專利名稱：一種檢測新城疫病毒的熒光抗體的制備方法及固相免疫熒光檢測試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種檢測新城疫病毒的熒光抗體的制備方法及固相免疫熒光檢測試 劑盒，屬于免疫熒光檢測領域。
背景技術：
新城疫是嚴重危害養殖業的烈性傳染病，被國際獸醫局列為A類動物傳染病，同 時它還是人獸共患病，威脅人類的公共衛生安全。新城疫病毒檢測是禽類及其動物性制品 出入境檢驗檢疫的必檢項目，國際獸醫局要求禽類及其動物制品中一旦檢出新城疫病毒必 須就地銷毀。快速、靈敏的檢測方法對疫病的及時確診、疫情的有效防控及預測、預警至關 重要。目前新城疫的檢測方法主要有(1)病毒分離鑒定；(2)血清學檢測，如HA-HI等；(3) 分子生物學檢測，如RT-PCR等。但是，上述檢測方法各有優缺點，如病毒分離和血清學鑒定 耗時長，血清學檢測需要發病初期和康復期雙份血清，PCR檢測靈敏度高，對實驗條件和操 作者技術水平要求較高，常用的HA-HI法簡便易行，但靈敏度低。免疫熒光檢測法是一種歷史悠久的標記分析方法，兼具抗原_抗體反應的特異性 和熒光檢測的靈敏性，靈敏度高達10-6mg/mL，廣泛應用于傳染病診斷。免疫熒光檢測法的 特異性和敏感性依賴于抗體的特異性、親和力、滴度以及熒光染料的特性。熒光檢測常受 血清和其他生物樣品中本底熒光的影響。以血清為例，400-600nm波段的本底熒光與常用 的FITC的熒光發射光譜相重疊，干擾過大，影響檢測結果；另一方面，傳統的熒光染料(如 FITC等)具有毒性、易淬滅，上述因素造成長期以來免疫熒光分析方法相對落后于ELISA、 化學發光法等標記法。提高免疫熒光檢測法靈敏度和特異性的途徑有(1)尋找優秀的熒 光染料，如選用摩爾消光系數大、熒光量子產率高、斯托克位移大、發射紅色熒光的染料； (2)結合使用單克隆抗體、抗體夾心法、抗體包被技術、微粒富集熒光免疫分析法等免疫學 技術；(3)采用固相檢測法，如以惰性材料微球、96孔板等為固相載體。固相免疫熒光檢 測法可用于檢測可溶性抗原或抗體，常規的固相載體如尼龍膜、硝酸纖維素膜、醋酸纖維素 膜、96孔板等通常具備較低的本底熒光，會干擾或降低熒光檢測的靈敏度。本發明采用的固 相載體為一種微球，由瓊脂糖經溴化氰活化制備，無本底熒光，由于球形載體的表面積大， 具有信號富集作用，能顯著提高熒光檢測的靈敏度。藻紅蛋白是紅藻細胞中的一類主要的水溶性的光合色素蛋白，能夠發出明亮的桔 黃色熒光，與傳統的熒光染料相比，藻紅蛋白具有水溶性、無毒性、摩爾消光系數大、熒光量 子產率高、斯托克位移大、發射桔黃色熒光、背景光干擾小、不易淬滅等特點，是一類理想的 熒光染料。多管藻是我國沿海分布較廣的野生海洋紅藻，含有大量的典型的三峰型R-藻 紅蛋白(R-phycoerythrin, RPE)，RPE的穩定態為(α β)6γ , RPE的組成和晶體結構特點 決定了其高穩定性。多管藻RPE的分子量約為240kDa，最大吸收波長分別位于498、540、 565nm,最大熒光發射峰位于575nm。1個多管藻RPE分子含有34個色基，摩爾消光系數為 24. 1 X IO5Cm-1M-1，熒光量子產率為82 %，1分子的藻紅蛋白的熒光強度在可比波長內至少相
