苗制備
技術領域。
【背景技術】
[0002] 豬瘟在歐洲稱為古典豬瘟（Classical Swine Fever，CSF)是由豬瘟病毒 (Classical Swine Fever Virus，CSFV)引起豬的一種急性、熱性、接觸性傳染病。以發病 急，高熱稽留和小血管壁變性引起廣泛出血、梗塞和壞死等病變為特征，家養和野生豬是其 唯一的天然宿主。世界動物衛生組織（OIE)將其定為A類傳染病，我國《動物防疫法》將其 列為一類傳染病。豬瘟是目前危害我國養豬業發展的主要疫病之一。
[0003] 豬瘟病毒屬于黃病毒科、瘟病毒屬成員，為單鏈線狀RNA病毒。該病毒與同屬的牛 病毒性腹瀉病毒之間有共同抗原性。病毒粒子略呈圓形，具有脂蛋白囊膜，病毒粒子表面有 脆弱的纖突結構。目前認為豬瘟病毒仍只有一種血清型，但是病毒株的毒力有強、中、弱之 分。CSFV基因組長約12. 5kb，僅含有1個大的開放性閱讀框（ORF)，此ORF編碼約4000個 氨基酸殘基分子量約438ku的多聚蛋白，在病毒與宿主細胞蛋白酶的作用下將其加工為12 種成熟蛋白，依次為，。，C，E nis, El，E2, p7, NS2, NS3, NS4A，NS4B，NS5A，NS5B。其中 C，Enis, El和E2為結構蛋白，其余為非結構蛋白。E2是CSFV最主要的免疫原性蛋白，能夠誘導機 體產生中和抗體并且能夠保護豬抵抗CSFV強毒株的攻擊。
[0004] 疫苗免疫是控制豬瘟流行的重要手段。經過多年應用，公認安全有效的弱毒疫苗 株有三種：①中國兔化弱毒疫苗；②日本GPE(-)細胞弱毒疫苗；③法國"Thiveosal"冷變 異弱毒株。其中中國學者研制成功的中國系（C系）豬瘟兔化弱毒疫苗，自1957年起，除在 我國廣泛應用外，已推廣到歐亞很多國家，并幫助這些國家控制或消滅了豬瘟。該疫苗被公 認為目前世界上比較理想的豬瘟疫苗。目前我國市場上常用的豬瘟疫苗有3種，即豬瘟細 胞活疫苗（細胞苗）、豬瘟乳兔組織活疫苗（組織苗）、豬瘟脾淋活疫苗（脾淋苗）。
[0005] 豬瘟活疫苗（細胞源）是通過體外培養犢牛睪丸細胞增殖病毒制備而成。豬瘟活 疫苗（細胞源）的優點是抗原含量相對較高（目前市場上的高效細胞苗達到7500RID/頭 份）；能產生較高的抗體水平；可大規模生產、質控容易、操作方便、供量充足。但是，由于在 疫苗制備過程中使用了原代細胞，因此該疫苗存在諸多缺陷，如：存在批次差異；無細胞病 變，不易控制病毒產量；豬瘟活疫苗（細胞源）的原輔材料涉及犢牛睪丸細胞和牛血清，導 致其制備過程中存在BVDV污染的風險。BVDV感染豬能引起疑似豬瘟的癥狀。近幾年，在我 國就有報道由BVDV污染的豬瘟疫苗引起的豬病。乳兔組織苗和成兔脾淋苗的免疫原性雖 然比較好，且無BVDV污染風險，但是由于在疫苗制備過程中需要使用兔子，因此這類疫苗 存在以下不足，如：不容易大規模生產；不同品種、批次、環境中兔的敏感性不一；容易污染 外源細菌；個別動物注射后會發生過敏反應。

【發明內容】

[0006] 本發明CSFV E2亞單位疫苗優點：1.大規模生產、供量充足、質控容易；2.安全性 高；3.批次間穩定；4.生產成本低；5.無BVDV污染風險。
[0007] 本發明要解決的問題是提供一種豬瘟病毒重組亞單位疫苗的制備方法與應用。
[0008] 一種豬瘟病毒重組亞單位疫苗的制備方法，包括下述步驟： 1) 將豬瘟病毒E2的截短體蛋白TE2編碼基因克隆到桿狀病毒表達系統中得到重組桿 狀病毒質粒Bacmi d-KSPTE2。 2) 轉染sf9細胞得到重組桿狀病毒BV-KSPTE2,用昆蟲細胞擴大培養后回收純化得到 TE2蛋白。 3) 將豬瘟病毒TE2蛋白與藥學上可接受的佐劑充分混勻后得到豬瘟病毒重組亞單位 疫苗。
