免疫結合劑的溶解性優化的制作方法
【專利說明】免疫結合劑的溶解性優化
[00011 本申請是申請號為200980123815.6的分案申請。
[0002]相關申請
[0003] 本申請要求于2008年6月25日提交的、名稱為"SolubilityOptimizationof Immunobinders" 的US61/075,692的優先權。
[0004]發明背景
[0005]已證明抗體在癌癥、自身免疫疾病和其他病癥的治療中是非常有效和成功的治療 劑。盡管一般已在臨床上使用全長抗體，但存在使用抗體片段可以提供的許多優點，例如增 加組織穿透力、與增加其他效應子功能的能力結合的Fc效應子功能的不存在、和由較短的 全身體內半衰期導致的較少全身性副作用的可能性。抗體片段的藥代動力學性質表明，它 們可能特別良好地適合于局部治療方法。此外，抗體片段在特定表達系統中可以比全長抗 體更容易產生。
[0006] -個類型的抗體片段是單鏈抗體(scFv)，其由經由接頭序列綴合的輕鏈可變結構 域(VL)與重鏈可變結構域(VH)組成。因此，scFv缺乏所有抗體恒定區結構域，并且先前的可 變/恒定結構域界面的氨基酸殘基(界面殘基)變成溶劑暴露的。scFv可以通過已建立的重 組改造技術由全長抗體(例如IgG分子)制備。然而，全長抗體轉變成scFv通常導致蛋白質的 弱穩定性和溶解性、低產量和高聚集趨勢，這增加免疫原性危險。
[0007] 因此，已嘗試改善scFv的性質例如溶解性。例如，Nieba，L.等人(Prot.Eng.(1997) 10:435-444)選擇已知為界面殘基的3個氨基酸殘基且使其突變。他們觀察到突變的scFv在 細菌中周質表達增加，以及熱誘導聚集速率減小，盡管熱力學穩定性和溶解性未顯著改變。 此外，在他們的公開物中，他們明確地陳述，他們未觀察到改造的scFv的天然蛋白質狀態的 任何溶解性的提高，如通過PEG沉淀法所測定的。其中對scFv內的特定氨基酸殘基進行定點 誘變的其他研究也已得到報告（參見例如，Tan，P.H.等人（1988)Biophys.J. 75:1473-1482; Worn，A.和Pluckthun，A.(1998)Biochem.37:13120-13127;Worn，A.和Pluckthun，A.(1999) Biochem. 38:8739-8750)。在這些各種研究中，選擇用于誘變的氨基酸殘基基于其在scFv結 構內的已知位置(例如，來自分子建模研究)進行選擇。
[0008]在另一種方法中，將來自表達極弱的scFv的互補決定區（CDR)移植到已證實具有 有利性質的scFv的構架區內（Jung，S·和Pluckthun，A· (1997)Prot·Eng· 10:959-966)。所得 到的scFv顯示改善的可溶性表達和熱力學穩定性。
[0009] 改造scFv以改善溶解性和其他功能性質中的進展在例如Worn，A.和Pluckthun，A. (2001)J.Mol.Bio1.305 :989-1010中綜述。然而，仍需要允許合理設計免疫結合劑 (immunobinder)，特別是具有優良溶解性的scFv的新方法。此外，仍需要改造scFv和其他類 型的抗體從而賦予改善的溶解性一尤其是天然蛋白質的溶解性的方法。
[0010] 發明概述
[0011]本發明提供了在可變重鏈區VH中包含溶解性增強基序的免疫結合劑以及改造免 疫結合劑例如scFv抗體以賦予改善的溶解性的方法。在特定的實施方案中，本發明的方法 包括用賦予改善的溶解性的優選氨基酸殘基置換免疫結合劑的重鏈可變區和/或輕鏈可變 區的序列內的對于溶解性潛在有問題的氨基酸。例如，在某些優選實施方案中，用親水性殘 基置換疏水性殘基。
[0012] 優選地，提供的免疫結合劑，在本發明的改造方法中使用的或由本發明的改造方 法產生的免疫結合劑是scFv，但其他免疫結合劑例如全長免疫球蛋白、Fab片段、單結構域 抗體(例如Dab)和納米抗體(Nanobody)也可以根據所述方法進行改造。本發明還包括根據 改造方法制備的免疫結合劑，以及包含所述免疫結合劑和藥學上可接受的載體的組合物。