4當于30個FITC或100個羅丹明分子，藻紅蛋白的斯托克位移高達75nm，且發射熒光位于近 紅光區，因而背景光干擾小，有助于提高熒光檢測的靈敏度，藻紅蛋白熒光檢測的靈敏度是 FITC的5-10倍。而傳統的熒光染料(如FITC等)的斯托克位移小，發射熒光與激發光譜 部分重疊，生物質本底熒光干擾嚴重。藻紅蛋白的發現和應用使免疫熒光檢測法的靈敏度 顯著提高。藻紅蛋白優于傳統的合成熒光染料，可取代FITC用于免疫熒光檢測或配合FITC 使用實現單一激發光源下的雙色熒光鑒別檢測。RPE等熒光染料用于熒光檢測時需與抗體等生物大分子交聯成熒光抗體探針，蛋 白質交聯時普遍存在難以定量控制的缺點，往往造成熒光標記物的得率低，標記物中混雜 有大量的未結合的熒光染料，導致標記物的生產成本居高不下，熒光檢測靈敏度降低。而且 交聯劑濃度多高還會導致熒光染料結構改變、蛋白活性損失甚至熒光喪失，同時交聯劑濃 度過高還會影響抗體的免疫活性，因此選擇適宜的交聯劑種類、交聯劑的濃度、交聯方法等 直接影響熒光探針的質量，從而影響熒光檢測的靈敏度。化學交聯劑SPDP為異型雙功能化 學交聯劑，反應條件溫和，引入的化學基團具有吸光性，利于交聯過程的控制。通過控制適 宜的摩爾比進行RPE與抗體的液相交聯，能使研制的熒光標記物交聯得率大于90%，探針 的效率、質量顯著提高，成本大幅降低，促進其用于疾病的免疫熒光檢測。

發明內容
本發明涉及一種檢測新城疫病毒的熒光抗體的制備方法及固相免疫熒光檢測試劑盒。本發明設計的檢測新城疫病毒的熒光抗體使用的多管藻R-藻紅蛋白(RPE)為三 峰型藻紅蛋白，在498nm處有強吸光性，最大熒光發射峰位于575nm，在藍綠光激發下，RPE 能發射明亮的桔黃色熒光，因此多管藻RPE優于其它來源的三峰型和二峰型藻紅蛋白，它 具有無毒性、水溶性大、熒光明亮且不易淬滅、穩定性高等優點，檢測靈敏度顯著高于傳統 的熒光染料，是優秀的熒光染料。以異型雙功能化學交聯劑SPDP將RPE、抗體衍生后以適當 摩爾比液相交聯，制備的RPE標記的熒光抗體交聯效率高、純度高、熒光明亮、抗體活性好、 穩定性好。本發明涉及的固相免疫熒光檢測試劑盒使用的固相載體為一種微球，由瓊脂糖經 溴化氰活化制備，凍干保存，微球直徑為60-200um，無本底熒光，購自Amersia公司。該微 球載體在使用前需用ImM稀鹽酸溶液溶脹30min，以同樣濃度的鹽酸沖洗多次，最后用50mM PH 8PBS(含IOOmM NaCl)快速沖洗得到活化凝膠。活化的微球應立即與抗體或抗原結合。本發明的解決方案如下RPE制備采用陰離子交換層析法從海洋紅藻_多管藻中分離純化。取冷凍保存 的多管藻，加入6倍體積的20mM醋酸緩沖液(pH5. 8)，4°C下溶脹24h，多層紗布過濾、擠壓 獲得褐色浸提液，浸提液中加入固體硫酸銨至濃度為60% (w/v)，4°C放置24h，離心收集沉 淀，將沉淀溶于20mM的醋酸緩沖液(pH5. 8)中，然后用20mM的醋酸緩沖液(pH5. 8)透析，透 析液陰離子交換純化，DEAE Sepharose Fast Flow柱用20mM醋酸緩沖液(pH5. 8)(含50mM NaCl)預平衡，用20mM醋酸緩沖液(pH5. 8)沖洗掉陰離子交換柱上過量的樣品和雜質，用 20mM醋酸緩沖液(pH4. 0)(含50mMNaCl) —步洗脫可得到大量純的RPE，純化的多管藻RPE 純度達電泳純，純度指數A62tZA28tl >5. 2，結構式為(α 3)6[分子量約為2401^^，最大吸收峰分別位于498、540、565nm，室溫熒光發射峰位于575nm，純化的RPE硫酸銨沉淀4°C避光 保存，使用前用50mM pH7. 5PBS充分透析除鹽，調整濃度為10mg/mL。新城疫病毒多克隆抗體制備新城疫病毒La Sota株IO4倍稀釋，尿囊腔接種9-10 日齡SPF雞胚，每胚0. 