專利名稱：布氏桿菌病活疫苗的制備方法及其產品的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種動物疫苗的制備方法，尤其涉及布氏桿菌病疫苗的制備方法及由該方法制備得到的疫苗，本發明屬于布氏桿菌病疫苗的生產領域。
背景技術：
布氏桿菌病(全稱布魯士桿菌病(brucellosis)是由布氏桿菌引起的人畜共患的急、慢性傳染病。臨床特點是緩慢起病，長期發熱、多汗、虛弱、全身痛和關節痛，急性期癥狀多在3 6月內消退。布氏桿菌共分為牛、羊、豬、沙林鼠、綿羊和犬布氏桿菌六種。在中國發現的主要為前三種。布氏桿菌為細小的短桿狀或球桿狀，不產生芽胞，革蘭氏染色陰性的桿菌。布氏桿菌對熱敏感，70°C 10分鐘即可死亡；陽光直射1小時死亡；在腐敗病料中迅速失去活力；一般常用消毒藥都能很快將其殺死。潛伏期短者兩周，長者可達半年。母牛流產是本病的主要癥狀，流產多發生于懷孕5-7個月，產出死胎或軟弱胎兒。母牛流產后常伴有胎衣不下或子宮內膜炎，陰道內繼續排出紅褐色惡臭液體，可持續2-3周，患病公牛常發生睪丸炎或附睪炎。人也可感染該病，表現為長期發熱、多汗、關節痛、神經痛及肝、脾腫大等癥狀.該病嚴重損害人和動物的健康，OIE將其列為B類動物疫病，中國將其列為二類動物疫病.布氏桿菌病對畜牧業和人類健康均構成嚴重威脅，疫苗免疫是預防和控制布氏桿菌病的主要措施。由于布氏桿菌胞內寄生的特點，只有利福平等少數的幾種抗生素對其治療有效，但這些抗生素的副作用很大，不能長期服用，因此一旦發病并轉為慢性則無法根治，并能反復發作。因此，接種疫苗是預防布氏桿菌病的最有效的手段。布氏桿菌活疫苗A19株是防制布氏桿菌病非常有效的弱毒疫苗株，該疫苗適用于牛和羊，且牛每頭份免疫劑量為600億-800億。現有的布氏桿菌A19株活疫苗的生產規程方法如下一級菌種制備凍干菌種開封后，用蛋白胨水溶解，劃線移植于胰蛋白目示瓊脂平板或其他適宜培養基上，在36-37°C培養2-3日。選取合格菌落10個以上，移植于胰蛋白目示瓊脂斜面培養基，36-37°C培養48-72小時，作為一級種子。在2_8°C保存，使用期應不超過1 個月。二級菌種制備取一級菌種接種于胰蛋白際瓊脂扁平或其他適宜培養基，置 36-37°C培養48-72小時，肉眼檢查純凈后，每個扁平加蛋白胨水適量，將菌苔洗下，接種于 1萬-2萬ml的適宜液體培養基，置36-37°C培養48-72小時，進行純粹檢驗后置2_8°C保存，使用期應不超過30天。菌液培養按培養基量加入適量的消泡劑，滅菌后按培養基量的-2%接種二級菌種，在36-37°C逐漸增大通氣量，培養36小時，培養過程中可根據需要加入50%的葡萄糖溶液，每次加入量為培養基總量的_2%。按現有的規程進行布氏桿菌活疫苗(A19株)生產所培養得到菌液的活菌數為 800-1000億/ml，需要對該菌液進行濃縮處理，存在產量低、生產成本高等問題，有待改進。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是克服現有的布氏桿菌活疫苗的生產方法中所存在的產量低、生產成本高等問題，提供一種新的布氏桿菌活疫苗的生產方法，該生產方法所培養得到菌液的菌數可達1500-1800億/ml，具有存在產量高、生產成本低等優點。本發明所要解決的技術問題是通過以下技術方案來實現的一種布氏桿菌病活疫苗的制備方法，包括一級菌種制備、二級菌種制備和菌液培養；其中在菌液培養階段，液體培養基接種二級菌種后首先按照逐漸增大通氣量的方式通入空氣進行培養，培養至30h時開始通入純氧直至培養結束。