[0009] 具體地，1)所述重組桿狀病毒質粒Bacmid-KSPTE2的構建方法為先將Kozak序 列基因和GP67信號肽基因克隆到載體pFastBac?l上從而得到中間質粒pFastBacl-KSP， 再將TE2蛋白編碼基因（含His標簽）克隆到中間質粒pFastBacl-KSP中得到重組質粒 pFastBacl-KSPTE2,最后將重組質粒pFastBacl-KSPTE2轉化至大腸桿菌DH IOBac感受態 細胞中，利用Tn7位點特異性重組方法最終獲得重組桿狀病毒質粒bacmid-KSPTE2。
[0010] 2)所述擴大培養為：重組桿狀病毒質粒bacmid-KSPTE2轉染對數期sf9細胞（細 胞密度為1. 5-2. 5 X 106/ml)得到Pl毒；兩代擴增后以P3代病毒感染對數期昆蟲細胞High five進行擴大培養。
[0011] 2)所述純化回收為：離心收集2)擴大培養細胞上清，先后通過親和層析與離子交 換層析純化得到目的蛋白。
[0012] 3)所述重組亞單位疫苗所用佐劑為ISA 201VG。
[0013] 所述的TE2蛋白編碼基因核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示，GP67信號肽核苷酸序 列如SEQ ID NO. 4所示，Kozak序列如SEQ ID NO. 5所示。
[0014] 所述豬瘟病毒E2截短體蛋白（TE2)應用于亞單位疫苗制備。
【附圖說明】
[0015] 圖 l、pFastBac?l 質粒圖譜。
[0016] 圖 2、pFastBacl-KSPTE2 雙酶切鑒定結果。M :DNA Marker DL5, 000 ;1 :重組質粒 pFastBacl-KSPTE2雙酶切電泳結果。
[0017] 圖 3、bacmid-KSPTE2PCR 鑒定結果。M :DNA Marker DL5,000 ;LM13 引物 PCR 鑒定 重組桿狀病毒質粒bacmid_KSPTE2電泳結果。
[0018] 圖 4、Western blot (anti-His)鑒定 TE2 蛋白表達。陽：陽性對照；M :Prestained Protein Ladder ;陰：陰性對照；TE2 :TE2培養上清。
[0019] 圖5、鎳柱親和層析色譜圖及SDS-PAGE結果。
[0020] 圖 6、Source 15Q 柱色譜圖及 SDS-PAGE 結果。
[0021] 圖7、IDEXX試劑盒檢測TE2免疫后抗體效價結果圖。
【具體實施方式】
[0022] 實施例1表達載體的構建
[0023] I. 1豬瘟病毒RNA提取
[0024] 用Trizol從豬瘟病毒培養上清中提取RNA作為反轉錄的模板。
[0025] I. 2RNA 反轉錄成 cDNA
[0026] 使用 takara 的 Primescript RT-PCR kit 進行實驗。
[0027] I. 3PCR擴增引物（酶切位點用下劃線標出）： 上游引物：5' -CG GAATTCCTAGCCTGCAAGGAAGATTAC-3' 下游引物：5' -CCC AAGCTT TTA GTGATGGTGATGGTGATGAACAAATTCTGCGAAGTAATC-3' [0028] 加樣體系為（50 μ 1):
【主權項】
1. 一種豬瘟病毒重組亞單位疫苗的制備方法，其基本特征包括下述步驟： 1) 豬瘟病毒E2的截短體蛋白TE2其特征在于如（a)或（b)的蛋白質： (a) 由SEQ ID NO. 1所示的氨基酸組成的蛋白質； (b) 在（a)中的氨基酸序列經過取代、缺失或添加一個氨基酸或幾個氨基酸且具有豬 瘟病毒E2蛋白抗原性的由（a)衍生的蛋白質。 2) 將TE2蛋白編碼基因克隆到桿狀病毒表達系統中得到重組桿狀病毒質粒 Bacmid-KSPTE2。 3) 轉染sf9細胞得到重組桿狀病毒BV-KSPTE2,用昆蟲細胞擴大培養后回收純化得到 TE2蛋白。 4) 將TE2蛋白與藥學上可接受的佐劑充分混勻后得到豬瘟病毒重組亞單位疫苗。