2mL，37-38°C孵育，收集接種24_120h的死胚、存活胚的尿囊液，紅細 胞凝集試驗檢測滴度>1 256，無菌檢驗合格，以0.3%甲醛37°C滅活24h，按1 3比例 加入滅菌10號白油和吐溫-80，用膠體磨乳化成油包水型油乳劑滅活疫苗。制備的新城疫 油乳劑滅活苗免疫4周齡SPF雞，頸部皮下注射1. OmL/只，首免10天后相同劑量加強免疫 一次，二免1周后采血，測定血清中新城疫病毒HI抗體，當HI效價> 1 256時采集血清， 陰離子交換層析純化得到抗新城疫病毒多克隆抗體，-20°C冷凍保存。RPE標記熒光抗體的制備利用異型雙功能交聯劑SPDP分別在RPE、抗體上衍生吡 啶二硫基團，然后用DTT還原抗體的衍生物引入游離-SH，將攜帶吡啶二硫基的RPE與攜帶 巰基的抗體按一定摩爾比交聯制備熒光抗體。將SPDP按50-100 1的摩爾比分別與RPE、 抗體混勻，鋁箔封好后于室溫旋轉反應2h，超濾離心除去多余的SPDP。取DTT按50-100 1 的摩爾比與抗體衍生物充分混勻，室溫靜置反應lh，超濾離心除去多余的DTT。抗體-HS與 RPE衍生物以摩爾比1 1混勻，鋁箔封好后于20-25°C振蕩反應20h。加NEM封閉多余巰 基，室溫旋轉反應60min。RPE標記的熒光抗體的純化采用HPLC法，液相色譜工作站上進行。采用分子篩高 壓液相色譜柱純化，液相柱型號TSK G3000SW(規格7. 5mmX60cm)，流動相為50mM PBS pH 了^，流速化日！^/！！^！！，檢測波長丨卯^。。!!!!!。熒光標記抗抗體最先被洗脫下來。收集第一個 洗脫峰，進行光譜學、抗體活性、電泳檢測。目標產物的洗脫峰面積占所有洗脫峰面積的比 例即為交聯效率。RPE標記熒光抗體的光譜檢測吸收光譜在紫外_可見光分光光度計上測定，掃描 波長區間250-700nm。吸收光譜檢測可判定交聯是否成功及交聯反應是否導致RPE變性。室 溫熒光發射光譜在熒光分光光度計上測定，激發波長498nm，熒光掃描范圍為520-700nm。 在紫外區，RPE標記熒光抗抗體的吸光度明顯高于對照RPE，吸收峰位置相同，這是因為RPE 表面交聯了抗體分子，而抗抗體在280nm有較強的光吸收；在400-700nm范圍內，交聯物的 吸收光譜與對照RPE的吸收峰及吸光度相似，是由于抗體在此范圍內無光吸收。RPE標記光 抗體與對照RPE在498nm激發光的激發下，室溫熒光發射波長均位于575nm，沒有發生斯托 克位移的改變，仍具有RPE的特征熒光發射光譜，且熒光亮度無明顯降低。RPE標記熒光抗體的效價檢測抗體效價采用微量血凝抑制試驗方法(HI)測定。 用滅活的對應新城疫尿囊毒制備4單位檢測抗原，反應在V型96孔板上進行。以紅細胞凝 集抑制的最高稀釋度為熒光抗體的效價。熒光標記抗體的HI效價應 16，濃度低時可 通過離心超濾濃縮。RPE標記熒光抗體的電泳檢測=SDS-PAGE在垂直板不連續電泳裝置上進行，分離 膠濃度為12.5%，濃縮膠濃度為5 %，218V恒壓電泳，考馬斯亮藍R-250染色，脫色后觀察結 果。電泳發現RPE標記熒光抗體既具有RPE的α、β、γ亞基條帶，又具有抗體的H、L鏈 條帶，表明RPE與抗體交聯成功。RPE標記熒光抗體的穩定性檢測純化的RPE標記熒光抗體中加入0. 02%疊氮 化鈉，4°C避光保存，每隔30天測定-次熒光光譜和抗體效價，室溫熒光發射光譜在熒光分光光度計上測定，抗體效價采用血凝抑制試驗方法測定，觀察熒光亮度和抗體活性的變化。 RPE標記的熒光抗體穩定性較好，在0. 05mol/L的磷酸緩沖液中4°C保存120天，熒光抗體 的熒光強度未出現降低，熒光抗體的抗體效價維持在1 32。