[0013]在一個方面，本發明提供了免疫結合劑，所述免疫結合劑在重鏈氨基酸位置12、 103和144(AHo編號）中包含下列溶解性增強基序之一：
[0014] (a)重鏈氨基酸位置12處的絲氨酸(S);
[0015] (b)重鏈氨基酸位置103處的絲氨酸(S);和
[0016] (C)重鏈氨基酸位置144處的蘇氨酸(T);或
[0017] (al)重鏈氨基酸位置12處的絲氨酸(S);
[0018] (bl)重鏈氨基酸位置103處的蘇氨酸(T);和
[0019] (cl)重鏈氨基酸位置144處的絲氨酸(S);或
[0020] (a2)重鏈氨基酸位置12處的絲氨酸(S);
[0021] (b2)重鏈氨基酸位置103處的蘇氨酸(T);和
[0022] (c2)重鏈氨基酸位置144處的蘇氨酸(T);或
[0023] (a3)重鏈氨基酸位置12處的絲氨酸(S);
[0024] (b3)重鏈氨基酸位置103處的絲氨酸(S);和
[0025] (c3)重鏈氨基酸位置144處的絲氨酸(S)。
[0026]在另一個方面，本發明提供了改造免疫結合劑的方法，免疫結合劑包含（i)重鏈可 變區或其片段，其中重鏈可變區包含Vh構架殘基和/或（ii)輕鏈可變區或其片段，其中輕鏈 可變區包含I構架殘基，所述方法包括：
[0027]A)選擇VH構架殘基、VL構架殘基或VH和VL構架殘基中的至少兩個氨基酸位置以用 于突變;和
[0028] B)突變選擇用于突變的所述至少兩個氨基酸位置，
[0029]其中，如果選擇用于突變的所述至少兩個氨基酸位置在VH構架殘基中，那么置換 在選自12、103和144(根據AHo編號約定)的一個或多個重鏈氨基酸位置上，和/或
[0030]其中，如果選擇用于突變的一個或多個氨基酸位置在I構架殘基中，那么置換在 選自15、52和147(根據AHo編號約定;在使用Kabat編號的情況下，氨基酸位置15、44和106) 的輕鏈氨基酸位置上。
[0031]在下文中進一步詳細描述選擇用于突變的所述至少兩個氨基酸位置以及在選擇 的位置處插入的氨基酸殘基。下文中所示的氨基酸位置編號使用AHo編號系統;使用Kabat 編號系統的相應位置在本文中進一步描述，并且AHo和Kabat編號系統的轉換表在下文的發 明詳述中闡述。使用標準單字母縮寫代碼闡述氨基酸殘基。
[0032]令人驚訝地發現，在指定的位置上指定的突變的存在增加了免疫結合劑的總體溶 解性而不對蛋白質的其他功能性質產生負面影響。例如，在scFv的VH中3個增強溶解性的突 變V12S、L144S和V103T組合的情況下，發現所述置換占整個scFv的溶解性的約60%。這與現 有技術中陳述的增加免疫結合劑的表達產量的嘗試不同。例如，US6，815，540描述通過減少 鏈內結構域間界面區域中的疏水性對免疫結合劑進行改進。為了所述目的，鑒定了重鏈可 變構架中的16個位置，所述位置可單獨地用選自10個氨基酸的一個或多個氨基酸置換。發 現產生的突變體的表達產量增加。此外，相同的研究組于1999年，即所提及的美國專利的優 先權日期后3年，發表了論文（參見幾1^，3.，!1〇1168861'，4.和？111〇1^1:111111，4.(1997) Prot.Eng. 10 :959-966)，該論文陳述，已在幾個研究中報導用更加親水的殘基置換疏水性 表面殘基提高了產量。根據該作者，產量的增加歸因于正確折疊與錯誤折疊材料的聚集之 間的改善的動力學分配，同時天然蛋白質的溶解性不受影響，其熱力學穩定性也未受到顯 著影響。因此，對于本領域技術人員來說很顯然的是，Plilckthun等人所提及的溶解性參數 只涉及可溶性表達而非天然蛋白質的總體溶解性。
[0033]附圖概述
[0034]當考慮本文的下列詳細描述時，本發明將得到更好的理解，并且除上文所述的那 些外的目的將變得顯然。此類描述參考附圖，其中：