本發明進一步發現，不同的通入純氧的方式在培養液的菌數上有著非常顯著的差別，為了最大限度的提高培養液的菌數，本發明比較和篩選了不同的通入純氧的方式，最終發現，采用以下方式通入純氧，培養液中的菌數產量最高，可達到1700-1800億/ml 培養至 30h時按照8m3/h的通入量通入純氧，以后每池將通氣量增加2m3，使培養液溶氧量DO值保持在95% -98%,直至3 培養結束。本發明還發現，在菌液培養階段，通入空氣的方式對于培養液的菌數也有一定的影響。本發明通過大量的實驗發現，在菌液培養階段按照以下方式逐步通入空氣可以有效的提高培養液菌數液體培養基接種二級菌種后首先按照12m3/h的通入量通入普通空氣，從第IOh開始將空氣的通氣量增至16m3/h，培養20h后將空氣的通氣量進一步增大增至18m3/h。此外，本發明還發現，在菌液培養階段，50%葡萄糖溶液的加入方式對于培養液菌數也有一定的影響按現有的規程，50%葡萄糖溶液的加入方法為培養過程中根據需要加入50%的葡萄糖溶液，每次加入量為培養基總質量的1 % -2%。本發明通過實驗發現，如果在接種時就按最終含量為將50%葡萄糖溶液一次性加入能夠有效的提高培養液的細菌數量。本發明方法在菌液培養階段中選擇最適宜該細菌大量繁殖的時段通入純氧，使培養菌數得到大幅度提高，培養液中菌數可達1500-1900億/ml，在應用時無需對該菌液進行濃縮處理，具有產量高、生產成本低等優點。
圖1本發明制備方法的工藝流程圖。
具體實施例方式下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發明的范圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和范圍下可以對本發明技術方案的細節和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護范圍內。實施例1一級菌種制備布氏桿菌病活疫苗A19株凍干菌種(購自中國獸醫藥品監察所) 開封后，用蛋白胨水溶解，劃線移植于胰蛋白胨瓊脂平板或其它適宜培養基上，在37°C培養3日。選取合格菌落10個以上，移植于胰蛋白胨瓊脂斜面培養基，37°C培養72小時，作為一級種子，在2-8°C保存；二級菌種制備取一級菌種接種于胰蛋白胨瓊脂扁平或其它適宜培養基，置37°C 培養72小時，肉眼檢查純凈后，每個扁平加蛋白胨水適量，將菌苔洗下，接種于1萬ml的馬丁肉湯液體培養基中，置37°C培養72小時，進行純粹檢驗后得到二級菌種，置2-8°C保存； 每IOOOml馬丁肉湯培養基的成分為牛肉湯500ml豬胃消化液500ml氯化鈉2.5gPH6. 4-6. 7滅菌116 °C 30-40 分鐘菌液培養按馬丁肉湯液體培養基的質量加入0. 01%的消泡劑，滅菌后按最終含量為將50%葡萄糖溶液一次性加入，按馬丁肉湯液體培養基質量的2%接種二級菌種后通入空氣并逐漸增大空氣的通入量；培養至30h時按照8m3/h的通入量通入純氧，以后每池將通氣量增加2m3，使培養液溶氧量DO值保持在95% -98%,直至3 培養結束。經檢驗，培養液中菌數為1600億/ml。實施例2一級菌種制備布氏桿菌病活疫苗A19株凍干菌種(購自中國獸醫藥品監察所) 開封后，用蛋白胨水溶解，劃線移植于胰蛋白胨瓊脂平板或其它適宜培養基上，在37°C培養 3日。