固相免疫熒光檢測試劑盒組裝及使用固相免疫熒光檢測試劑盒由溴化氰活化的 瓊脂糖微球載體、RPE標記的抗新城疫病毒熒光抗體、抗新城疫病毒多克隆抗體、洗滌液、稀 鹽酸等組成。固相免疫熒光檢測試劑盒的使用方法為微球載體使用時需用稀鹽酸溶脹， 取0. 3g溴化氰活化的瓊脂糖凝膠凍干粉，置于ImM鹽酸中溶漲30min，以同樣濃度的鹽酸 沖洗5次，用50mM pH 8PBS (含IOOmMNaCl)快速沖洗得到ImL活化凝膠，立即與2mL濃度 為5mg/ml的抗新城疫病毒多克隆抗體混勻，20°C緩慢振蕩作用12h，加入2mL 0. IM的乙醇 胺封閉，20°C緩慢振蕩作用4h，離心去上清，用50mM pH 8PBS反復沖洗凝膠，離心獲得偶聯 有抗體的瓊脂糖凝膠，用IOOmM pH 7. 5的PBS配成10% (ν/ν)的懸浮液。取偶聯有抗新 城疫病毒抗體的瓊脂糖凝膠50uL，置于潔凈的試管中，加待檢病毒液100uL，37°C溫育2h， 用IOOmM pH7. 5的PBS沖洗10次。加入5ug/ml濃度的熒光抗體100uL，37°C溫育2h，用 IOOmM pH 7. 5的PBS沖洗5次。吸取少量微球，滴于低熒光背景的玻片上，蓋片，甘油緩沖 液封片，熒光顯微鏡下以藍綠光激發，觀察、判定結果。陽性微球在紅光激發下發射明亮的 桔黃色熒光，陰性微球無熒光。將熒光強度與背景染色強度以+表示，分為++++(最強陽 性)、+++(強陽性)、++(較強陽性)、+(弱陽性)、_(陰性)五級。熒光強度達到++以上 判定為陽性。試驗設SPF雞血清陰性對照和PBS空白對照。敏感性、特異性、重復性檢測(1)以PBS將新城疫病毒連續稀釋，利用固相免疫熒 光檢測試劑盒對各稀釋度逐一進行熒光檢測，以能檢測出的病毒最高滴度作為檢測的靈敏 度。(2)分別以禽流感病毒、傳染性支氣管炎病毒、傳染性法氏囊病病毒、傳染性喉氣管炎病 毒、雞痘病毒等取代新城疫病毒，按上述固相免疫熒光檢測試劑盒進行熒光檢測，在藍綠光 激發下均未檢測到熒光，證明試劑盒的特異性好。(3)利用試劑盒對同一個稀釋度的新城疫 病毒樣品重復檢測3次，結果一致，表明試劑盒的重復性較好。與FITC標記熒光抗體檢測新城疫病毒比較純化的新城疫抗體用50mM pH 9的碳 酸緩沖液透析過夜，調整濃度為10mg/ml。用上述碳酸緩沖液配制0. lmg/ml的FITC。將抗 體置于10倍抗體體積的FITC溶液中4°C緩慢攪拌透析24h，然后迅速將標記抗體置于50mM PH 7. 2的磷酸緩沖液透析，經常更換緩沖液。以FITC標記的抗體探針代替RPE標記的抗體 探針，用建立的固相免疫熒光檢測法對新城疫病毒檢測。總之，RPE標記的熒光抗體熒光明亮，長期保存無明顯衰減，與FITC標記的熒光抗 體相比，熒光更明亮，靈敏度更高，受生物質本底熒光干擾小。本發明采用的微球載體自身 無本底熒光，不會干擾熒光檢測結果，而且由于球形載體的表面積大，能包被更多的抗體或 抗原，從而結合更多的熒光探針，利于信號富集，能夠提高免疫熒光檢測的靈敏度。與硝酸 纖維膜、96孔板等現有固相載體相比，本底熒光干擾更小，熒光更亮，檢測靈敏度更高。


附圖1為RPE標記抗新城疫病毒熒光抗體的HPLC純化圖。液相柱型號為TSK G3000sw，流動相為50mM pH7. 5的PBS，流速0. 5mL/min, RPE標記抗新城疫病毒熒光抗體、 抗新城疫病毒抗體、RPE的洗脫時間為分別為19. 57min、27. 32,31. 26min。