2. 權利要求1所述的疫苗制備方法，其特征在于2)所述重組桿狀病毒質粒 Bacmid-KSPTE2的構建方法為先將Kozak序列基因和GP67信號肽序列基因克隆到載體 pFastBac?l上從而得到中間質粒pFastBacl-KSP，再將TE2蛋白編碼基因（含His標簽） 克隆到中間質粒PFastBac I-KSP中得到重組質粒pFastBac 1-KSPTE2，最后將重組質粒 pFastBacl-KSPTE2轉化至大腸桿菌DHlOBac感受態細胞，利用Tn7位點特異性重組方法最 終獲得重組桿狀病毒質粒bacmid-KSPTE2。
3. 權利要求1所述的疫苗抗原制備方法，其特征在于3)所述擴大培養為：重組桿狀病 毒質粒bacmid-KSPTE2轉染對數期sf9細胞（細胞密度為I. 5-2. 5X 106/rnl)得到Pl毒； 兩代擴增后以P3代病毒感染對數期昆蟲細胞High five進行擴大培養。優選地，所述桿狀 病毒感染復數（MOI)為0. 5-10,進一步優化為1 ;優選地，所述培養時間為56-63h。
4. 權利要求1所述的疫苗制備方法，其特征在于3)所述回收純化為：離心收集3)擴大 培養細胞上清，先后通過親和層析與陰離子交換層析純化得到目的蛋白。優選地但不限于， 所述的親和層析是Histrap FF層析柱；優選地但不限于，所述的陰離子交換層析是source 15Q層析柱；優選地但不限于，所述的陰離子交換層析使用的緩沖液包括：緩沖液A :10mM NaH2PO3, ρΗ8· 0 ;緩沖液B :10mM NaH2P03,500mM NaCI，ρΗ8· 0 ;優選地但不限于，所述洗脫緩 沖液的洗脫程序是以0-100%洗脫緩沖液Β，5-10個柱體積進行梯度洗脫。
5. 權利要求1所述的疫苗制備方法，其特征在于4)所述重組亞單位疫苗所用佐劑為 ISA201VG。優選地，所述的ΤΕ2蛋白與佐劑ISA201VG按體積比46 : 54混合乳化。
6. 權利要求1所述的ΤΕ2蛋白編碼基因核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示，GP67信號肽 核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示，Kozak序列如SEQ ID NO. 5所示。
7. 權利要求1所述TE2蛋白表達系統包括但不限于昆蟲細胞、大腸桿菌、酵母以及哺乳 動物細胞等。
8. 權利要求1所述截短的豬瘟病毒E2蛋白（TE2)應用于亞單位疫苗制備。
【專利摘要】本發明公開了一種豬瘟病毒重組亞單位疫苗的制備方法和應用，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本發明所提供的重組亞單位疫苗制備方法通常包括以下步驟：將編碼豬瘟病毒E2蛋白截短體(TE2)基因克隆到桿狀病毒載體pFastBacTM1中，通過轉染昆蟲細胞sf9獲得能夠表達TE2蛋白的重組桿狀病毒。利用重組桿狀病毒感染處于對數生長期的昆蟲細胞high five，使TE2蛋白在細胞培養上清中大量表達。最后回收純化培養上清從而得到大量純度大于90％的重組蛋白TE2。使用本發明所提供的方法能夠從細胞培養上清中收獲目的蛋白，從而縮短了蛋白純化時間，并且避免了回收細胞內蛋白所需消耗的大量時間，簡化了疫苗生產步驟。在簡化生產步驟的前體下，本發明提供的TE2重組蛋白具有免疫原性強、安全性高等優點，動物試驗也證明該重組蛋白能夠有效刺激機體產生高效的體液免疫應答。
【IPC分類】C12N15-40, A61P31-14, A61K39-187
【公開號】CN104826100
【申請號】CN201510187995
【發明人】宣春玲, 錢泓, 吳有強, 吳素芳, 呂朋, 查銀河, 張屹峰, 汪正亮
【申請人】浙江海隆生物科技有限公司
【公開日】2015年8月12日
【申請日】2015年4月16日