選取合格菌落10個以上，移植于胰蛋白胨瓊脂斜面培養基，37°C培養72小時，作為一級種子，在2-8°C保存；二級菌種制備取一級菌種接種于胰蛋白胨瓊脂扁平或其它適宜培養基，置37°C 培養72小時，肉眼檢查純凈后，每個扁平加蛋白胨水適量，將菌苔洗下，接種于1萬ml的馬丁肉湯液體培養基，置37°C培養72小時，進行純粹檢驗后得到二級菌種，置2-8°C保存；菌液培養按馬丁肉湯液體培養基的質量加入0. 01%的消泡劑，滅菌后按最終含量為將50%葡萄糖溶液一次性加入，按馬丁肉湯液體培養基質量的2%接種二級菌種后就按照12m3/h的通入量通入普通空氣，從第IOh開始將空氣的通氣量增至16m3/h，培養20h后將空氣的通氣量進一步增大增至18m3/h ；培養至30h時按照8m3/h的通入量通入純氧，以后每池將通氣量增加2m3，使培養液溶氧量DO值保持在95% -98%,直至3 培養結束。經檢驗，培養液中菌數為1850億/ml。實施例3一級菌種制備布氏桿菌病活疫苗A19株凍干菌種(購自中國獸醫藥品監察所) 開封后，用蛋白胨水溶解，劃線移植于胰蛋白胨瓊脂平板或其它適宜培養基上，在37°C培養 3日。選取合格菌落10個以上，移植于胰蛋白胨瓊脂斜面培養基，37°C培養72小時，作為一級種子，在2-8°C保存；二級菌種制備取一級菌種接種于胰蛋白胨瓊脂扁平或其它適宜培養基，置37°C 培養72小時，肉眼檢查純凈后，每個扁平加蛋白胨水適量，將菌苔洗下，接種于2萬ml的馬丁肉湯液體培養基，置37°C培養72小時，進行純粹檢驗后得到二級菌種，置2-8°C保存；菌液培養按馬丁肉湯液體培養基的質量加入0. 01%的消泡劑，滅菌后按最終含量為將50%葡萄糖溶液一次性加入，按馬丁肉湯液體培養基質量的2%接種二級菌種后就按照12m3/h的通入量通入普通空氣，從第IOh開始將空氣的通氣量增至16m3/h，培養20h后將空氣的通氣量進一步增大增至18m3/h ；培養至30h時按照8m3/h的通入量通入純氧，以后每池將通氣量增加2m3，使培養液溶氧量DO值保持在95% -98%,直至3 培養結束。經檢驗，培養液中菌數為1790億/ml。實施例4一級菌種制備布氏桿菌病活疫苗A19株凍干菌種(購自中國獸醫藥品監察所) 開封后，用蛋白胨水溶解，劃線移植于胰蛋白胨瓊脂平板或其它適宜培養基上，在36°C培養 2日。選取合格菌落10個以上，移植于胰蛋白胨瓊脂斜面培養基，36°C培養48小時，作為一級種子，在2-8°C保存；二級菌種制備取一級菌種接種于胰蛋白胨瓊脂扁平或其它適宜培養基，置36°C 培養48小時，肉眼檢查純凈后，每個扁平加蛋白胨水適量，將菌苔洗下，接種于1萬ml的馬丁肉湯液體培養基，置36°C培養48小時，進行純粹檢驗后得到二級菌種，置2-8°C保存；菌液培養按馬丁肉湯液體培養基的質量加入0. 01%的消泡劑，滅菌后按最終含量為2wt%將50%葡萄糖溶液一次性加入，按馬丁肉湯液體培養基質量的-2%接種二級菌種后就按照12m3/h的通入量通入普通空氣，從第IOh開始將空氣的通氣量增至16m3/ h，培養20h后將空氣的通氣量進一步增大增至18m3/h ；培養至30h時按照8m3/h的通入量通入純氧，直至3 培養結束。經檢驗，培養液中菌數為1500億/ml。實施例5一級菌種制備布氏桿菌病活疫苗A19株凍干菌種(購自中國獸醫藥品監察所) 開封后，用蛋白胨水溶解，劃線移植于胰蛋白胨瓊脂平板或其它適宜培養基上，在36°C培養 2日。