附圖2為RPE標記熒光抗體(虛線)及RPE (實線)的熒光光譜。RPE標記熒光抗 體與對照RPE在498nm激發光的激發下，室溫熒光發射波長均位于575nm，沒有發生斯托克 位移改變，仍具有RPE的特征熒光發射光譜。附圖3為RPE標記抗新城疫病毒熒光抗體的SDS-PAGE電泳結果。RPE標記熒光抗 體既具有RPE的α、β、γ亞基條帶，又具有抗體的H、L鏈條帶。附圖4為RPE標記熒光抗體固相免疫熒光檢測結果。RPE標記熒光抗體陽性微球 發射明亮桔黃色熒光，而陰性微球檢測不到熒光。
具體實施例方式RPE制備冷凍保存的多管藻加入6倍體積的20mM醋酸緩沖液(pH5. 8)，4°C下溶 脹24h，多層紗布過濾、擠壓獲得褐色浸提液，浸提液加入固體硫酸銨至濃度為60% (w/v), 4°C放置24h，離心收集沉淀，將沉淀溶于20mM的醋酸緩沖液(pH5. 8)中，然后用20mM的醋 酸緩沖液(PH5. 8) 4°C透析過夜，透析液加到用20mM醋酸緩沖液(pH5. 8)(含50mM NaCl)預 先平衡的DEAE Sepharose Fast Flow陰離子交換柱，用20mM醋酸緩沖液(pH5. 8)沖洗掉 陰離子交換柱上過量的樣品和雜質，用20mM醋酸緩沖液(pH4. 0)(含50mM NaCl) 一步洗脫 就可得到大量純的RPE，純化的多管藻RPE純度達電泳純，純度指數A62tlA28tl >5.2,結構式 為(α β)6Υ，分子量約為240kDa，最大吸收峰分別位于498、540、565nm，室溫熒光發射峰位 于575nm，純化的RPE硫酸銨沉淀4°C避光保存，使用前用50mM pH7. 5PBS充分透析除鹽，調 整濃度為10mg/mL。新城疫病毒多克隆抗體制備新城疫病毒La Sota株IO4倍稀釋，尿囊腔接種9-10 日齡SPF雞胚，每胚0. 2mL，37-38°C孵育，收集接種24_120h的死胚、存活胚的尿囊液，紅細 胞凝集試驗檢測滴度>1 256，無菌檢驗合格，以0.3%甲醛37°C滅活24h，按1 3比例 加入滅菌10號白油和吐溫-80，用膠體磨乳化成油包水型油乳劑滅活疫苗。制備的新城疫 油乳劑滅活苗免疫4周齡SPF雞，頸部皮下注射1. OmL/只，首免10天后相同劑量加強免疫 一次，二免1周后采血，測定血清中新城疫病毒HI抗體，當HI效價> 1 256時采集血清， DEAE Sepharose Fast Flow陰離子交換層析純化，50mM pH7PBS+0_lM NaCL梯度洗脫得到 純的抗新城疫病毒多克隆抗體，-20°C冷凍保存。RPE標記新城疫病毒抗體熒光探針的制備SPDP按100 1的摩爾比分別與RPE、 新城疫病毒抗體混勻，鋁箔封好后于室溫旋轉反應2h，超濾離心除去多余的SPDP。取DTT 按100 1的摩爾比與新城疫病毒抗體衍生物充分混勻，室溫靜置反應lh，超濾離心除去多 余的DTT。新城疫病毒抗體-HS與RPE衍生物以摩爾比1 1混勻，鋁箔封好后于20-25°C 振蕩反應20h。用10mg/ml的NEM溶液20ul封閉多余巰基，室溫旋轉反應60min。反應中 的NEM不用除去。RPE標記的熒光抗體的純化和交聯效率分析液相色譜工作站上采用HPLC法 進行熒光抗體的交聯效率分析和純化，分子篩高壓液相色譜柱型號TSK G3000SW(規格 7. 5mm X 60cm)，流動相為 50mM PBS pH7. 5，流速 0. 5mL/min，檢測波長 190_800nm。熒光標記 抗抗體于19.57min最先被洗脫下來。收集第一個洗脫峰。目標產物的洗脫峰面積占所有 洗脫峰面積的比例即為交聯效率，分析表明熒光探針的交聯得率為95%。RPE標記熒光抗體的光譜檢測吸收光譜在紫外_可見光分光光度計上測定，掃描波長區間250-700nm。吸收光譜檢測可判定交聯是否成功及交聯反應是否導致RPE變性。