[0035] 圖1描述了野生型ESBA105(E105)和其溶解性變體的PEG沉淀溶解性曲線。
[0036]圖2描述了野生型ESBA105(E105)及其溶解性變體的熱變性曲線圖，如在廣泛溫度 范圍（25-96°C)下的熱攻擊后測量的。
[0037]圖3描述了SDS-PAGE凝膠，其顯示了在熱脅迫條件下溫育2周后各種ESBA10 5溶解 性突變體的降解行為。
[0038]圖4描述了EP43max和其優化的變體的熱變性曲線，如通過FTIR分析測定的。
[0039] 圖5描述了 578min-max和578min-max_DHP的熱穩定性，如通過FT-IR測量的。
[0040] 圖6a和6b說明了通過硫酸銨沉淀測量的578min_max和578min_max_DHP的溶解性。
[00411發明詳述
[0042] 本發明涉及用于增加免疫結合劑的溶解性的方法。更具體地，本發明公開了通過 在免疫結合劑中引入改善免疫結合劑的溶解性的氨基酸置換來優化免疫結合劑的方法。本 發明還涉及根據本發明的方法產生的經改造的免疫結合劑例如scFv。
[0043] 為了可更容易地理解本發明，首先定義某些術語。除非另外指出，本文中使用的所 有技術和科學術語具有與本發明所屬領域內的技術人員通常理解的意義相同的意義。雖然 與本文中描述的方法和材料相似或等同的方法和材料可用于本發明的實踐或試驗中，但下 面描述了適當的方法和材料。本文中提及的所有公開物、專利申請、專利和其他參考資料以 它們的全文通過引用合并入本文。在矛盾的情況下，以本說明書(包括定義)為準。此外，材 料、方法和實施例只是舉例說明性的而非限定性的。
[0044]本文中使用的術語"抗體"是免疫球蛋白的同義詞。根據本發明的抗體可以是完整 的免疫球蛋白或其片段，其包括免疫球蛋白的至少一個可變結構域，例如單個可變結構域， Fv(SkerraA.和Pluckthun，A.(1988)Science240:1038-41)、scFv(Bird，R.E·等人（1988) Science242:423-26;Huston，J·S·等人（1988;Proc·Natl·Acad·Sci·USA85:5879-83)， Fab、（Fab'）2、或本領域技術人員熟知的其他片段。
[0045]本文中使用的術語"抗體構架(antibodyframework)"或"構架"是指可變結構域VL或VH的一部分，其用作該可變結構域的抗原結合環的支架（Kabat，E.A.等人，（1991) Sequencesofproteinsofimmunologicalinterest.NIHPublication91-3242)。
[0046]本文中使用的"抗體⑶R"或"CDR"是指抗體的互補決定區，其如KabatE.A.等人， (1991)Sequencesofproteinsofimmunologicalinterest.NIHPublication91-3242)定義的由抗原結合環組成。抗體Fv片段的兩個可變結構域中的每一個包含例如3個CDR〇
[0047]術語"單鏈抗體"或"scFv"意指包含通過接頭連接的抗體重鏈可變區（VH)和抗體 輕鏈可變區（Vl)的分子。此類scFv分子可具有一般結構:NH2-Vl-接頭-Vh-⑶0H或NH2-Vh_接 頭-Vl-C00H〇
[0048]如本文中所使用的，"同一性"是指兩個多肽、分子之間或兩個核酸之間匹配的序 列。當兩個進行比較的序列中的位置都被相同的堿基或氨基酸單體亞單元占據(例如，如果 兩個DNA分子的每一個中的位置都被腺嘌呤占據，或兩個多肽的每一個中的位置都被賴氨 酸占據)時，各個分子在該位置上是同一的。兩個序列之間的"百分數同一性"是由這兩個序 列共有的匹配位置的數目除以進行比較的位置的數目再乘以100的函數。例如，如果兩個序 列的10個位置中有6個匹配，那么這兩個序列具有60%的同一性。例