選取合格菌落10個以上，移植于胰蛋白胨瓊脂斜面培養基，36°C培養60小時，作為一級種子，在2-8°C保存；二級菌種制備取一級菌種接種于胰蛋白胨瓊脂扁平或其它適宜培養基，置36°C 培養60小時，肉眼檢查純凈后，每個扁平加蛋白胨水適量，將菌苔洗下，接種于1. 5萬ml的馬丁肉湯液體培養基，置36°C培養60小時，進行純粹檢驗后得到二級菌種，置2-8°C保存；菌液培養按馬丁肉湯液體培養基的質量加入0. 01%的消泡劑，滅菌后按最終含量為將50%葡萄糖溶液一次性加入，按馬丁肉湯液體培養基質量的接種二級菌種后就按照8m3/h的通入量通入普通空氣，從第IOh開始將空氣的通氣量增至12m3/h，培養 20h后將空氣的通氣量進一步增大增至16m3/h ；培養至30h時按照8m3/h的通入量通入純氧，以后每池將通氣量增加2m3，使培養液溶氧量DO值保持在95 %~98%,直至3 培養結束。經檢驗，培養液中菌數為1720億/ml。實施例6—級菌種制備布氏桿菌病活疫苗A19株凍干菌種(購自中國獸醫藥品監察所) 開封后，用蛋白胨水溶解，劃線移植于胰蛋白胨瓊脂平板或其它適宜培養基上，在37°C培養 3日。選取合格菌落10個以上，移植于胰蛋白胨瓊脂斜面培養基，37°C培養48小時，作為一級種子，在2_8°C保存；二級菌種制備取一級菌種接種于胰蛋白胨瓊脂扁平或其它適宜培養基，置37°C 培養48小時，肉眼檢查純凈后，每個扁平加蛋白胨水適量，將菌苔洗下，接種于2萬ml的馬丁肉湯液體培養基，置37°C培養72小時，進行純粹檢驗后得到二級菌種，置2-8°C保存；菌液培養按馬丁肉湯液體培養基的質量加入0. 01%的消泡劑，滅菌后按最終含量為2wt%將50%葡萄糖溶液一次性加入，按馬丁肉湯液體培養基質量的-2%接種二級菌種后就按照12m3/h的通入量通入普通空氣，從第IOh開始將空氣的通氣量增至16m3/ h，培養20h后將空氣的通氣量進一步增大增至18m3/h ；培養至30h時按照8m3/h的通入量通入純氧，以后每將通氣量增加2m3，使培養液溶氧量DO值保持在95% -98%，直至3 培養結束。經檢驗，培養液中菌數為1800億/ml。實施例7一級菌種制備布氏桿菌病活疫苗A19株凍干菌種(購自中國獸醫藥品監察所) 開封后，用蛋白胨水溶解，劃線移植于胰蛋白胨瓊脂平板或其它適宜培養基上，在36°C培養 3日。選取合格菌落10個以上，移植于胰蛋白胨瓊脂斜面培養基，36°C培養72小時，作為一級種子，在2-8°C保存；二級菌種制備取一級菌種接種于胰蛋白胨瓊脂扁平或其它適宜培養基，置37°C 培養72小時，肉眼檢查純凈后，每個扁平加蛋白胨水適量，將菌苔洗下，接種于1萬ml的馬丁肉湯液體培養基，置37°C培養72小時，進行純粹檢驗后得到二級菌種，置2-8°C保存；菌液培養按馬丁肉湯液體培養基的質量加入0. 01%的消泡劑，滅菌后按最終含量為2wt%將50%葡萄糖溶液一次性加入，按馬丁肉湯液體培養基質量的-2%接種二級菌種后就按照12m3/h的通入量通入普通空氣，從第IOh開始將空氣的通氣量增至16m3/ h，培養20h后將空氣的通氣量進一步增大增至18m3/h ；培養至30h時按照6m3/h的通入量通入純氧，以后每池將通氣量增加lm3，使培養液溶氧量DO值保持在94%，直至3 培養結束。經檢驗，培養液中菌數為1650億/ml。