室 溫熒光發射光譜在熒光分光光度計上測定，激發波長498nm，熒光掃描范圍為520-700nm。 在紫外區，RPE標記熒光抗體的吸光度高于對照RPE，吸收峰位置相同，這是因為RPE表面交 聯了抗體分子，而抗體在280nm有較強的光吸收；在400-700nm范圍內，交聯物的吸收光譜 與對照RPE的吸收峰及吸光度相似，是由于抗體在此范圍內無光吸收。RPE標記光抗體與對 照RPE在498nm激發光的激發下，室溫熒光發射波長均位于575nm，沒有發生斯托克位移的 改變，仍具有RPE的特征熒光發射光譜，且熒光亮度無明顯降低。RPE標記熒光抗體的效價檢測抗體效價采用微量血凝抑制試驗方法(HI)測定。 用滅活的對應新城疫尿囊毒制備4單位檢測抗原，反應在V型96孔板上進行。以紅細胞凝 集抑制的最高稀釋度為熒光抗體的效價。熒光標記抗體的HI效價為1 32。RPE標記熒光抗抗體的電泳檢測=SDS-PAGE在垂直板不連續電泳裝置上進行，分 離膠濃度為12. 5%，濃縮膠濃度為5%。恒壓電泳，電壓為218V。用0. 25% (w/v)考馬斯亮 藍R-250染色，脫色后觀察結果。SDS-PAGE電泳發現RPE標記熒光抗體既具有RPE的α、 β、Y亞基條帶，又具有抗體的H、L鏈條帶，電泳結果證實RPE與抗體交聯成功。RPE標記熒光抗體的穩定性檢測純化的RPE標記熒光抗體中加入0. 02%疊氮化 鈉，4°C避光保存，每隔30天測定一次熒光光譜和抗體效價，室溫熒光發射光譜在熒光分光 光度計上測定，抗體效價采用血凝抑制試驗方法測定，觀察熒光亮度和抗體活性的變化。保 存試驗證實研制的RPE標記的熒光抗體穩定性好。RPE標記熒光抗體在0. 05mol/L的磷 酸緩沖液中4°C保存120天，熒光抗體的熒光強度保持不變，熒光抗體的抗體效價維持在 1 32，未出現降低。固相免疫熒光檢測試劑盒組裝及使用固相免疫熒光檢測試劑盒由溴化氰活化的 瓊脂糖微球載體、RPE標記的抗新城疫病毒熒光抗體、抗新城疫病毒多克隆抗體、洗滌液、稀 鹽酸等組成。固相免疫熒光檢測試劑盒的使用方法為微球載體使用時需用稀鹽酸溶脹， 取0. 3g溴化氰活化的瓊脂糖凝膠凍干粉，置于ImM鹽酸中溶漲30min，以同樣濃度的鹽酸沖 洗5次，用50mM pH 8PBS (含IOOmM NaCl)快速沖洗得到ImL活化凝膠，立即與2mL濃度為 5mg/ml的抗新城疫病毒多克隆抗體混勻，20°C緩慢振蕩作用12h，加入2mL 0. IM的乙醇胺 封閉，20°C緩慢振蕩作用4h，離心去上清，用50mM pH 8PBS反復沖洗凝膠，離心獲得偶聯有 抗體的瓊脂糖凝膠，用IOOmM pH 7. 5的PBS配成10% (ν/ν)的懸浮液。取偶聯有抗體的瓊 脂糖凝膠50uL，置于潔凈的試管中，加待檢病毒液100uL，37°C溫育2h，用IOOmM pH 7. 5的 PBS沖洗10次。加入5ug/ml濃度的熒光標記抗體lOOuL，37°C溫育2h，用IOOmM pH 7. 5的 PBS沖洗5次。吸取少量微球，滴于低熒光背景的玻片上，蓋片，甘油緩沖液封片，熒光顯微 鏡下以藍綠光激發，觀察、判定結果。陽性微球在紅光激發下發射明亮的桔黃色熒光，陰性 微球無熒光。將熒光強度與背景染色強度以+表示，分為++++(最強陽性)、+++(強陽性)、 ++(較強陽性)、+(弱陽性)、_(陰性)五級。熒光強度達到++以上判定為陽性。試驗設 SPF雞血清陰性對照和PBS空白對照。在藍綠光激發下陽性微球呈明亮的桔黃色熒光，陰性 結果無熒光。制備新城疫病毒尿囊毒，測定病毒的紅細胞凝集價為29，EID50為10_7 2，病毒的蛋 白濃度為40. 3mg/mL。以PBS將尿囊毒連續稀釋，利用建立的固相免疫熒光法對每個稀釋度 逐一進行熒光檢測。試劑盒能檢測出新城疫病毒的最低濃度為4. 03X 10-7mg/mlο
