速效胰島素前體蛋白以及速效胰島素的制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種速效胰島素前體蛋白、其編碼基因、包含該編碼基因的克隆載體 或表達載體、轉化體，以及利用該速效胰島素前體蛋白制備速效胰島素的方法。
【背景技術】
[0002] 根據國際糖尿病聯盟（InternationalDiabetesFederation，IDF)的最新統計數 據顯示，2014年全球糖尿病患者人數已經高達3. 87億，按目前的增長速度，預測到2035年 全球將有近5. 92億人患糖尿病。令人擔憂的是，中國糖尿病患者更是高達9628. 8萬人，是 全球糖尿病患者人數最多的國家。
[0003] 包括門冬胰島素、賴脯胰島素在內的速效胰島素屬于第三代胰島素，可用于成人I 型糖尿病和II型糖尿病的治療。門冬胰島素還可用于兒童、青少年和孕婦及哺乳期婦女糖 尿病的治療。門冬胰島素的問世，為拯救糖尿病患者的生命，提高患者的生活質量，帶來了 新的曙光。
[0004] 門冬胰島素是一種人胰島素類似物，由A、B兩條鏈組成，與人胰島素不同的是其B 鏈第28位脯氨酸替換為天門冬氨酸，利用電荷的排斥作用阻止了胰島素單體的自我聚集， 從而迅速吸收，因此起效比人胰島素更快。因此，門冬胰島素彌補了人胰島素的不足，使外 源性胰島素能更好地滿足餐時胰島素需求，包括餐前注射吸收迅速、穩定，達峰時間短，從 而更有效地控制餐后高血糖。
[0005]目前用重組DNA技術表達胰島素及胰島素類似物，主要有三種方法。第一種方法 是利用大腸桿菌表達胞內融合蛋白，通過破壁收獲包涵體，再經變復性、酶解方式等處理獲 得胰島素或胰島素類似物分子。大腸桿菌有生長迅速，培養成本低等優勢，但是其缺點也非 常明顯：因為大腸桿菌表達的蛋白質大多數以包涵體形式存在，必須經過破壁、包涵體收集 與變復性處理才能得到活性分子，但這些處理方法存在能耗大，工藝繁瑣，收率不高等諸多 缺點。
[0006] 例如，美國專利US20140221606A1公布了一種腸桿菌制備速效胰島素的方法，該 方案在A鏈和B鏈之間添加了一段35個氨基酸殘基的C肽，使速效胰島素前體分子的表達 能力提高至3~5g/L。但是該法通過大腸桿菌表達的速效胰島素前體分子需經過破壁、包 涵體的收集與洗滌、包涵體溶解、稀釋復性、純化、蛋白酶解等復雜過程才能獲得完整的速 效胰島素分子，再經過一系列層析步驟獲得純品，其制備工藝十分復雜，產品收率不高。
[0007] 第二種方法是利用釀酒酵母表達胰島素或胰島素類似物前體分子，使產物分泌到 胞外培養基中，然后經捕獲、酶解和轉肽等方法制備胰島素或胰島素類似物分子。雖然釀酒 酵母能夠將蛋白質分泌到胞外，但也存在一些缺點：如釀酒酵母容易使表達產物發生高度 糖基化，增加了人體發生免疫反應的風險，因此必須在藥物純化過程中增加步驟控制雜質 含量。再者，釀酒酵母還存在生長緩慢，發酵密度不高，啟動子能力較弱等問題，這些缺點導 致產物表達量低。
[0008] 例如，美國專利US5, 618, 913公布了諾和諾德公司制備門冬胰島素的方法。該方 法以釀酒酵母為表達宿主，利用重組DNA技術生產得到門冬胰島素前體，再通過轉肽等一 系列復雜工藝制備門冬胰島素。該方法技術壁皇高，特別在宿主菌改造、質粒構建等方面技 術難度大、工藝復雜。由于釀酒酵母自身表達能力較弱，因此產物表達量不高，其工程菌搖 床培養最高為21. 5mg/L，一定程度上增加了藥品生產成本。
[0009]第三種是利用畢赤酵母表達胰島素或胰島素類似物前體分子，表達產物同樣分泌 到胞外培養基中，經捕獲、酶解和轉肽等方法制備胰島素或胰島素類似物分子。畢赤酵母是 一種非常優秀的表達系統，它可以將蛋白質直接分泌到胞外，還有發酵密度高，產量高等優 勢。
[0010] 但是，目前使用畢赤酵母表達系統生產胰島素的方案中仍然面臨著表達量不高、 產率偏低的挑戰，原因涉及編碼序列、純化方法等多方面。因此，仍有必要提供一種能夠以 更高效率和得率生產胰島素的系統和方法。

【發明內容】

[0011] 本發明一方面提供一種門冬胰島素前體，其氨基酸序列為Zi(XY) nZ2Z3Z4-B(1-29)-(^(^3^(1-21),其中ZpXJA、別為Asp或Glu;Y為Ala或Gly;n為 1 ~ 10 之間的整數；23為Pro、Glu或Asp;Z4、(：3分別為Lys或Arg ;Cρ〇；分別為Glu、Asp、Ala 或Gly;B(1-29)為門冬胰島素B鏈1-29位氨基酸；并且A(1-21)為門冬胰島素A鏈1-21 位氨基酸。
[0012] 在一個實施方式中，其中21是6111。在一個實施方式中，其中X是Glu。在一個實 施方式中，其中Y是Ala。在一個實施方式中，其中22是6111。在一個實施方式中，其中23是 Pro。在一個實施方式中，其中(；是6111或Asp。在一個實施方式中，其中(：2是Gly或Ala。 在一個實施方式中，η為3~10之間的整數，或η為5~10之間的整數，或η為7~10之 間的整數。