實施例8一級菌種制備布氏桿菌病活疫苗A19株凍干菌種(購自中國獸醫藥品監察所) 開封后，用蛋白胨水溶解，劃線移植于胰蛋白胨瓊脂平板或其它適宜培養基上，在37°C培養 2日。選取合格菌落10個以上，移植于胰蛋白胨瓊脂斜面培養基，37°C培養48小時，作為一級種子，在2-8°C保存；二級菌種制備取一級菌種接種于胰蛋白胨瓊脂扁平或其它適宜培養基，置37°C 培養72小時，肉眼檢查純凈后，每個扁平加蛋白胨水適量，將菌苔洗下，接種于1萬ml的馬丁肉湯液體培養基，置37°C培養72小時，進行純粹檢驗后得到二級菌種，置2-8°C保存；菌液培養按馬丁肉湯液體培養基的質量加入0. 01%的消泡劑，滅菌后按最終含量為2wt%將50%葡萄糖溶液一次性加入，按馬丁肉湯液體培養基質量的-2%接種二級菌種后就按照12m3/h的通入量通入普通空氣，從第他開始將空氣的通氣量增至12m3/h， 培養1 后將空氣的通氣量進一步增大增至16m3/h ；培養至30h時按照6m3/h的通入量通入純氧，以后每池將通氣量增加lm3，使培養液溶氧量DO值保持在97%直至3 培養結束。 經檢驗，培養液中菌數為1620億/ml。對比實施例1一級菌種制備布氏桿菌病活疫苗A19株凍干菌種(購自中國獸醫藥品監察所) 開封后，用蛋白胨水溶解，劃線移植于胰蛋白胨瓊脂平板或其它適宜培養基上，在37°C培養 3日。選取合格菌落10個以上，移植于胰蛋白胨瓊脂斜面培養基，37°C培養72小時，作為一級種子，在2_8°C保存；二級菌種制備取一級菌種接種于胰蛋白胨瓊脂扁平或其它適宜培養基，置37°C 培養72小時，肉眼檢查純凈后，每個扁平加蛋白胨水適量，將菌苔洗下，接種于2萬ml的馬丁肉湯液體培養基，置37°C培養72小時，進行純粹檢驗后得到二級菌種，置2-8°C保存；菌液培養按培養基量加入適量的消泡劑，滅菌后按培養基量的-2%接種二級菌種，在36-37°C逐漸增大通氣量，培養36小時，培養過程中可根據需要加入50%的葡萄糖溶液，每次加入量為培養基總量的_2%。經檢驗，培養液中菌數為820億/ml。對比實施例2一級菌種制備布氏桿菌病活疫苗A19株凍干菌種(購自中國獸醫藥品監察所) 開封后，用蛋白胨水溶解，劃線移植于胰蛋白胨瓊脂平板或其它適宜培養基上，在36°C培養 2日。選取合格菌落10個以上，移植于胰蛋白胨瓊脂斜面培養基，36°C培養48小時，作為一級種子，在2-8°C保存；二級菌種制備取一級菌種接種于胰蛋白胨瓊脂扁平或其它適宜培養基，置36°C 培養48小時，肉眼檢查純凈后，每個扁平加蛋白胨水適量，將菌苔洗下，接種于1萬ml的馬丁肉湯液體培養基，置36°C培養48小時，進行純粹檢驗后得到二級菌種，置2-8°C保存；菌液培養按培養基量加入適量的消泡劑，滅菌后按培養基量的-2%接種二級菌種，接種后36-37°C培養，按照12m3/h的通入量通入普通空氣，從第IOh開始將空氣的通氣量增至16m3/h，培養20h后將空氣的通氣量進一步增大增至18m3/h直至3 培養結束。 經檢驗，培養液中菌數為980億/ml。對比實施例3一級菌種制備布氏桿菌病活疫苗A19株凍干菌種(購自中國獸醫藥品監察所) 開封后，用蛋白胨水溶解，劃線移植于胰蛋白胨瓊脂平板或其它適宜培養基上，在37°C培養 2日。