分別以禽流感病毒、傳染性支氣管炎病毒、傳染性法氏囊病病毒、傳染性喉氣管炎 病毒、雞痘病毒等取代新城疫病毒，按上述固相免疫熒光檢測試劑盒進行熒光檢測，在藍綠 光激發下均未檢測到熒光，證明試劑盒的特異性好。利用固相免疫熒光檢測試劑盒對同一個稀釋度的新城疫病毒樣品重復檢測3次， 結果一致，表明檢測試劑盒的重復性較好。FITC標記抗體熒光探針檢測新城疫病毒純化的新城疫病毒抗體用50mM pH 9的 碳酸緩沖液透析過夜，調整濃度為10mg/ml。用上述碳酸緩沖液配制0. lmg/ml的FITC。將 抗體置于10倍抗體體積的FITC溶液中4°C緩慢攪拌透析24h，然后迅速將標記抗體置于 50mM pH 7. 2的磷酸緩沖液透析，經常更換緩沖液。以FITC標記的抗體探針代替RPE標記 的抗體探針，用固相免疫熒光檢測試劑盒檢測新城疫病毒。FITC標記探針檢測陽性微球在 藍光激發下發射綠色熒光，能檢測出新城疫的最低濃度為4. 03X 10_6mg/ml，靈敏度比RPE 標記探針低10倍。表IRPE標記抗體熒光探針檢測新城疫病毒
權利要求
一種檢測新城疫病毒的熒光抗體的制備方法，包括陰離子交換層析法純化多管藻RPE，用摩爾比50 100∶1的化學交聯劑SPDP分別將RPE、抗新城疫病毒抗體衍生，DTT以50 100∶1的摩爾比還原抗體衍生物產生游離 HS，抗體 HS與RPE衍生物以摩爾比1∶1液相交聯，經HPLC純化制備RPE標記的抗新城疫病毒熒光抗體，本發明制備的RPE標記的抗新城疫病毒熒光抗體純度高、桔黃色熒光明亮、性質穩定，可用于新城疫病毒的快速、鑒別檢測。
2.根據權利要求1的方法，其中RPE的制備由多管藻中采用陰離子交換層析法分離純 化，制備過程為取冷凍保存的多管藻，加入20mM醋酸緩沖液(pH5. 8)，4°C下溶脹24h，多層 紗布包裹、擠壓、過濾獲得褐色浸提液，浸提液加入固體硫酸銨至濃度為60% (w/v)，4°C放 置24h，離心收集沉淀，將沉淀溶于20mM的醋酸緩沖液(pH5. 8)中，然后對20mM的醋酸緩沖 液(PH5. 8)透析，透析液加到用20mM醋酸緩沖液(pH5. 8)(含50mM NaCl)預平衡的陰離子 交換柱，用20mM醋酸緩沖液(pH5. 8)沖洗掉陰離子交換柱上過量的樣品及雜質，用20mM醋 酸緩沖液(PH4. 0)(含50mM NaCl) 一步洗脫就可得到大量純的RPE，純化的多管藻RPE純度 達電泳純，純度指數A62tlA28tl >5. 2，結構式為(α 0)6^，分子量約為2401^ 最大吸收峰分 別位于498、540、565nm，室溫熒光發射峰位于575nm，純化的RPE硫酸銨沉淀4°C避光保存， 使用前用50mM pH7. 5PBS充分透析除鹽，調整濃度為5mg/mL。
3.根據權利要求1的方法，其中抗新城疫病毒抗體采用滅活的新城疫病毒抗原免疫 SPF雞，經陰離子交換層析純化制備，制備過程為新城疫病毒IO4倍稀釋，尿囊腔接種9-11 日齡SPF雞胚，每胚0. 2mL，37-38°C孵育，收集接種24_120h的死胚、存活胚的尿囊液，紅細 胞凝集試驗檢測滴度>1 256，無菌檢驗合格，以0.3%甲醛37°C滅活24h，再按1 3比 例加入滅菌10號白油和吐溫-80，用膠體磨乳化成油包水型油乳劑滅活疫苗，制備的禽流 感病毒油乳劑滅活苗免疫4周齡SPF雞，頸部皮下注射1. OmL/只，首免10天后相同劑量加 強免疫一次，二免1周后采血，測定血清中新城疫病毒HI抗體，當HI效價> 1 256時采 集血清，陰離子交換層析純化，電泳鑒定無雜帶，即為合格的新城疫病毒多克隆抗體，"200C 冷凍保存。