[0013] 在一個實施方式中，本發明的門冬胰島素前體的氨基酸序列如SEQIDΝ0. 2所示。 本發明另一方面提供一種編碼本發明所述的門冬胰島素前體的核苷酸序列。在本發明的一 個實施方式中，該核苷酸序列如SEQIDNO. 1所示，其編碼SEQIDN0. 2所示的氨基酸序 列。在本發明的一些實施方式中，該核苷酸序列是因密碼子簡并性或宿主偏好性而與SEQ IDNO. 1所示序列具有一個或幾個核苷酸差異的核苷酸序列。
[0014] 本發明的另一個方面提供一種含有上述核苷酸序列的克隆載體。在一些實施方式 中，所述克隆載體為重組質粒PPIC9K，重組質粒pPICZαA或重組質粒pPinkaHC。
[0015] 在本發明的一個實施例中，將編碼所述的門冬胰島素前體基因克隆到質粒PPIC9K 中。該重組質粒含有一個Α0Χ1基因啟動子序列，其后連有一個來自釀酒酵母α-交配因子 信號肽序列，其后連有一個門冬胰島素前體基因序列，其后連有一個轉錄終止子序列，其后 連有一個篩選標記HIS4基因序列，其后連有一個篩選標記卡那霉素抗性基因序列，其后連 有一個Α0Χ1基因的3'末端序列。
[0016] 在本發明的另一個實施例中，將編碼所述門冬胰島素前體基因克隆到質粒 pPICZaΑ中。該重組質粒含有一個Α0Χ1基因啟動子序列，其后連有一個來自釀酒酵母 α-交配因子信號肽序列，其后連有一個門冬胰島素前體基因序列，其后連有一個轉錄終止 子序列，其后連有一個篩選標記Zeocin抗性基因序列。
[0017]在本發明的另一個實施例中，將編碼所述門冬胰島素前體基因克隆到質粒pPinka-HC中。該重組質粒含有一個A0X1基因啟動子序列，其后連有一個來自釀酒酵母 a-交配因子信號肽序列，其后連有一個門冬胰島素前體基因序列，其后連有一個轉錄終止 子序列，其后連有一個篩選標記ADE2基因序列。
[0018]本發明的再一方面提供一種包含本發明所述克隆載體的表達系統。在一些實施方 式中，一個所述表達系統含有1-12個拷貝的克隆載體。在一些實施方式中，所述表達系統 為畢赤酵母細胞。在一些實施方式中，所述畢赤酵母細胞為畢赤酵母GS115、畢赤酵母X-33 或畢赤酵母PichiaPink。
[0019]本發明的再一方面提供一種制備門冬胰島素的方法，該方法包括：(a)培養本發 明所述的表達系統；(b)分離、富集得到門冬胰島素前體；（c)用胰蛋白酶或賴氨酰內切酶 進行轉肽，獲得門冬胰島素粗品；以及（d)純化獲得門冬胰島素。在一些實施方式中，在步 驟（a)之前，對本發明所述的表達系統進行篩選，以選擇出表達水平最高的表達系統，再培 養所篩選出的表達系統。
[0020] 在一個實施方式中，本發明提供一種制備門冬胰島素的方法，該方法包括：(a)培 養含有本發明編碼序列的畢赤酵母細胞，收集含門冬胰島素前體的發酵上清液；(b)大孔 樹脂富集門冬胰島素前體，冷凍干燥獲得干粉；（c)用胰蛋白酶或賴氨酰內切酶進行轉肽， 獲得門冬胰島素粗品；（d)用DEAE離子交換樹脂和C8介質純化獲得門冬胰島素純品。
[0021] 與原研藥和其他門冬胰島素表達技術相比，本發明具有以下優勢：
[0022] (1)產物表達量高的優勢：本發明首次設計了獨特的前導肽引導門冬胰島素的表 達，該前導肽是一段親水性的短肽，可以使表達產物在結構上更加穩定，免受宿主菌蛋白酶 的破壞，大大提高門冬胰島素前體的表達量。本發明還使用了啟動能力強的醇氧化酶啟動 子A0X1，分泌能力強的α-交配因子信號肽以及可高密度發酵培養的畢赤酵母表達宿主， 進一步增加了門冬胰島素前體的表達和分泌能力。使用本發明的表達方法，搖床培養門冬 胰島素前體最高表達可達150mg/L，20L發酵罐高密度培養時最高表達量可達5g/L。
[0023] (2)發酵表達產物純度高，雜質少的優勢：傳統門冬胰島素的表達方法，未添加前 導肽，存在以下兩方面的缺陷：（1)使門冬胰島素前體B鏈的第一個氨基酸（Phe)暴露于外 部環境中，容易被畢赤酵母的氨肽酶破壞，增加了雜質的含量。（2)當表達量過高時，由于畢 赤酵母的KEX2蛋白酶相對不足，從而使部分門冬胰島素前體的N末端殘留了 1-9個的α信 號肽的氨基酸殘基，也增加了雜質的含量。這些雜質與門冬胰島素的性質十分相似，難以去 除。本發明發酵表達產物純度高，且門冬胰島素前體的Ν末端存在前導肽，故不會產生Phe 缺失的雜質。另外，即使N末端殘留了部分α信號肽的氨基酸殘基，也會在制備過程中一 并切除。
[0024] (3)產物分泌到胞外培養基中，提取方法簡單的優勢：本發明產物以水溶性存在， 且分泌到胞外培養基中，通過過濾或離心方法很容易得到含門冬胰島素前體的上清液，然 后直接用于后續純化和制備。
[0025] (4)制備方法簡單，收率高的優勢：本發明只需要使用胰蛋白酶或賴氨酰內切酶 將門冬胰島素前體經過一步轉肽反應即可得到完整的門冬胰島素分子，