選取合格菌落10個以上，移植于胰蛋白胨瓊脂斜面培養基，37°C培養48小時，作為一級種子，在2-8°C保存；二級菌種制備取一級菌種接種于胰蛋白胨瓊脂扁平或其它適宜培養基，置37°C 培養48小時，肉眼檢查純凈后，每個扁平加蛋白胨水適量，將菌苔洗下，接種于2萬ml的馬丁肉湯液體培養基，置37°C培養48小時，進行純粹檢驗后得到二級菌種，置2-8°C保存；菌液培養按培養基量加入適量的消泡劑，滅菌后按培養基量的-2%接種二級菌種，接種后36-37°C培養，按照12m3/h的通入量通入普通空氣，從第IOh開始將空氣的通氣量增至16m3/h，培養20h后將空氣的通氣量進一步增大增至18m3/h直至3 培養結束。 經檢驗，培養液中菌數為900億/ml。對比實施例4—級菌種制備布氏桿菌病活疫苗A19株凍干菌種(購自中國獸醫藥品監察所) 開封后，用蛋白胨水溶解，劃線移植于胰蛋白胨瓊脂平板或其它適宜培養基上，在37°C培養 2日。選取合格菌落10個以上，移植于胰蛋白胨瓊脂斜面培養基，37°C培養60小時，作為一級種子，在2-8°C保存；二級菌種制備取一級菌種接種于胰蛋白胨瓊脂扁平或其它適宜培養基，置37°C 培養60小時，肉眼檢查純凈后，每個扁平加蛋白胨水適量，將菌苔洗下，接種于1. 5萬ml的馬丁肉湯液體培養基，置37°C培養60小時，進行純粹檢驗后得到二級菌種，置2-8°C保存；
菌液培養按培養基量加入適量的消泡劑，滅菌后按培養基量的-2%接種二級菌種，接種后36-37 培養，按照12m3/h的通入量通入普通空氣，從第IOh開始將空氣的通氣量增至16m3/h，培養20h后將空氣的通氣量進一步增大增至18m3/h直至3 培養結束。 經檢驗，培養液中菌數為850億/ml。
權利要求
1.一種布氏桿菌病活疫苗的制備方法，包括一級菌種制備、二級菌種制備和菌液培養； 其特征在于在菌液培養階段，液體培養基接種二級菌種后按照逐漸增大通氣量的方式通入空氣進行培養；培養至30h時開始通入純氧直至培養結束。
2.按照權利要求1所述的制備方法，其特征在于培養至30h時按照8m3/h的通入量通入純氧，以后每池將通氣量增加2m3，使培養液溶氧量DO值保持在95% -98%,直至3 培養結束。
3.按照權利要求1所述的制備方法，其特征在于液體培養基接種二級菌種后首先按照12m3/h的通入量通入普通空氣，從第IOh開始將空氣的通氣量增至16m3/h，培養20h后將空氣的通氣量進一步增大增至18m3/h。
4.按照權利要求1所述的制備方法，其特征在于按質量百分比計，所述的液體培養基中含有2%的葡萄糖。
5.由權利要求1-4任何一項制備方法所制備得到的布氏桿菌活疫苗。
6.權利要求5所述的布氏桿菌活疫苗在制備預防布氏桿菌病試劑中的用途。
7.權利要求5所述的布氏桿菌活疫苗在制備治療布氏桿菌病藥物中的用途。
全文摘要
本發明公開了布氏桿菌病活疫苗的制備方法及其產品。該方法包括一級菌種制備、二級菌種制備和菌液培養；其中，在菌液培養階段，液體培養基接種二級菌種后按照逐漸增大通氣量的方式通入空氣進行培養；培養至30h時開始通入純氧直至36h培養結束。本發明方法在菌液培養階段中選擇最適宜該細菌大量繁殖的時段通入純氧，使培養菌數得到大幅度提高，培養液中菌數可達1500-1900億/ml，在應用時無需對該菌液進行濃縮處理，具有產量高、生產成本低等優點。
文檔編號A61K39/10GK102258774SQ20111018095
公開日2011年11月30日 申請日期2011年6月30日 優先權日2011年6月30日
發明者付麗杰, 尹堯, 張繼東, 柴華, 王 華, 袁明霞, 鄭鐵鑫 申請人:哈藥集團生物疫苗有限公司