4.根據權利要求1的方法，其中熒光抗體采用化學交聯法制備，制備過程為SPDP按 50-100 1的摩爾比分別與RPE、抗體混勻，鋁箔封好后于室溫旋轉反應2h，超濾離心除去 多余的SPDP，DTT按50-100 1的摩爾比與抗體衍生物充分混勻，室溫靜置反應lh，超濾 離心除去多余的DTT，抗體-HS與RPE衍生物以摩爾比1 1混勻，鋁箔封好后于20_25°C 振蕩反應20h，加NEM封閉多余巰基，室溫旋轉反應60min，HPLC純化，收集交聯物洗脫峰， 熒光分光光度計上檢測交聯物的室溫熒光發射光譜，微量血凝抑制法測定交聯物的抗體效 價，檢測合格加0. 02%疊氮化鈉4°C保存。
5.一種檢測新城疫病毒的固相免疫熒光檢測試劑盒，其中包括權利要求1制備的RPE 標記的抗新城疫病毒熒光抗體及溴化氰活化的瓊脂糖微球載體、抗新城疫病毒多克隆抗 體、洗滌液、、稀鹽酸等，本發明的試劑盒檢測靈敏度高，可用于新城疫病毒的快速免疫熒光 檢測。
6.根據權利要求5的方法，其中固相載體為微球載體，由瓊脂糖經溴化氰活化制備，直 徑60-200um，凍干粉，購自Amersia公司，使用前用稀鹽酸溶液溶脹處理，溶脹處理步驟為 取0. 3g溴化氰活化的瓊脂糖凝膠凍干粉，置于ImM鹽酸中溶漲30min，以同樣濃度的稀鹽酸溶液沖洗多次，用50mM pH 8PBS (含IOOmM NaCl)快速沖洗得到ImL活化凝膠，活化凝膠應 立即與抗體或抗原結合。
7.根據權利要求5的方法，其中固相免疫熒光檢測試劑盒的使用方法包括取ImL活 化凝膠立即與2mL濃度為5mg/ml的抗新城疫病毒抗體混勻，20°C緩慢振蕩作用12h，加入 2mL 0. IM的乙醇胺封閉，20°C緩慢振蕩作用4h，離心去上清，用50mM pH 8PBS反復沖洗凝 膠，離心獲得偶聯有抗新城疫病毒抗體的瓊脂糖凝膠，用IOOmM pH 7. 5的PBS配成10% (ν/ ν)的懸浮液，取偶聯有抗新城疫病毒抗體的瓊脂糖凝膠50uL，置于潔凈的試管中，加待檢 新城疫病毒液lOOuL，37°C溫育2h，用IOOmM pH 7. 5的PBS沖洗10次。加入5ug/ml的熒光 標記抗體lOOuL，37°C溫育2h，用IOOmM pH 7. 5的PBS沖洗5次。吸取少量微球，滴于低熒 光背景的玻片上，蓋片，甘油緩沖液封片，熒光顯微鏡下以藍綠光激發，觀察、判定結果。陽 性微球在藍綠光激發下發射明亮的桔黃色熒光，陰性微球無熒光。
全文摘要
本發明涉及一種檢測新城疫病毒的熒光抗體的制備方法及固相免疫熒光檢測試劑盒。用交聯劑SPDP分別將R-藻紅蛋白(RPE)、抗新城疫病毒(NDV)抗體衍生，衍生物以適宜摩爾比交聯，經HPLC純化制備RPE標記的抗NDV熒光抗體。熒光抗體與抗NDV抗體、瓊脂糖微球、稀鹽酸、洗滌液組成固相免疫熒光檢測試劑盒。試劑盒的檢測流程為微球溶脹活化后用抗體包被，洗滌后與待測樣品結合，洗滌后再與熒光抗體結合，充分洗滌后熒光顯微鏡下藍綠光激發，觀察、判定結果。本發明制備的熒光抗體得率高、純度高、熒光呈明亮的桔黃色、穩定性好；試劑盒采用球形載體具有信號富集作用，能提高檢測靈敏度。本發明適于新城疫病毒的快速檢測。
文檔編號C07K16/06GK101975856SQ20101028433
公開日2011年2月16日 申請日期2010年9月17日 優先權日2010年9月17日
發明者呂愛杰, 朱麗萍, 顏世敢, 顏士勇 申請人:顏世敢